摘要
民族药理学相关性：三叶青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg，简称T. hemsleyanum）是一种分布于中国亚热带地区的珍稀药用植物，近年来因其高传统价值而备受科学界关注，其传统用途包括治疗儿童发热、肺炎、哮喘、风湿病、肝炎、月经不调、瘰疬及咽痛等。
目的：本系统综述旨在深入探讨三叶青的传统用途、化学成分、药理效应及临床应用，为三叶青资源的进一步研究和利用奠定基础。
材料与方法：通过国内外知名数据库，使用相关关键词检索已发表的文章。
结果：已从三叶青中鉴定出142种化学成分，包括黄酮类、酚酸类、多糖、有机酸、脂肪酸、萜类、甾体类、氨基酸等。其中，黄酮类和多糖是三叶青的代表性活性成分，已得到广泛研究。现代药理学研究表明，这些成分展现出多种药理活性，如抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、解热、抗肝损伤、免疫调节、抗菌等。此外，不同的毒理学研究表明，三叶青的临床剂量是安全可靠的。
结论：现代药理学研究很好地支持并阐明了一些传统用途，且三叶青因其卓越的药理特性，在开发新药方面具有良好的前景。然而，目前的研究并未对提取物的生物活性进行深入评估，其活性提取物的成分也不明确。此外，这些研究还不足以充分解释某些作用机制。关于三叶青的许多方面，如传统用途与生物活性之间的联系、药代动力学、质量控制标准及活性成分的临床价值等数据仍然有限，需要更多关注。
1. 引言
三叶青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg，简称T. hemsleyanum），俗称“三叶青”，是一种民间药用植物。由于其生长缓慢，通常需要3-5年才能满足商业药材的要求，因此它是一种珍贵的多年生药用资源。它主要生长在中国东、中、南和西南部省份，如浙江、江苏、广西、福建和云南（Peng和Wang，2018）。三叶青在全球范围内被视为植物治疗药物的来源，已被用于治疗与炎症和免疫反应相关的疾病，并基于临床试验或动物模型的使用进行了记录（Xu，2006）。作为一种可食用植物，三叶青的叶子因其健康益处而被作为功能性茶或膳食补充剂食用，如增强人体免疫系统（Sun等，2013），而三叶青的地上部分则被开发为潜在的新型中药（TCM）制剂（Guo等，2019）。三叶青的根状茎在中医诊所中广泛单独使用或与其他草药联合使用，用于治疗儿童发热、惊厥、肺炎、哮喘、风湿病、肝炎、月经不调、瘰疬及咽痛（Sun等，2015；Chen和Guo，2012）。因此，根据其广泛的杀菌和抗炎活性，三叶青被称为“天然植物抗生素”。2018年2月，三叶青被授予浙江省新的“八大名中药”称号，意味着它已成为浙江省优势中药材品种产业化发展的重点对象。
2019年，新冠肺炎疫情爆发，在中国造成超过4600人死亡，并在200多个国家报告了感染病例。主要由三叶青组成的化湿宣肺合剂（浙江省药品批准文号：Z20200026000）已获得浙江省药品监督管理局批准，用于新冠肺炎的临床治疗。此外，现代药理学研究表明，三叶青还具有抗炎（Ji等，2019）、抗氧化（Hossain等，2011）、抗病毒（Ding等，2019）、抗肿瘤（Lin等，2014）、解热（Yang和Wang，2014）、抗肝损伤（Ma等，2012）、免疫调节（Xu等，2008）、抗菌（Chen等，2019）、降血糖（Ru等，2018a，b）等作用。大量报告表明，三叶青的生物活性归因于其多种化学成分（Fu等，2019）。Wang等已从三叶青的地上部分分离出生物碱（Wang等，2018）。Ru等采用酶解-超声辅助提取法从三叶青中提取出一种分子量为3.31×10^5 Da的新型多糖TDGP-3（Ru等，2019a，b）。在三叶青的叶子、地上部分和根状茎中发现了大量黄酮类化合物（Xu等，2014a，b；Deng等，2018；Yu等，2016）。此外，三叶青还含有多种功能性成分，如有机酸（Hu等，2013）、酚酸（Liu，2000）、矿物质（Fan等，2017）、氨基酸（Fu等，2015）等。
近年来，由于三叶青的多重药用价值以及生长环境的严格要求，其野生资源已被过度开发，现正濒临灭绝。2011年，三叶青被列入浙江省优先保护的作物种质资源。基于我们团队的初步研究（Peng等，2013，2015，2016，2019；Peng等，2016a，b；Li等，2019），我们全面总结并分析了国内外关于三叶青传统用途、生物活性成分、药理活性及毒理学的研究进展，旨在为深入研究提供指导，并为其开发和利用提供参考。
