微精选

2.1 自噬活性在柑橘果实着色过程中显著增强

实验方案：

•     样本选择：使用柑橘品种’Newhall’果实，在着色阶段（150至190天开花后，DPA）定期取样。

• 检测方法：ATG8脂化水平：通过Western blot检测ATG8-PE（自噬体形成标志）。

• MDC染色：荧光显微镜观察酸性区室（自噬体）数量。

• 透射电镜（TEM）：直接观察细胞中自噬体结构。

结果：

• ATG8-PE水平：随果实成熟（150→190 DPA）持续上升（图1a,b）。

• MDC斑点数量：在190 DPA时显著增加（图1c,d）。

• 自噬体结构：TEM显示成熟果实细胞中自噬体数量增加5倍（图1e,f）。

结论：自噬活性在柑橘果实着色过程中逐步增强，与颜色转变同步。

2.2 抑制自噬显著延迟果实着色

实验方案：

• 构建自噬缺陷模型：通过RNAi沉默迷你柑橘（Hong Kong kumquat）的FhATG7基因（自噬关键基因）。

• 验证方法：qRT-PCR检测基因表达，Western blot检测ATG8-PE水平，MDC染色观察自噬体。

• 表型观察：记录果实颜色变化时间点。

结果：

• 自噬活性降低：RNAi株系中ATG8-PE和MDC斑点显著减少（图2a-c）。

• 着色延迟：对照组20周（WPA）进入转色期（BR阶段），而RNAi株系延迟2-3周（图2d,e）。

结论：自噬是柑橘果实正常着色的必要条件，其缺陷会导致着色显著延迟。

2.3 乙烯通过激活自噬促进着色

实验方案：

• 乙烯处理：对’Newhall’果实（150 DPA）外源施加乙烯，监测颜色和自噬变化。

  

• 检测指标：

• 颜色参数：Minolta色度（a*/b*值）、叶绿素含量。

• 自噬活性：ATG8-PE水平、MDC斑点、ATG基因表达。

结果：

• 颜色变化：乙烯处理4天后果实明显脱绿（图3a），叶绿素含量降低（图3c）。

• 自噬激活：ATG8-PE在1-2天内快速增加（图3d,e），MDC斑点增多（图3f,g）。

• 基因表达：CsATG3、CsATG7、CsATG8h等显著上调（图4）。

结论：乙烯通过快速诱导自噬活性及相关基因表达，加速果实脱绿和着色。

2.4 CsERF061直接调控自噬基因CsATG8h

实验设计：

• CsERF061功能验证：过表达CsERF061的柑橘愈伤组织：检测ATG8-PE及ATG基因表达。

• 瞬时转化柑橘果实：观察局部着色及基因表达。

• 分子机制：启动子结合：双荧光素酶报告、酵母单杂交（Y1H）、电泳迁移率变动分析（EMSA）。

结果：

• 过表达效应：CsERF061显著提高ATG8-PE水平，上调CsATG8h（图6c,d）。

• 启动子结合：双荧光素酶：CsERF061激活CsATG8h启动子活性3倍（图7b）。

• Y1H和EMSA：CsERF061直接结合CsATG8h启动子的DRE/CRT顺式元件（图7c,d）。

• 瞬时转化验证：过表达CsERF061：果皮局部着色加深，CsATG8h表达升高（图8a-d）。

• RNAi抑制CsERF061：削弱乙烯诱导的着色和CsATG8h表达（图8e-h）。

结论：CsERF061是乙烯信号下游的关键转录因子，通过直接激活CsATG8h表达促进自噬和着色。

2.5 自噬在乙烯诱导着色中的保守性（番茄验证）

实验设计：

• 模型选择：利用番茄（Micro-Tom）SlATG7-RNAi自噬缺陷株系。

• 乙烯处理：对比野生型和突变体果实对乙烯的着色响应。

关键结果：

• 表型差异：乙烯处理后，野生型番茄快速转黄，而SlATG7-RNAi果实几乎无变化（图5a）。

• 颜色指数：野生型a*/b*值显著升高，突变体变化微弱（图5b,c）。

结论：自噬在乙烯诱导果实着色中的功能具有跨物种保守性，进一步支持其核心作用。

在本研究中，我们发现柑橘果实着色过程中果皮细胞的自噬活性显著增强。通过阻断自噬，果实着色被延迟至少两周，表明自噬是这一过程的关键。