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导语 
从 2018 年 6 月 6 日到 2023 年 2 月 14 日，共有 31 名患者注册，并在莫菲特癌症中心进行了这项非随机、非盲法的试点研究，共有 30 名患者接受治疗。7 名患者进入 A 组（1 名未评估的患者在治疗前的同意后退出），6 名患者进入 B 组，18 名患者进入 C 组。截至 2023 年 10 月 17 日的患者去向如图1 所示。
可评估患者的总体 pCR 率为 20/30（64.5%，95% CI = 45.4–80.8），所有组间均如此。三组的 pCR 描述性率分解以及使用残余癌症负荷指数（RCB）的应答分。
截至 2023 年 11 月 10 日，中位随访时间为 32.8 个月，2 名患者（均来自 C 组）出现脑部癌症复发，导致无病生存率和总生存率均为 93.3%。值得注意的是，出现乳腺癌复发的两名患者均达到病理完全缓解，但在初次诊断时处于较晚期（IIB 期和 III 期）。另外两名患者（A 组和 C 组各一名）出现非乳腺癌原发肿瘤（分别为肺癌腺癌和胰腺癌腺癌），未导致死亡，因此不计入无复发生存率的次要终点。关于新辅助化疗的执行情况，计划疗程的 176/180（97.8%）得以完成，其中 138/180（76.7%）达到了全剂量。同样，大多数患者（27/30，90%）能够完成一年的 HER2 靶向辅助治疗。关于治疗的更多数据见补充材料。
整个研究人群中所有组别合并发生比例超过 20%的不良事件安全数据。显示了三种组别中常见的预期不良事件及分级分布。大多数不良事件归因于新辅助化疗。被认为特异性于树突状细胞疫苗的不良事件，如注射部位反应、寒战和发热，在表中以粗体显示。有四例严重不良事件为 4 级，无 5 级事件。严重不良事件包括 B 组一例肺栓塞，C 组各一例结肠炎、穿孔性阑尾炎和中性粒细胞减少症/发热性中性粒细胞减少症。
通过干扰素γ ELISPOT 测定法测量了基线时及接种 DC1 疫苗后对 HER2 抗原有反应的活化 T 细胞数量，该测定法为每个分泌干扰素γ的 HER2 活化 T 细胞产生一个可见斑点。在三个组别中，分别于基线、第 4 周、第 28 周、第 56 周、第 80 周和第 104 周采集血液样本进行的 HER2 ELISPOT 免疫反应数据如图2 所示。对于采用淋巴结内注射的两组（A 和 B），与基线相比，第 4 周的 ELISPOT 计数增加，这是预期的结果。同样，由于新辅助化疗，ELISPOT 计数预期减少，并在完成化疗后增强序列后出现反弹。然而，出乎意料的是，在给予初始肿瘤内和淋巴结内疫苗序列后，C 组并未出现第 4 周的 ELISPOT 计数增加。C 组的 ELISPOT 计数随着时间的推移同样增加，这是由于术后增强淋巴结内疫苗序列的作用，表明肿瘤内疫苗对循环 T 细胞产生了不同的影响。 术前新辅助化疗的免疫抑制作用通常在一年内消失，因此第二年 ELISPOT 变化的增加并非仅仅是免疫系统在 104 周时恢复到基线水平。一种可能性是肿瘤内疫苗剂量导致 HER2 特异性 T 细胞从循环系统向肿瘤部位增加迁移。患者未进行 HLA 亚型分类，因为用于 DC1 脉冲和 ELISPOT 检测的 HER2 肽类是 II 类免疫多态性肽，以最大化疫苗与免疫系统的兼容性。
图 2. 不同时间点的 HER2 ELISPOT 计数，每列上方的时间点中位数
A 试验方案图示用于阐明治疗和采样时间。图中显示了 A 组、B 组和 C 组（分别对应 B、C、D 组）的 ELISPOT 计数。A 组和 B 组在第 4 周 ELISPOT 计数中均未出现统计学显著增加，随后在化疗期间下降，并在化疗后进行加强性淋巴结内疫苗接种时随时间增加，尤其在 A 组中更为明显。C 组不同之处在于，其循环 ELISPOT 水平在第 4 周出现初始下降，随后在加强阶段随时间增加。
为进一步研究这一现象，对臂 C 患者在接受治疗开始前和完成 DC1 疫苗（第 4 周）后的可用肿瘤针活检样本进行了多重免疫荧光（mIF）检测。mIF 数据如图3 所示，其中展示了同一患者基线和第 4 周中期治疗活检样本的代表性图像，与基线相比，基质免疫细胞浸润显著增加。图 4 中的小提琴图显示了整个组织切片中阳性表达 CD3（淋巴细胞）、CD3+4+（辅助性 T 细胞）、CD3+45RO+（记忆性 T 细胞）、CD3+TCRδ+（γδT 细胞）、CD3+8+（效应性 T 细胞）、CD3+56+（NKT 细胞）、CD20+（B 细胞）、MHCII 和 CD3+干扰素-γ（INFγ）表达的细胞百分比。在接种后，统计上最显著的增加出现在新辅助化疗给药前 CD3+8+、NKT、MHCII 和产生干扰素-γ的淋巴细胞。由于没有 A 臂和 B 臂的治疗期间活检样本可供直接比较，因此无法得出关于肿瘤床浸润是否在瘤内接种相对于淋巴结内接种时更大的结论。
图 3. C 组患者在基线和治疗期间活检的免疫荧光图像，显示 CD4+辅助性 T 细胞、CD8+效应性 T 细胞、CD56+ NK/NKT 细胞和 CD20+ B 细胞的标记。
最左侧的面板是一个放大的区域，以更好地展示肿瘤岛周围基质中细胞类型的分布。
图 4. 展示了臂 C 患者基线和第 4 周活检中分析组织切片内不同细胞亚型的频率的小提琴图。
在 CD8+效应 T 细胞、分泌干扰素-γ的淋巴细胞和 NKT 细胞中观察到统计学上显著的增加。
通过 mIF 比较不同免疫细胞亚型在残留疾病（非 pCR）患者与病理完全缓解（pCR）患者样本中的阳性细胞百分比，在完成新辅助化疗后，发现 pCR 患者的治疗中期样本中基质 CD3+INFγ+细胞数量增加的趋势与非 pCR 患者相比不具有统计学意义。对 NKT 细胞的反应组差异在统计学上不显著。（图5 ）
图 5. 残余癌症患者（非 pCR）和最终达到病理完全缓解（pCR）患者的 mIF 样本比较。
在 DC1 疫苗接种 4 周后，pCR 患者的基质中 CD3+IFNγ+细胞数量呈现上升趋势，而非 pCR 患者则没有这种变化，而 NKT 细胞在两组中表现相似。与基线相比，两组的 T 细胞和 NKT 细胞浸润均有所增加。
总结
总之，这项试点研究的结果表明，在术前化疗之前给予新辅助 DC1 疫苗是安全可行的。HER2 DC1 疫苗导致 T 细胞浸润显著增加至治疗肿瘤中，并且这种效果在完成治疗后达到病理完全缓解（pCR）的患者中可能更为明显。有必要对更高剂量的 DC1 细胞、剂量降低的化疗方案（如正在进行的 NATASHA 研究NCT05325632 ）以及使用其他抗原的肿瘤内 DC1 疫苗进行进一步研究。。
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