2. 材料与方法
通过Web of Science、Google Scholar、PubMed、Science Direct、中国知网（CNKI）和Springer等数据库，使用中文或英文作为检索语言，搜索关于三叶青传统用途、植物化学成分和药理特性的可用信息。使用的关键词包括T. hemsleyanum、三叶青根状茎、Radix Tetrastigma、传统用途、植物化学、生物活性成分、药理活性、毒理学及其他相关词汇。所有参考文献均来自实验研究，且发表于2020年4月之前。所有化学结构均使用ChemDraw Pro 7.0软件绘制。
3. 植物学特征
三叶青是一种多年生草质攀援藤本植物，具有纵肋，无毛或稀疏柔毛。它通常生长在凉爽潮湿的环境中，主要土壤类型为黄壤或黄棕壤，腐殖质丰富。最适pH值在4.29至7.65之间。根状茎粗壮，纺锤形或椭圆形，单个或多个相连成串珠状，一般长1.5-3厘米，直径0.7-1.5厘米（图1）。根状茎表皮呈棕褐色，多数光滑，少数有褶皱和皮孔状突起，部分有凹陷，其中有残留的棕褐色根，坚硬易碎，断面平坦粗糙。三叶青的茎细弱，有纵菱形，下节生根。掌状复叶互生，小叶为披针形、长圆形或卵状披针形。小叶长3-10厘米，宽1.5-3厘米，先端渐尖，基部楔形或圆形。三叶青的花小，黄绿色，卵形。花期为4月至6月，果期通常为8月至11月。花谢后，会形成小米大小的绿色小圆果。成熟时，果实由绿色变为红色，浆果呈球形或软球形。
4. 传统用途
三叶青属于葡萄科植物，最早记载于《本草纲目》（明朝，公元1590年）。三叶青的别名包括石猴子、石抱子、石老鼠、蓝山虎、雷弹子、破石珠、土经丸、搜夹风、三叶对、金线吊葫芦、金铃、金线吊土豆等。三叶青的根状茎或全草长期以来一直被传统和民族医学用作药物，这在多部中医古籍中均有记载，如《植物名实图考》（清朝，吴，2014）、《江西草药》、《浙江民间常用草药》等。这些古籍均描述了三叶青具有清热、解毒、平喘、活血化瘀、止痛等功效，因此可用于治疗发热惊厥、肺炎、支气管炎、咽炎、喉痛、急慢性肝炎、风湿痹痛、病毒性脑膜炎、瘀伤、湿疹、虫蛇咬伤、关节屈伸不利、妇女月经不调（国家中药材编纂组，1975）。在中医文化中，三叶青的性质被描述为味苦、辛，性凉，这在中医词典和《中华本草》（上海科学技术出版社，1999）中均有记载。其归经为肺、心、肝、肾经。
水煎或捣烂外敷是三叶青的传统使用方法。考虑到其广泛的传统功效，许多含有三叶青的处方已代代相传，并得到了现代药理学研究的充分支持和阐明。令人兴奋的是，有报道称含有三叶青的金莲消毒饮与干扰素联合使用可治疗新冠肺炎（He等，2020）。金芪片由三叶青、黄芪和人参皂苷组成，用于治疗120例恶性肿瘤患者，其中52例完全缓解，42例部分缓解，总有效率为78.33%（Wei等，2007）。此外，中肝合剂包含三叶青，可改善III期原发性肝癌患者的生活质量并延长其生存时间（Jiang和Gong，2005）。此外，三叶青还用于治疗常见的妇科疾病，如崩漏和带下（Gao，2004），且对麻疹合并肺炎、肛裂、慢性支气管炎及蚊虫叮咬也有良好疗效（Ji，2010）。
5. 三叶青的化学成分
三叶青的化学成分已得到广泛研究（Sun，2018；Sun等，2018；Zeng等，2017；Xu等，2014a，b；Fu等，2015；Fan等，2016；Chen，2014；Ding等，2015a，b；Ding等，2015），迄今为止已从三叶青中分离并鉴定出142种化合物。化合物名称、分子量、分子式、检测方法及分析样品的信息汇总于表1。
5.1. 黄酮类及其苷类
现代植物化学研究表明，黄酮类是三叶青中分离出的代表性且含量丰富的成分（Lin等，2016；Zhang等，2016）（表2）。迄今为止，已从三叶青中提取并鉴定出51种黄酮类及其苷类化合物。在这一系列化合物中，槲皮素（1）、异槲皮苷（8）、牡荆素（13）、异鼠李素（20）、芹菜素（23）和山柰酚（36）是主要的骨架类型，其中一些类似物可在黄酮苷元B环的C3’和C4’位上被羟基取代。目前，许多现代分析技术已被用于黄酮类的定性和定量分析。其中，超高效液相色谱-串联三重四极杆飞行时间质谱（UPLC-ESI-Q-TOF-MS）因其更高的质量准确度和分辨率，已成为鉴定复杂化合物的有力工具。