使用 CCK-8（Fig 1A ），transwell 测定（ Fig 1B ）和软琼脂集落形成测定（ ）评估细胞增殖，迁移和集落形成能力 Fig 1C 。与 PBS19 组相比，HQ19 组在所有检测中均表现出显著更高的活性，证实了恶性转化模型的成功建立。转录组测序差异基因分析（热图） Fig 1D 显示，与 PBS19 相比，HQ19 细胞中免疫逃逸相关基因的表达发生了变化。GEPIA2 数据库分析 （ Fig 1E ） 显示急性髓系白血病 （AML） 中 TP53 表达升高。TCGA 数据进一步表明 MYC、PD-L1 和 TP53 在白血病患者中的表达差异。生存曲线分析（ Fig 1F ~1H）显示，MYC、PD-L1 或 TP53 高表达的白血病患者 5 年生存率较低。
图 1.长期 HQ 治疗诱导 TK6 细胞恶性转化。
（A）HQ19 和 PBS19 细胞的增殖活力。（B）HQ19 和 PBS19 细胞的侵袭能力。（C）HQ19 和 PBS19 细胞的集落形成能力。（D）差异基因表达热图分析。（E）TP53 基因在各种癌症中的表达。（F、G、H）白血病患者癌症相关基因的生存曲线。ns 表示无统计学意义，*：P < 0.05，**：P < 0.01。
3.2 长期 HQ 处理后 TK6 细胞免疫逃逸和恶性基因的改变
采用 qRT-PCR 和 Western blot 分析 HQ19 和 PBS19 细胞中免疫逃逸相关基因的表达。PD-L1 （Fig 2A ）、c-Myc （ Fig 2B ）、IL-10 （ Fig 2D ） 和 TP53 （ Fig 2E ） 在 HQ19 中显示出上调的 RNA 水平，而 CD86 （ Fig 2C ） 则下调。筛选了其他阴性免疫逃逸调节剂 （ Fig 2F ）。蛋白质印迹蛋白水平（ Fig 2G ）的蛋白质印迹分析显示，HQ19 中 TP53 蛋白降低（ Fig 2H ），可能是由于基因去乙酰化（与 RNA 水平不一致），而 c-Myc（ Fig 2I ）和 PD-L1（ Fig 2J ）蛋白上调。
图 2.长期 HQ 治疗会改变 TK6 细胞中的免疫逃逸和恶性基因。
PD-L1 的转录水平。（B）c-Myc 的转录水平。（C）CD86 的转录水平。（D）IL-10 的转录水平。（E）TP53 的转录水平。（F）其他免疫逃逸基因阴性。（G）c-Myc、TP53 和 PD-L1 的蛋白表达水平。（H）TP53 的蛋白表达水平。（I）c-Myc 的蛋白表达水平。（J）PD-L1 蛋白表达水平。ns 表示无统计学意义，*：P < 0.05，**：P < 0.01。
3.3 c-Myc 作为 PD-L1 的上游调节因子并调节 PD-L1 表达
为了探索 c-Myc/PD-L1 调控轴，用 c-Myc 或 PD-L1 抑制剂处理 HQ19 细胞，然后进行 qRT-PCR 和 Western blot 分析。c-Myc 抑制剂治疗剂量依赖性降低 c-Myc 和 PD-L1 RNA 水平 （Fig 3A ~B），而 PD-L1 抑制剂降低 PD-L1 RNA （ Fig 3C ），而不影响 c-Myc （ Fig 3D ）。Western blot 法检测到 c-Myc 抑制剂处理后 c-Myc 和 PD-L1 蛋白的变化 Fig 3E （ ），定量分析表明 80 μM c-Myc 抑制剂降低了 c-Myc（ Fig 3F ）和 PD-L1（ Fig 3G ）蛋白水平。进行蛋白质印迹分析以检测 PD-L1 抑制剂治疗后 c-Myc 和 PD-L1 蛋白水平的变化 Fig 3H （ ）。定量分析表明，20μM PD-L1 抑制剂未诱导 c-Myc 蛋白显著降低（ Fig 3I ），而 PD-L1 蛋白则显著减少（ Fig 3J ）。这些发现表明 c-Myc 和 PD-L1 之间存在直接或间接的结合相互作用，其中 c-Myc 充当 PD-L1 的上游调节因子。
