目录 CONTENTS

确定研究目的
选择合适实验技术
技术流程介绍
引物设计注意事项
引物设计流程
附件问题整理

一、确定研究目的
首先确定我的实验目的：研究疾病组与对照组样本中目的基因差异表达情况，包括mRNA水平与蛋白水平。
       导儿建议先从mRNA水平入手，此时我需要了解如何检验mRNA表达情况。

二、选择合适实验技术

1. 实时定量 PCR（qPCR/RT-qPCR）

  • 原理：

    • 将 mRNA 逆转录为 cDNA，通过荧光标记的引物或探针实时监测扩增过程，定量初始 mRNA 量。

2. 数字 PCR（dPCR）

  • 原理：

    • 将反应体系分割成微滴或微孔，每个单元独立扩增，通过阳性单元比例直接计算模板拷贝数。（临床之前用的多，听老师说后来不流行了）

3. Northern Blot

  • 原理：

    • 通过电泳分离RNA，转膜后用标记的DNA探针杂交，检测目标mRNA。

4. RNA测序（RNA-Seq）

  • 原理：

    • 高通量测序技术，直接对RNA片段测序，定量全转录组表达。

5. 微阵列（Microarray）

  • 原理：

    • 将探针固定在芯片上，与标记的cDNA杂交，通过荧光信号强度定量基因表达。

结合研究目的（只研究少量目的基因+灵敏度）与实验可行性（成本），选择qPCR进行验证。

三、qPCR全流程介绍

1. 实验设计

  • 样本分组：

    • 实验组 vs. 对照组（至少3次生物学重复，减少个体差异——即每组至少三个样本）

    • 每个样本设置技术重复（如2-3次，确保操作一致性）

  • 目标基因的确定：

    • 选择待研究的基因

  • 内参基因（Housekeeping Gene）：

    • 验证稳定性（如GAPDH、β-actin、18S rRNA等），避免表达波动。这里需要注意如果一些疾病模型对细胞的糖代谢产生影响，其实不太建议使用GADPH（仅个人观点）

2. RNA提取与质量控制

  • 关键步骤：

    1. 样本处理：液氮速冻组织或细胞，防止RNA降解。

    2. RNA提取：使用TRIzol或试剂盒。

    3. 质量检测：

    • 纯度：Nanodrop测定A260/A280（理想值1.8~2.1）。

    • 完整性：琼脂糖电泳（28S/18S rRNA条带比例≈2:1）或Agilent Bioanalyzer（RIN值>7）

  • 去除gDNA污染：用DNase I处理RNA。

        • 3. 逆转录（cDNA合成）

        • 试剂选择：

          • 逆转录酶：SuperScript IV（高保真）、M-MLV（经济型）。

          • 引物类型：Oligo(dT)：针对polyA尾mRNA（适合真核生物）；随机六聚体：适用于所有RNA（包括无polyA尾的rRNA或病毒RNA）

        Oligo是寡核苷酸的简称

          • 程序：

            • 25℃ 5 min（引物退火） → 50℃ 15 min（逆转录） → 80℃ 5 min（灭活酶）。

          4. 引物设计与验证

          • 设计原则：

            • 跨内含子设计：避免扩增gDNA。

            • 产物长度：100~200bp（qPCR的扩增产物大小——请教了王师姐✌️）

            • Tm值：上下游引物Tm值差异≤1℃（推荐60~65℃）。

            • 避免二聚体：用Primer-BLAST检查特异性。

          • 验证步骤：

          1. 标准曲线：梯度稀释cDNA（如5倍梯度），计算扩增效率（E=10^(-1/slope) -1，理想值90%~110%）。

          2. 熔解曲线：确认单一峰（单一产物），排除非特异性扩增。

          5. qPCR反应体系与程序（仅参考）

          6. 数据分析（仅参考）

          • ΔΔCt法（相对定量）：

          1. 计算ΔCt：目标基因Ct值 – 内参基因Ct值。

          2. 计算ΔΔCt：实验组ΔCt – 对照组ΔCt。

          3. 表达倍数：2^(-ΔΔCt)（若扩增效率非100%，需用效率校正公式）。


          四、如何设计qPCR引物

          设计qPCR引物时，通常要留意以下几点：引物尽量要跨内含子设计、产物长度100～220 bp、TM值尽量接近60℃且上下游引物尽量接近、引物末端最好是G或C等等。