我们团队使用UPLC-ESI-Q-TOF-MS从三叶青的地上部分鉴定出31种化学成分，其中包括22种黄酮类化合物，如异槲皮苷（10）、槲皮素（1）、山柰酚（36）、牡荆素（13）、异牡荆素（17）、山柰酚-3-葡萄糖苷（37）等（Sun等，2018）。据报道（Liu等，2015），三叶青总黄酮可通过抑制肺组织中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）的磷酸化来保护老年小鼠免受急性肺损伤。此外，三叶青的黄酮类化合物还具有抗肺癌活性（Wei等，2018）。木犀草素（30）是三叶青中发现的一种黄酮类化合物，可作为抗癌剂对抗多种人类恶性肿瘤，如肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、结肠癌和胰腺癌（Muhammad等，2019）。可以肯定的是，三叶青黄酮类化合物为研究人员探索临床抗癌药物提供了新的视角。
5.2. 多糖
多糖是从三叶青中提取出的另一种重要活性成分（Shao等，2011）。多糖因其独特的药理活性而在临床应用中具有巨大潜力。然而，由于多糖结构的复杂性，其结构的确定和合成既困难又特殊。Guo（2018）从三叶青的根中提取出了多糖RTP-1、RTP-2和RTP-3，这些多糖是通过蛋白质沉淀和纯化依次发现的。此外，进一步研究表明，RTP-3-1是一种高纯度多糖，分子量为1244.2 kDa，主要由四种单糖组成：阿拉伯糖、半乳糖醛酸、半乳糖和果糖，比例分别为8.39%、7.18%、20.70%和63.70%。Ru等（2018a，b）从三叶青中提取出一种多糖THP，其平均分子量估计为93.307 kDa。对多糖成分的研究结果表明，它主要由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比为0.07:0.14:0.38:0.21:0.31。2019年，Ru等（2019a，b）成功从三叶青中提取出分子量为77.98 kDa的多糖THDP-3，该多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比为1.0:1.3:2.5:2.3:3.1。此外，TDGP-3主要由→4)-α-D-GalAp-(1→、→4)-β-D-Galp-(1→和→4)-α-D-Glcp-(1→残基作为主链，以及β-D-Manp-(1→、→3,6-β-D-Manp-1→和α-D-Araf-(1→残基作为支链组成。
5.3. 酚酸类
酚酸类是指在一个苯环上被多个酚基取代的芳香羧酸。作为一种次生代谢物，酚酸类广泛存在于许多天然植物中，具有抗炎、抗氧化和降血脂作用。已在三叶青的地上部分报道了23种酚酸类化合物（编号52-84，表1），如咖啡酸（54）、绿原酸（67）、1-O-没食子酰-β-D-葡萄糖（75）、原儿茶酸葡萄糖苷（76）、表没食子儿茶素（77）、1-咖啡酰奎宁酸（56）、3-咖啡酰奎宁酸（57）、4-咖啡酰奎宁酸（58）、5-咖啡酰奎宁酸（59）、1-对香豆酰奎宁酸（60）、4-对香豆酰奎宁酸（61）和5-对香豆酰奎宁酸（62）。在三叶青的根状茎中发现了21种酚酸类化合物，其中一些与地上部分相同。
5.4. 生物碱
生物碱是一类存在于自然界中，含有氮的基本有机化合物。三叶青（T. hemsleyanum）中生物碱含量较少，且关于这些生物碱生物活性的研究仍较为匮乏。王（傅等，2019）采用90%乙醇提取三叶青地上部分，首次分离得到10种生物碱，包括7种吲哚类生物碱、1种酰胺类、1种马来酰亚胺类和1种咔啉类。通过与已知化合物的光谱数据进行比对，这些生物碱分别被鉴定为吲哚（85）、吲哚-3-羧酸（86）、吲哚-3-丙酸（87）、5-羟基吲哚-3-甲醛（88）、5-羟基吲哚-3-羧酸（89）、6-羟基-3,4-二氢-1-氧代-β-咔啉（90）、海姆斯酰胺（91）、4-羟基肉桂酰胺（92）、吡咯-3-丙酸（93）和S-(-)-托品碱（94）。其化学结构如图2所示。
5.5. 有机酸及其衍生物
三叶青中也分离并鉴定出了具有重要生物活性的有机酸。从三叶青的地上部分和根茎中鉴定出10种有机酸和17种脂肪酸，其中大部分存在于地上部分，硬脂酸（97）、丙酸（121）和二羟基十八碳烯酸（102）除外。所有有机酸和脂肪酸分别列于表1的No.112–121和No.95–111中。
5.6. 萜类和甾体类