图 3.PD-L1 表达受其上游靶基因 c-Myc 调节。
（A）c-Myc 的转录水平。（B）PD-L1 的转录水平。（C）PD-L1 的转录水平。（D）c-Myc 的转录水平。（E）c-Myc 和 PD-L1 的蛋白表达水平。（F）c-Myc 的蛋白表达水平。（G）PD-L1 的蛋白表达水平。（H）c-Myc 和 PD-L1 的蛋白表达水平。（I）c-Myc 的蛋白表达水平。（J）PD-L1 蛋白表达水平。ns 表示无统计学意义，*：P < 0.05，**：P < 0.01。
3.4 转录因子 c-Myc 和 PD-L1 在 84-95 上具有结合位点，具有直接调控关系
为了识别转录因子 c-Myc 和 PD-L1 之间的调节结合位点，使用免疫荧光 （IF） 可视化 c-Myc 定位。IF 结果显示 c-Myc 在 HQ19 和 PBS19 细胞中的核定位 （Fig 4A ），与 PBS19 相比，HQ19 的荧光强度显着增强 Fig 4B （ ）。绘制了 PD-L1 上 c-Myc 的预测结合位点，并将在 84-95 bp 区域携带基因沉默突变的质粒转染到细胞中 （ Fig 4C ）。双荧光素酶报告基因测定证实 c-Myc 促进 PD-L1 表达 （ Fig 4D ）。时程 qRT-PCR 显示 c-Myc RNA 水平升高（ Fig 4E ）和 PD-L1 RNA 逐渐上调（ Fig 4F ），同时免疫逃逸能力增强。蛋白质印迹分析显示 c-Myc （ Fig 4H ） 和 PD-L1 （ Fig 4I ） 蛋白水平随时间增加，与 RNA 表达趋势一致 （ Fig 4G ）。
图 4.转录因子 c-Myc 在 84-95 位点与 PD-L1 结合，建立直接调控关系。
（A）c-Myc 在 HQ19 和 PBS19 中的定位。（B）HQ19 和 PBS19 中的 c-Myc 荧光强度。（C）c-Myc 和 PD-L1 的预测结合位点。（D）WT 组和 MUT 组的相对荧光强度比较。（E）c-Myc 的时程转录水平。（F）PD-L1 的时程转录水平。（G）c-Myc 和 PD-L1 的时程蛋白表达水平。（H）c-Myc 的时变蛋白表达水平。（I）PD-L1 的时程蛋白表达水平。ns 表示无统计学意义，*：P < 0.05，**：P < 0.01。
为了阐明 T 细胞在肿瘤微环境中的免疫调节机制，作者分析了各种白血病细胞系中关键基因（包括 c-Myc 和 PD-L1）的 RNA 表达水平。使用 qRT-PCR，作者量化了免疫调节因子的转录水平，发现与 TK6 细胞相比，KG-1 细胞中的 c-Myc 和 PD-L1 均显着上调 （ Fig 5A ~B）。Western blot 分析进一步证实 KG-1 细胞中 c-Myc 和 PD-L1 蛋白表达升高（ Fig 5C ~E）。为了模拟微环境中的免疫细胞相互作用，作者建立了 Jurkat T 细胞与 KG-1 细胞的共培养系统（使用 HQ19 作为阳性对照）。基因表达谱表明，与单一培养对照相比，与 KG-1 共培养显着提高了 Jurkat 细胞中免疫检查点分子 CTLA4 和 PD-1 的 RNA 水平 （ Fig 5F ~G）。蛋白质印迹在蛋白质水平上验证了这些发现，显示共培养的 Jurkat 细胞中 CTLA4 和 PD-1 明显上调 （ Fig 5H ~J）。总的来说，这些数据表明 KG-1 细胞可能通过上调 c-Myc 和 PD-L1 来促进 T 细胞中免疫检查点分子的表达。