          1. 引物跨内含子设计

          在设计qPCR引物时，选择跨内含子设计的引物可以使gDNA模板不能得到扩增，产物均来源于cDNA的扩增，这样也就去除了gDNA污染造成的影响。（如何理解——可详见后续问题整理）

          2. 引物长度

          引物长度一般在18~30 nt之间，qPCR的扩增产物长度尽量控制在 100～200bp之间。

          引物设计太短会导致非特异扩增，太长则容易形成二级结构(如发夹结构)。扩增产物太长不适于聚合酶进行反应，会影响到PCR扩增效率。

          3. GC含量和Tm值

          引物GC含量控制在40%~60%之间，过高或过低都不利于引发反应。正反向引物GC含量应接近相同，以便获得相同的 Tm值和退火温度。

          Tm值应尽量在55~65℃之间，一般为60℃左右，上下游的Tm值应尽量接近，最好不超过4℃。

          4. 引物3′端末端避免选择A

          引物3′端错配时，不同碱基引发合成效率存在着很大的差异，当末位碱基为A时，即使在错配的情况下，也能引发链合成，而当末位为T时，错配引发效率大大降低。因此引物3’端尽量避免选择A，最好选择T/C。（如何理解——可详见后续问题整理）

          5. 碱基分布

          引物中四种碱基的分布最好是随机的，3′端避免超过3个连续的G或C，3个以上连续的G或C容易在GC富集序列区产生配对。

          6. 引物设计区域应避开复杂二级结构。

          扩增产物单链形成二级结构会影响PCR顺利进行，可通过提前预测靶序列是否存在二级结构，尽量避开该区域设计引物。

          7. 引物自身和引物之间应尽量避免碱基连续互补。

          引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠形成发夹结构，而影响引物与模板的复性结合。

          8. 引物扩增的是目标特异产物。

          qPCR检测最终目的是了解目的基因的丰度，如果出现非特异扩增，定量会不准确。所以设计好引物后，需要对其进行BLAST检测，在序列数据库中比对产物的特异性。——单独查了一下什么是Blast，就是把设计的引物与数据库的序列进行比对，检测特异性。

          五、引物设计流程

                 之前看了一篇文章作者研究的ASH2L，他在补充材料中提供了使用的引物，我们以它为例试着设计qPCR引物。

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          当时我比较菜，不懂其实下载的“mRNA序列”其实就是cDNA序列