萜类和甾体类是三叶青的另外两类次生代谢产物，目前已分离并鉴定出13种此类化合物（表1，No.122–134）。刘（杨等，1998；刘等，2000）从三叶青地上部分分离并鉴定出α-香树脂醇（130）、β-谷甾醇（122）、麦角甾醇（127）、塔拉萨酮（128）和塔拉沙醇（129）。此外，胡萝卜苷（123）、菜油甾醇（124）、豆甾醇（125）、6-O-苯甲酰基胡萝卜苷（126）、pteroside Z（131）、灵芝酸H（132）、3-表-纸叶榕酸（133）和齐墩果酸（134）也相继从三叶青根茎中分离得到（刘和杨，1999）。
5.7. 无机元素
中药中的矿物元素是生物活性成分不可或缺的补充，与中药的疗效、毒性和副作用密切相关。吴（吴等，2018）的研究表明，三叶青含有27种不同的矿物元素，分别为锂（Li）、铍（Be）、钠（Na）、镁（Mg）、铝（Al）、钾（K）、钙（Ca）、钒（V）、铬（Cr）、锰（Mn）、铁（Fe）、钴（Co）、镍（Ni）、铜（Cu）、锌（Zn）、镓（Ga）、砷（As）、硒（Se）、铷（Rb）、银（Ag）、镉（Cd）、铯（Cs）、钡（Ba）、汞（Hg）、钛（Ti）、铅（Pb）、铀（U）。此外，钙（Ca）、铜（Cu）、镍（Ni）、钡（Ba）、铝（Al）、钾（K）的含量较高，是三叶青的特征元素。王（王等，2017）的研究表明，在不同环境下栽培的三叶青三个种群中，铁（Fe）、锰（Mn）、锌（Zn）和铜（Cu）的含量分别为323.1–346.6、36.3–38.1、23.0–25.1、3.8–4.1 mg/kg。
5.8. 其他化合物
除上述七类化合物外，三叶青中还报道了氨基酸衍生物，如苯丙氨酸、焦谷氨酸、谷氨酰胺己糖、色氨酸和L-谷氨酸。
6. 药理学
三叶青在民族医药中的应用激发了对其多种药理学研究。三叶青的提取物和分离得到的化合物表现出多种生物活性，如抗病毒、抗菌、抗氧化、解热、镇痛、保肝、免疫调节和抗肿瘤活性。三叶青的详细药理活性如表3所示，总结如下。
6.1. 抗病毒活性
根据杨等（1989）的研究，三叶青的含氮碱提取物（A）、含酮提取物（F）、粗提物（S1）和粗提物（S2）对感染日本血凝病毒（HVJ）、流感病毒PR6和水疱性口炎病毒（VSV）的小鼠和鸡胚成纤维细胞（CEF）具有不同的抗病毒效果。具体而言，S2在0.5 mg/mL浓度下对流感病毒PR6的增殖有强烈抑制作用，0.5 mg/mL的S1对HVJ有明显的抗病毒效果。在10 mg/mL和1 mg/mL浓度下，F和S1均对VSV的空斑形成有强烈抑制作用。在体内实验中，A、F、S1、S2均表现出不同程度的抗病毒活性。当A的浓度为0.1 g/kg时，保护率高达50%，S1（0.2 g/kg）的保护率为20%。然而，作者未给出样品制备方法。丁等（2019）的研究表明，从三叶青中分离得到的槲皮素-3-O-芸香糖苷（4）、山柰酚（36）、山柰酚-3-葡萄糖苷（37）、槲皮苷（2）、槲皮素（1）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（38）、原花青素二聚体（48）和表儿茶素（34）与三叶青对H1N1流感病毒的活性呈正相关。三叶青的乙酸乙酯提取物可显著抑制HBV释放的HBsAg和HBeAg，IC50值为1.3–48.6 mg/L。然而，其具体作用机制尚需进一步证实（杨和吴，2009）。王的研究表明，三叶青的正丁醇和乙酸乙酯提取物对呼吸道合胞病毒（RSV）具有抗病毒活性，且优于利巴韦林，EC50值为0.008 mg/L（王等，2019）。此外，三叶青提取物对不同HIV-1毒株具有不同程度的抑制作用，EC50值在3.54 μg/mL至78.56 μg/mL之间，治疗指数值在2.03至43.18之间。三叶青提取物阻断HIV-1慢性感染细胞与正常淋巴细胞C8166细胞融合的EC50值为14.79 μg/mL，抑制重组HIV-1逆转录酶的EC50值为170.15 μg/mL（董和李，2016）。尽管这些研究表明三叶青可用于治疗不同病毒，但其机制鲜有报道。
6.2. 抗菌活性