（A）不同白血病细胞系中 c-Myc 的转录水平。（B）不同白血病细胞系中 PD-L1 的转录水平。（C）KG-1 与 TK6 的蛋白质表达水平。（D）KG-1 与 TK6 的 c-Myc 蛋白表达水平。（E）KG-1 与 TK6 的 PD-L1 蛋白表达水平比较。（F）CTLA4 的转录水平。（G）PD-1 的转录水平。（H）Jurkat 和 KG-1 共培养后的 T 细胞蛋白表达水平。（I）CTLA4 蛋白表达水平。（J）PD-1 蛋白表达水平。ns 表示无统计学意义，*：P < 0.05，**：P < 0.01。
3.6 慢性苯暴露导致小鼠恶性病变，HQ19 导致 C57BL/6 小鼠肿瘤发生
为了研究长期苯暴露的致癌作用，作者通过动态吸入将 C57BL / 6 小鼠暴露于苯（0 或 20 mg / m3）12 个月，建立了小鼠模型。处死后，收集全血进行 qRT-PCR 和免疫逃逸相关基因的 Western blot 分析。与对照组相比，苯暴露小鼠表现出显着更高的 PD-1、c-Myc、PD-L1 和 CTLA4 RNA 水平，而 TP53 RNA 没有显着变化 （ Fig 6A ~E）。血液样本的蛋白质印迹分析进一步证实了暴露小鼠中 PD-1（ Fig 6G ）、c-Myc （ Fig 6I ）、PD-L1 （ Fig 6J ）和 CTLA4 （ Fig 6K ）的蛋白表达升高，而 TP53 蛋白显着下调（ Fig 6H ）。这些结果表明，长期苯暴露会使体内免疫逃逸途径失调。
图 6.慢性苯暴露诱导小鼠恶性病变，HQ19 促进 C57BL / 6 小鼠的肿瘤发生。
（A）PD-1 的转录水平。（B）TP53 的转录水平。（C）c-Myc 的转录水平。（D）PD-L1 的转录水平。（E）CTLA4 的转录水平。（F）动态吸入暴露 12 个月后小鼠全血中免疫逃逸相关基因的蛋白表达水平。（G）PD-1 蛋白表达水平。（H）c-Myc 蛋白表达水平。（I）TP53 蛋白表达水平。（J）PD-L1 蛋白表达水平。（K）CTLA4 蛋白表达水平。（L）肿瘤发生测定中五个梯度组的肿瘤大小。（M）肿瘤发生测定中五个梯度组的肿瘤重量。ns 表示无统计学意义，*：P < 0.05，**：P < 0.01。
为了评估 HQ19 的致癌潜力，作者使用五个治疗组在 C57BL / 6 小鼠中进行了肿瘤发生测定：PBS19，HQ19，HQ19 + c-Myc 抑制剂，HQ19 + PD-L1 抑制剂和 HQ19 +联合抑制剂（ Fig 6L ）。与 PBS19 对照组相比，HQ19 组的肿瘤明显更大（ Fig 6M ）。单独使用抑制剂或联合治疗可显着降低肿瘤负荷，表明 HQ19 诱导的恶性肿瘤依赖于 c-Myc/PD-L1 信号传导。总的来说，这些发现表明，长期苯暴露会促进体内免疫逃逸和恶性肿瘤，并且可以通过靶向 c-Myc/PD-L1 通路来减轻 HQ19 驱动的肿瘤发生。
总结
苯代谢物对苯二酚（HQ）促进 TK6 细胞的免疫逃逸和恶性转化。转录因子 c-Myc 可以通过激活 PD-L1 的转录来调节诱导的免疫逃逸效应。从这个角度来看，如果可以通过未来的临床实验证实 c-Myc 在免疫逃逸中的作用，那么靶向 c-Myc/PD-L1 轴可能作为苯暴露引起的血液系统疾病的潜在治疗策略。
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