          这是我从参考文献中下载的补充材料里提及的引物：

          我们试着自己做做看看得到怎样的结果，而不是仅依靠于“生工生物技术公司”。（大家都是如何验证公司做的正确性呢？）

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          以下是生工生物合成的引物：

          OK，设计完引物找生物公司合成即可。

          六、附件问题：

          qPCR 引物设计

          1. RNA提取与质控中的纯度用Nanodrop测定A260/A280，理想值1.8~2.1的相关基础知识。

          在利用分光光度法（如Nanodrop）评估RNA纯度时，A260/A280比值是判断核酸样品中蛋白质污染的关键指标

          一、分光光度法的基本原理

          1. 吸光度（A）与物质的浓度关系：

          • 核酸（RNA/DNA）在紫外光260 nm处有最大吸收峰（由碱基的共轭双键结构引起）。

          • 蛋白质中的芳香族氨基酸（如色氨酸、酪氨酸）在280 nm处有吸收峰。

        • A260/A280比值的意义：

          • 用于评估核酸样品的纯度：比值偏离理论值表明存在污染物（如蛋白质、有机溶剂等）。

          二、理想值的科学依据

          1. 纯RNA的A260/A280比值

          • 理论值：

            • 纯RNA的A260/A280比值通常在 2.0左右（范围为1.8~2.1）。

            • 纯DNA的比值约为 1.8（因RNA与DNA的化学差异，如核糖的羟基影响吸光度）。

          • 原因：

            • RNA分子中核糖的羟基在溶液中会略微改变局部pH值，导致蛋白质的吸光度（A280）降低，从而使比值升高

          2. 影响比值的因素

          • 蛋白质污染：

            • 蛋白质在280 nm处吸光，若污染严重，A280升高 → 比值（A260/A280）降低（如<1.8）。

          • 有机溶剂或苯酚残留：

            • 某些试剂（如苯酚、胍盐）在270 nm附近吸光，可能干扰A260 → 比值异常升高（如>2.1）。

          • pH值的影响：

            • RNA在低pH下A260/A280比值可能升高（假性高纯度）。

            • 建议使用中性pH（如无核酸酶水）进行测量。

            • 低pH环境（如TE缓冲液的pH=7.0）会改变核酸和蛋白质的吸光特性：

          • RNA降解：

            • 降解RNA释放的游离核苷酸在260 nm处吸光更强，可能导致比值升高（但实际RNA质量差）。

          三、实际测量中的注意事项

          1. 标准化操作

          • 溶剂选择：

            • 用无核酸酶水（pH≈7.0）稀释RNA，避免缓冲液（如Tris-EDTA）干扰。

          • 空白校正：

            • 测量前用稀释液（如纯水）作为空白对照，消除背景干扰。

          四、A260/A280的局限性

          • 不能完全代表RNA质量：

            • 即使比值正常，RNA可能已降解（需通过电泳或Agilent Bioanalyzer验证完整性）。


          2. “去除gDNA污染是什么意思”与“什么是跨内含子设计”是一个问题

          1. 核心原理

          • 基因组DNA（gDNA）与cDNA的结构差异：

            • gDNA：包含外显子（编码区）和内含子（非编码区，在转录后会被剪切）。

            • cDNA：通过逆转录mRNA获得，仅包含外显子（无内含子）。

          • 引物设计策略：

            • 将引物设计在相邻两个外显子上，或让引物跨越外显子-内含子交界处。

            • 由于gDNA中存在内含子，引物对的结合位点会被内含子隔开，导致gDNA无法有效扩增；而cDNA无内含子，可正常扩增。

              如果引物能够同时结合cDNA和gDNA，那么gDNA的存在会导致非特异性扩增，使得定量结果不准确，尤其是当目标基因的gDNA含量较高时，比如多拷贝基因或者未完全去除gDNA的样本。

          情况1：引物对跨内含子

          • 设计方法：

            • 上游引物位于一个外显子，下游引物（Reverse）位于相邻外显子。

          • 结果：

            • 在cDNA中，两引物间隔较短（仅外显子长度），可扩增。

            • 在gDNA中，两引物间隔包含内含子（可能长达数千碱基），超出qPCR扩增能力（通常扩增长度<1 kb），无法有效扩增。

          情况2：单条引物跨外显子边界

          • 设计方法：

            • 引物的3’端跨越外显子-外显子连接处（即结合位点在两个外显子的交界处）。

          • 结果：

            • 在cDNA中，引物可完美结合。

            • 在gDNA中，内含子打断引物结合位点，导致无法有效退火。

          假设某基因有3个外显子（Exon 1、Exon 2、Exon 3），内含子位于Exon 1和Exon 2之间：

          • 理想设计：

            • Forward引物结合Exon 1，Reverse引物结合Exon 2。

            • 在gDNA中，两引物间隔为Exon 1 + 内含子 + Exon 2，扩增片段过长；在cDNA中仅为Exon 1 + Exon 2，可扩增。

          • 不推荐设计：

            • 两引物均位于同一外显子（可能扩增gDNA）。

          3.引物3’端尽量避免选择A——如何理解？

          背景知识

          引物3’端：在PCR中，引物的3’端是DNA聚合酶开始延伸合成新DNA链的位置，因此3’端的匹配情况直接影响扩增效率。（没理解的朋友想一下DNA聚合酶是由5′-3’延伸DNA的，所以引物自然相反，由3′-5’）看下面的图

          错配（Mismatch）：当引物3’端的碱基与模板DNA的对应碱基不完全配对时，称为错配。错配会影响DNA聚合酶的结合和延伸效率。

          碱基类型：DNA中的碱基有A（腺嘌呤）、T（胸腺嘧啶）、C（胞嘧啶）、G（鸟嘌呤）。不同碱基对错配的容忍度不同。

          为什么3’端错配会影响合成效率？

          DNA聚合酶在引物3’端延伸时，需要引物与模板DNA精确配对。如果3’端发生错配，聚合酶的结合和催化效率会下降，导致扩增效率降低甚至失败。

          不同碱基的错配对聚合酶的影响程度不同，这与碱基的化学性质和氢键结合力有关。

          为什么A作为3’端碱基即使错配也能引发合成？

          当引物3’端的碱基是A时，即使与模板DNA不完全配对（比如A-C或A-G错配），DNA聚合酶仍可能识别并延伸。这是因为A（嘌呤）在错配时形成的非标准碱基对（如A-C）仍然具有一定的结合稳定性，或者聚合酶对A的错配容忍度较高。当引物3’端是T时，错配（比如T-G或T-T）会显著降低聚合酶的结合和延伸效率。这可能与T（嘧啶）在错配时形成的非标准碱基对稳定性较差有关，聚合酶难以有效启动DNA合成