三叶青用于治疗咽喉肿痛、疮疡、肺炎和发热等疾病，这些疾病大多与微生物入侵有关。熊（2015）采用金黄色葡萄球菌LMA1213、枯草芽孢杆菌LMA0106、大肠杆菌LMA1226、伤寒沙门氏菌LMA0217、肺炎克雷伯菌LMA0725、米根霉LMA3221、桔青霉LMA7126、黄曲霉LMA0816、黑曲霉LMA3601和黑根霉LMA2429作为测试菌种，采用牛津杯法和肉汤微稀释法评估了三叶青乙醇提取物的抑菌直径和最低抑菌浓度（MIC）。结果表明，三叶青对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的抑菌活性最强，MIC值均为62.5 μg/mL。三叶青乙醇提取物的乙酸乙酯提取物（EAF）对大肠杆菌、伤寒沙门氏菌和肺炎克雷伯菌的抑菌活性最强，MIC值在125 μg/mL至250 μg/mL之间。同时，三叶青乙醇提取物的氯仿提取物（CFF）对桔青霉、黄曲霉、黑曲霉和黑根霉表现出显著活性，MIC值在31.3 μg/mL至125 μg/mL之间。陈（陈等，2019）的研究表明，三叶青多糖的抗菌机制是通过干扰糖酵解和糖异生来抑制大肠杆菌的增殖。
6.3. 抗氧化活性
抗氧化活性是天然产物进一步开发的重要价值。根据研究（孙等，2013），三叶青叶片的80%甲醇提取物具有最高的DPPH自由基清除活性，值为3.32 mmol Trolox/g DW，在ABTS自由基清除活性实验中也得到了类似结果（1.38 mmol Trolox/g DW）。在铁还原能力测定中，三叶青叶片的80%甲醇提取物具有最高值（1.85 mmol FeSO4/g DW）。此外，酚类含量与抗氧化活性之间的关系研究结果表明，三叶青叶片提取物中的酚类物质是抗氧化活性的主要贡献者。在傅的研究（傅等，2015）中，发现三叶青中的槲皮素（1）、表没食子儿茶素（77）、原花青素B1（49）、原花青素B2（50）、原儿茶醛（70）和槲皮素-3-O-葡萄糖苷（3）的抗氧化活性优于维生素C，且抗氧化能力与总黄酮和总多酚的含量相关。文献（徐等，2015；叶和刘，2015）也证实了这一点，表明总黄酮和总酚可能是抗氧化活性的物质基础。孙（孙等，2017）通过D-半乳糖建立了氧化应激大鼠模型，发现三叶青处理后大鼠的总抗氧化能力、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）过氧化物酶活性均增加。同时，血浆和组织中的GSH含量增加，丙二醛（MDA）含量降低。有趣的是，楚（楚等，2019，2020）从三叶青中分离出一种纯化的多糖，药理实验结果表明，该多糖可通过Nrf2-Keap1和Sirt1-FoxO1途径改善RAW264.7细胞的氧化损伤。基于上述发现，三叶青的抗氧化活性具有多成分、多靶点和多途径的特点。
6.4. 解热和镇痛活性
在民间，三叶青广泛用于治疗小儿高热惊厥，这一用途也得到了大鼠啤酒酵母或2,4-二硝基苯酚诱导的高热实验的证实（黄等，2005）。更具体地说，三叶青提取物处理后的大鼠体温显著下降，下丘脑中的5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）和多巴胺（DA）也显著减少（杨和王，2014）。此外，从三叶青地上部分分离出的平均分子量为66.2 kDa的纯化多糖可显著抑制小鼠血清中前列腺素E2（PGE2）的水平（朱等，2020）。通过醋酸或缩宫素诱导的小鼠扭体反应和热板实验研究了三叶青的镇痛活性，结果表明，三叶青可剂量依赖性地减少腹部扭体次数，提高热板实验中的痛阈（王，2017）。三叶青可降低离体小鼠子宫的张力，减少缩宫素诱导的小鼠模型的扭体次数（吕等，2011）。进一步的研究结果表明，三叶青地上部分也具有镇痛活性，具体表现为：延长痛阈提高率，最大镇痛率延长65.58%；抑制醋酸诱导的小鼠扭体疼痛，延长小鼠扭体潜伏期，减轻扭体反应，最大抑制率为51.80%（廖等，2017）。然而，其生物活性成分和作用机制尚未见文献报道。
6.5. 抗炎活性
炎症已被报道对多种疾病产生负面影响。与传统用途一致，三叶青表现出抗炎活性，其调节机制与包括NF-κB和MAPK在内的靶分子密切相关（刘等，2015）。从三叶青中分离出的平均分子量为478.33 kDa的纯化多糖可通过抑制MAPKs的磷酸化，下调RAW264.7细胞中COX-2和iNOS的表达，减轻脂多糖（LPS）诱导的炎症。此外，该纯化多糖还改善了秀丽隐杆线虫（C. elegans）的生长发育和运动能力，提高了其清除ROS、O2−的能力，恢复了GSH水平，对抗LPS诱导的炎症（楚等，2019，2020）。刘（刘等，2016）发现，三叶青可减少LPS诱导的RAW264.7细胞中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素12亚基p40（IL-12p40）、可溶性TNF受体1（sTNF-R1）的产生，并增加抗炎细胞因子白细胞介素10（IL-10）的表达，这与其它研究（王，2016；黄，2017）一致。同时，三叶青剂量依赖性地抑制诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和NO的产生，减弱LPS诱导的Toll样受体4（TLR4）、髓样分化因子-2（MD-2）、髓样分化蛋白88（MyD88）和TLR4/MD-2复合物的上调表达。随着TLR4/MD-2的变化，c-Jun N-末端激酶（JNK）和NF-κB的磷酸化和活性也同时发生改变。这些数据表明，三叶青可能通过TLR4/MD-2介导的NF-κB和JNK途径，有助于减轻LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应。此外，我们之前的研究表明，三叶青总黄酮（1、2和4 g/kg）和阳性对照药物联苯双酯（200 mg/kg）可通过调节Treg/Th17免疫稳态，改善自身免疫性肝炎小鼠的炎症反应（季等，2019）。
6.6. 保肝活性
先前的研究表明，三叶青对多种类型的肝损伤具有保护作用。三叶青水煎剂（1.6 g/mL和0.16 g/mL）通过降低谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）、碱性磷酸酶（ALP）和MDA的含量，同时提高SOD的活性，缓解了四氯化碳（CCl4）引起的肝损伤（吴等，2006）。此外，三叶青的水提取物和总氨基酸可显著降低丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）的活性、肝脏指数和肝脏中MDA的含量，增加肝脏中SOD的活性，且三叶青对肝损伤的保护作用优于联苯双酯。此外，肝组织病理变化表明，它们可减轻肝细胞的坏死、炎症细胞的变性和浸润程度（钟等，2006a，b；黄和毛，2007）。此外，三叶青提取物对α-异硫氰酸酯诱导的小鼠肝损伤具有保护作用，这与减少炎症因子、促进总胆红素代谢和减轻脂质过氧化有关（李等，2018）。对于慢性肝损伤，张（张和倪，2008）观察到，三叶青提取物降低了ALT、AST、透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）和总胆红素（T-BiLi）的水平，抑制了总蛋白（TP）和白蛋白的含量，提高了白蛋白/球蛋白比值和CCl4诱导的慢性肝损伤大鼠的存活率（图3）。对于卡介苗疫苗和LPS诱导的免疫性肝损伤小鼠，三叶青（20、30、40 g/kg）也可在不同程度上调节上述因素的变化（杨，2008）。不幸的是，目前尚未报道三叶青中对抗肝损伤的生物活性成分。
6.7. 免疫调节活性
人们认为，机体应对疾病的能力不仅取决于T和B淋巴细胞对特定抗原的适应性免疫反应，还取决于天然免疫反应。一旦免疫系统失调，将导致器官组织的病理变化。徐（徐等，2008）报道，三叶青的乙酸乙酯部分在1.82 mg/mL、5.48 mg/mL和9.12 mg/mL剂量下可增强T和B淋巴细胞的增殖和抗体活性，影响迟发型超敏反应和单核-巨噬细胞吞噬作用，并在9.12 mg/mL剂量下增加血清干扰素-γ（IFN-γ）和血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的产生，这与丁的研究结果一致（丁等，2008）。三叶青提取物（1.2、2.4、4.8 g/kg）可拮抗烫伤大鼠血清免疫球蛋白A（IgA）含量和回肠粘液分泌型免疫球蛋白A（S-IgA）含量的减少、脾脏淋巴细胞增殖、自然杀伤细胞活性的降低，以及肠道粘液中MDA含量和血清IL-6水平的增加（钟等，2006a，b）。此外，有报道称，三叶青还可增加白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-4（IL-4）的水平和免疫器官指数（图4）（陈和李，2015）。由于提取物成分复杂，三叶青的免疫调节机制尚需进一步研究。
6.8. 抗肿瘤活性
近年来，三叶青（T. hemsleyanum）已广泛用于肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、食管癌、胰腺癌、淋巴瘤和脑肿瘤的预防与治疗（Chu 等，2019，2020）。它具有多靶点、多途径、协同作用、无毒等特点，对于开发新型抗肿瘤药物具有重要价值。尽管其作用机制尚未完全阐明，但它的抗肿瘤效应可能是通过抑制肿瘤细胞增殖与迁移、诱导细胞凋亡以及增强免疫功能来实现的。