          写在最后

          Primer Blast 页面上各个参数的含义

          当设计跨外显子-外显子连接的引物时，需要确保引物同时结合到连接处的两个外显子（通过设置5’端和3’端的最小结合碱基数），以保证引物只扩增cDNA而非gDNA。这个设置只有在勾选“Primer must span an exon-exon junction”时生效

          当你开启这个选项（Primer-BLAST中的“Primer pair must be separated by at least one intron on the corresponding genomic DNA”），程序会尝试设计一对引物（正向引物和反向引物），使得它们在基因组DNA（gDNA）上被至少一个内含子分隔开。

          Primer-BLAST的特异性检查：Primer-BLAST通过将引物序列与数据库（如NCBI的RefSeq数据库）进行比对，检查引物是否只结合到目标序列，并评估引物对是否只在目标模板上产生有效的PCR产物。

          意思是：当你开启“引物特异性检查”选项（Check primer specificity），Primer-BLAST会将设计的正向引物（Forward Primer）和反向引物（Reverse Primer）与你选择的数据库（例如RefSeq mRNA、基因组DNA或其他数据库）进行比对。

          比对的目的是检查引物对是否会在数据库中的任何序列（目标或非目标）上产生有效的PCR产物。

          换句话说，程序会筛选出那些只扩增目标模板（例如特定mRNA或cDNA）的引物对，避免非特异性扩增。

          如果数据库中存在与目标序列高度同源的序列（例如伪基因），程序可能无法找到完全特异性的引物对，此时会返回特异性最好的候选引物对，并标注潜在的非特异性扩增风险

          Entrez查询（Entrez Query）

          • Primer-BLAST通过将引物序列与选定数据库（如RefSeq mRNA、RefSeq RNA或nr）比对，检查引物对是否只扩增目标模板，避免非特异性扩增。
          • Entrez查询
            ：Entrez是NCBI提供的一种查询语言，允许用户通过特定的语法（如GenBank accession number、物种名或其他条件）精确筛选数据库中的序列。
          • 为什么要限制搜索范围？
            • 默认情况下，特异性检查会针对整个数据库（如RefSeq mRNA或nr），可能包含大量无关序列（如预测转录本、环境样本序列），导致计算时间长或引物被误判为非特异性。
            • 通过Entrez查询，可以限制检查范围，只针对特定序列或序列子集进行特异性检查，提高效率并聚焦实验目标。

          如果你使用Entrez查询限制特异性检查到单一序列（如通过GenBank accession number），Primer-BLAST将只检查引物对在该序列上的特异性，而不会检查其他序列（例如同源基因、伪基因或其他转录本）。
          • 潜在风险
            • 如果实验样本中可能存在其他相关序列（如伪基因、家族成员基因或gDNA），仅检查单一序列可能忽略非特异性扩增的风险。
            • 例如：引物对在目标序列NM_001098494上特异性很好，但在未检查的同源序列（如伪基因NG_123456）上也能扩增，导致实验中出现非特异性产物。
          • 适用场景
            • 当你非常确定实验样本中只有目标序列（如纯化的cDNA样本，且已知无伪基因或其他干扰序列）。
            • 当数据库中包含大量无关序列（如预测转录本、环境样本序列），你想简化检查流程，专注于目标序列。
          • 建议
            除非你对样本的纯度和序列背景非常有把握，否则不建议仅限于单一序列检查，保留一定范围的数据库检查以确保特异性。



          设置较大的错配数（例如要求至少5个错配）会提高引物特异性，但也可能导致Primer-BLAST难以找到符合条件的引物对。


          • 较低的错配数（例如2个）可能稍微增加非特异性扩增风险，但可以确保找到引物对。
          • 较高的错配数（例如5个）特异性更高，但可能限制引物选择，特别是在目标基因有同源序列的情况下。