6.8.1. 抑制肿瘤细胞增殖与迁移
细胞周期调控异常是肿瘤发生的重要原因。细胞周期蛋白 D1（CyclinD1）是 G1 期的关键调控蛋白，G1 期紊乱会导致肿瘤发生。原癌基因 c-myc 是一种核蛋白调控基因，Lgr5 是一种干细胞标志物，二者在多种肿瘤中均高表达。
上皮 – 间质转化（EMT）的特征是上皮蛋白（如 E-钙黏蛋白）表达减少，波形蛋白（vimentin）表达增加。EMT 与恶性肿瘤的迁移和侵袭密切相关，同时伴随着基质金属蛋白酶（MMPs）和组织基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）活性的变化。根据相关研究（Xia 等，2018；Zhang 等，2017a，b；Ni 等，2009；Zhong 和 Wei，2014；Zhong 等，2016；Zhong 等，2017；Yu 等，2016；Yu，2016；Wang 等，2017；Wang 等，2014；Jiang 和 Xu，2015；Xu 等，2011；Xu 等，2010；Yan 等，2013a，b；Yan 等，2013a，b），三叶青的有效成分一方面可抑制 Lgr5、CyclinD1 和 c-myc 的表达，使细胞周期阻滞于 G0/G1 期，减少肿瘤细胞从 G1 期向 S 期的转变，进而使细胞周期在 S 期和 G2/M 期被阻断，从而抑制肿瘤细胞的有丝分裂过程和细胞增殖（图 5）。另一方面，这些成分可降低 E-钙黏蛋白、波形蛋白、基质金属蛋白酶 -2（MMP-2）和基质金属蛋白酶 -9（MMP-9）的表达，增加组织基质金属蛋白酶抑制剂 -2（TIMP-2）的表达，抑制 Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）通路和 Notch 通路的活性，进而抑制肿瘤的迁移和侵袭。
6.8.2. 诱导肿瘤细胞凋亡
细胞凋亡是在特定时间和空间内发生的细胞自杀现象，受多种细胞信号通路（如线粒体凋亡通路和死亡受体凋亡通路）的严格调控。Bcl-2 蛋白酶家族是线粒体凋亡通路中的关键蛋白，可分为两类：促凋亡蛋白（如 Bax 和 Bid）和抗凋亡蛋白（如 Bcl-2）（图 6）。在凋亡信号的作用下，细胞色素 c（Cyt-c）和凋亡诱导因子被释放。Cyt-c 与凋亡激活因子（如 caspase-8、caspase-9 和 caspase-10）结合，可激活下游的凋亡执行酶（如 caspase-3 和 caspase-6），最终导致细胞凋亡。此外，活性氧（ROS）可产生多种自由基，引发细胞应激反应并触发细胞凋亡。然而，多种抗氧化酶（如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px））可清除过量的 ROS。如表 4 所示，三叶青可降低线粒体膜电位，增加细胞内 Ca²⁺浓度，下调 Bcl-2 蛋白的表达，促进肿瘤细胞中 Bax 和 Cyt-C 蛋白的表达，从而激活线粒体凋亡诱导通路。另一方面，它可激活 caspase 蛋白酶家族的表达，进而诱导细胞凋亡（Peng 等，2016a，b；Sun 等，2018；Chen 等，2018；Xiong 等，2015；Peng，2016；Liu 和 Xia，2010；Li 和 Wei，2012；Ding 等，2017；Lin 等，2016；Li 和 Peng，2014；Wang 和 Peng，2015；Zeng 等，2012；Zeng 等，2013；Zhong 等，2014；Zhang 等，2017a，b；Zhang 等，2010；Wu 等，2016）。此外，三叶青可降低 SOD、CAT 和 GSH-Px 的活性，增加丙二醛（MDA）的水平，增强肿瘤细胞的氧化应激反应，从而加速细胞凋亡的发生（Xiong，2015）。
6.8.3. 增强免疫功能
大量研究表明，促进机体免疫力在癌症的发生发展和治疗过程中起着关键作用（Neil 等，2008；Hinrichs 和 Rosenberg，2014）。调节性 T 细胞（Tregs）在免疫应答的调控中具有重要功能（图 7）。Tregs 可表达 CD4、CD25 和叉头框蛋白 P3（Foxp3），这些分子与实体瘤相关。Tregs 对其他 CD4⁺T 细胞和细胞毒性 CD4⁺T 细胞的抑制作用依赖于细胞间通讯以及抑制性细胞因子（如转化生长因子 -β（TGF-β））的分泌。TGF-β 可诱导环氧化酶 2（COX2）的表达，而 COX2 过表达会分泌高水平的前列腺素 E2（PGE2）。PGE2 可显著上调 CD4⁺和 CD25⁺T 细胞中 Tregs 特异性转录因子叉头/翼状螺旋转录因子基因（Foxp3）的表达。因此，Tregs 的诱导、维持和功能与 COX2-PGE2 通路密切相关。众多研究表明，三叶青可降低 PGE2、COX2 和 TGF-β 的表达，下调 CD4⁺、CD25⁺、Foxp3⁺T 细胞和 Tregs 的比例，从而改善肿瘤患者或动物的免疫抑制状态，增强机体的免疫功能，达到抗肿瘤的效果（Feng 等，2014a，b，c；Feng 等，2014；Zhang 和 Feng，2017a，b；Hu 等，2018；Zhang 和 Feng，2017，2017；Li 等，2012；Guo 等，2019；Feng 等，2014）。
7. 毒理学
人们对三叶青（T. hemsleyanum）的毒理学研究给予了越来越多的关注。蒋氏根据民间临床用药剂量（15 g/人/天）对三叶青块根煎剂进行了毒理学评价，结果显示，大鼠和小鼠的口服半数致死量（LD₅₀）分别大于 100 g/kg 和 40 g/kg（Jiang 和 Guo，2005）。此外，连续 30 天每日给小鼠喂食 6.25、12.5 和 25.0 g/kg 剂量的三叶青块根，未出现死亡和毒性反应，这表明长期使用三叶青块根是安全无毒的（Jiang 和 Xu，2005）。
对三叶青地上部分的粗提物进行急性毒性试验表明，小鼠经口灌胃给药的最大耐受剂量可高达 80.4 g/kg/d，相当于 60 kg 体重人体日剂量的 321.6%。在 14 天的观察期内，未发现毒性反应、动物死亡，以及血液和生化指标、脏器系数和脏器病理等方面的异常变化（Chen 等，2017）。此外，还有研究表明，三叶青地上部分配方颗粒的口服毒性较小，灌胃最大耐受剂量大于 30.4 g/kg/d，临床用量安全可靠（Xie 等，2019）。
8. 结论与展望
三叶青是一种优良的药用植物，含有多种生物活性成分，这些成分与其传统应用（如抗高热惊厥、抗肺炎、抗肝炎、抗上呼吸道感染、抗哮喘、抗外伤、抗肿瘤）相关。目前针对三叶青化合物和粗提物的药理学研究表明，三叶青具有广泛的生物学效应，为其传统用途提供了基本依据。尽管本综述全面总结了关于三叶青的植物学、传统与民族植物学用途、植物化学、药理学和毒理学等方面的知识，但仍存在一些空白，有待科学评估和探索。
首先，目前大量研究聚焦于验证传统药理活性，但缺乏对所评估提取物的植物化学分析，功能成分也未知。众所周知，中药通常含有极其复杂的植物化学成分，不同药用部位所含化学成分种类不同。不同植物化学成分谱的草药在生物学评估中可能表现出不同的效力，不同成分的协同作用也可能影响其药理活性。因此，植物化学分析对于确定成分与药理活性之间的相关性至关重要，目的是发现具有临床药物开发潜力的前体物质。此外，缺乏样品制备方法，或对中药不同部位使用不准确，可能导致所报道药理效应的可重复性较低。而且，一些研究未对三叶青进行鉴定，也未报告凭证标本编号，因此无法验证凭证标本的分类有效性。一些研究未提及三叶青的鉴定方法以及详细信息（包括产地、采集日期、发育阶段、植物或植物部位、采集者等）。
其次，目前一些研究结果在药理学方法和实验设计方面存在问题。三叶青药理活性研究中采用的一些方法缺乏适当的设计，例如没有设置阳性对照组，这使得结果可靠性降低。此外，很少有体外研究提及所用细胞系的传代次数和群体倍增时间（PDL）。对于动物模型试验，很少有研究描述关于遵守实验动物伦理处理规定的完整数据，包括批准实验设计的机构委员会或组织。此外，上述一些药理学研究仅使用简单的细胞系或动物模型评估药理活性，未进一步探究其作用机制。而且，中药“多成分、多靶点、整体调节”的特点迫切需要进一步的药理学研究来充分阐明。
第三，长期临床实践已证实三叶青在治疗关节屈伸不利、女性月经不调、风湿痹痛、病毒性脑膜炎、跌打损伤和湿疹等方面具有可靠性，但目前的研究结果尚不足以从现代药理学角度验证和阐明这些传统用途。此外，关于三叶青的许多方面数据，如急慢性毒性、药代动力学、质量控制标准以及活性成分的临床价值等仍然有限，需要进一步研究以确定安全性和毒理学限度，并为临床应用提供指导。
总之，本综述全面展示了三叶青的传统用途、来源、化学成分、药理活性和毒理学等方面的信息，使人们更加了解三叶青，并推动其进一步研究，以开发新型草药和保健产品。
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