人脑的功能特性，部分源于构成大脑皮层的种类繁多的细胞类型。皮层可以被大致划分为不同的网络，这些网络嵌入在从单模态系统延伸至高阶联合区域的处理流（或梯度）中。在这里，我们利用来自艾伦人脑图谱的微阵列数据和来自多个皮层区域的单细胞核RNA测序数据，证明了细胞类型的分布与通过功能磁共振成像估测的皮层功能性组织在空间上是耦合的。差异性富集的细胞遵循功能梯度和相关大规模网络的空间拓扑结构。不同网络中存在着独特的细胞指纹，一个基于死后细胞类型分布训练的分类器能够预测皮层组织样本的功能网络归属。这些数据结果表明，皮层的体内组织结构反映在其细胞组成的空间变异性上。本文发表在Nature Neuroscience杂志。
正文
脑科学研究的一个核心目标是理解连接分子和细胞过程与人脑皮层体内功能性组织的多尺度关系。历史上，皮层边界及相关区域的界定是通过组织学、解剖束路追踪、电生理学和损伤法等侵入性技术来确定的。通过这些方法，神经科学家和组织学家绘制了里程碑式的图谱，根据细胞结构的区域模式划分不同区域，揭示了串行和并行信息处理层级的存在。最近，密集的空间转录组图谱的发展使得研究人类大脑功能的细胞相关性成为可能，例如通过功能磁共振成像（fMRI）来估测。初步工作建立了大规模网络组织的分子相关性，包括编码离子通道的基因和在皮层上颗粒层富集的基因，以及中间神经元相关基因的空间分布与fMRI信号变异性区域差异之间的关联。然而，相关的离体细胞结构在多大程度上反映了通过静息态fMRI（rs-fMRI）测量的人类大脑皮层层级功能特性，仍有待系统性研究。
从感觉到认知和行动，人类皮层被组织成一个多尺度系统，由位于分离处理流中的区域单元构成。这些单元或分区，嵌入在通过解剖投射、任务诱发功能和内在活动模式所显现的相应网络中。支持这种网络结构的证据汇合表明，存在一个广泛的划分，将单模态的体感/运动（somato/motor）和视觉区域与整合跨分布式脑系统长距离投射的异构模态联合区区分开来。这种层级组织特性反映在跨越皮层的功能梯度的存在上，它将不同的网络和相应的区域分区置于一个连续的谱系中。这些梯度反映了功能连接（FC）的低维表示，其中第一个（即主要）梯度的一端由支持初级感觉或运动功能的单模态区域锚定，另一端由联合皮层锚定。第二个梯度反映了一种感觉组织，其两端分别由视觉皮层或体感/运动皮层锚定。然而，尽管近期证据表明皮层宏观组织存在遗传基础，但多样的细胞谱在多大程度上支持功能性脑组织的各个方面仍有待确定。
将分子和细胞过程与功能性组织特性联系起来的转化挑战，部分可以通过整合离体组织样本的转录组数据与体内脑功能的估测来解决。经典的神经解剖学发现揭示了限制皮层区域布局、其相应微观结构和解剖连接的进化过程和发育机制。近期的工作支持了皮层存在广泛的组织轴，例如，反映在受体密度的空间分布、皮层内髓鞘形成和转录组独特性区域估测中。将基因表达与功能网络关联的初步研究揭示了功能上耦合的解剖区域之间存在共同富集的基因，这或许反映了特定细胞类型在网络中的优先存在。与此推测一致，后续工作表明，fMRI信号变异性的空间谱遵循表达小白蛋白（PVALB）和生长抑素（SST）的抑制性中间神经元的相对分布，从而大致区分了单模态和联合皮层。有趣的是，从rs-fMRI得出的某些区域边界也被证明与组织学和结构上定义的构筑分区相对应。然而，尽管这些数据表明了脑组织的微观（分子和细胞）与宏观（梯度和网络）特性之间存在联系，但我们对大脑皮层复杂的功能结构如何由多样的细胞类型支持的理解仍然是零散的。一种可能性是，某些细胞类别的相对优势可能与跨皮层逐渐变化的梯度模式在空间上耦合。另一种但非互斥的假说是，皮层细胞类型的空间分布遵循功能上连接但空间上分离的网络的拓扑组织。
细胞类型表现出不同的特性，包括其形态、电生理学、细胞间连接和分子内容。尽管这些多维特征不一定同时变化，但高通量单细胞核RNA测序（snRNA-seq）数据的最新发展在表征细胞基因表达的广泛谱系方面发挥了关键作用。从表征单细胞多模态特征的技术（如patch-seq）来看，转录定义的细胞类型表现出电生理学和形态学上的差异。在这里，我们研究了功能梯度、网络与细胞类型空间分布之间的关联，这些分布是通过来自八个皮层区域的单细胞核以及从遍布皮层的供体组织中切除的大块组织样本的基因转录模式推断出来的。我们证明，推算的细胞类型分布在空间上追踪了皮层的梯度组织，无论是在单个细胞类型层面还是在多变量细胞谱层面。此外，大规模网络中也存在着独特的细胞富集模式，这表明存在一个互补的细胞组织网络结构。这些细胞指纹可用于根据在独立的死后脑组织中测量的相应细胞类型丰度来预测皮层分区的网络归属。这些数据有助于解决神经科学中的一个关键挑战，即理解细胞类型分布如何构成人脑的体内功能特性，从而在区域性细胞谱和皮层的层级组织之间建立空间对应关系。
结果
人脑皮层的大规模功能性组织
我们通过梯度和大规模网络两种方式来表征皮层的多尺度和层级组织（图1）。我们应用扩散图嵌入将顶点水平的rs-fMRI功能连接（FC）分解为连续的梯度，这些梯度捕捉了来自人脑连接组计划（HCP，n=820）数据中的最大方差。为使功能性测量能与细胞谱相关联，我们将顶点水平的梯度值划分到Schaefer 400图谱中。分区水平的网络分配如文献23所述获得（图1a）。接下来，我们使用这些互补的、基于梯度和网络的方法作为基础，以建立大脑皮层体内功能性组织的细胞关联。
图1：大规模功能网络嵌入在两个主要梯度中
a, 人脑皮层的网络组织通过内在功能连接模式得以揭示。网络分配基于Yeo等人的七网络解决方案，并在Schaefer等人的400分区功能图谱上取平均。颜色反映了被估计在同一网络内的区域。
b, 内在FC的第一个主要梯度。分区根据其在联合皮层（亮黄色）和单模态皮层（深蓝色）之间的相对拓扑位置着色。标尺反映了使用扩散图嵌入从连接矩阵中导出的z变换主梯度值。
c, 内在FC的第二个梯度锚定在单模态区域内，一端为初级视觉皮层（亮黄色），另一端为体感/运动/听觉皮层（深蓝色）。
d, 七个网络沿两个主要梯度的空间组织。VentAttn，突显/腹侧注意网络；DorsAttn，背侧注意网络；Som/motor，体感/运动网络。
目前的分析集中于前两个主要梯度，它们反映了人脑皮层中的经典信息处理层级。与降低几何维度的线性方法不同，扩散图嵌入允许将拓扑上相似的局部和长距离连接置于具有可解释结构的共同空间中。所得到的梯度是无单位的，反映了顶点在一个相关的嵌入轴上的位置，该轴捕捉了FC模式中的主要差异。与先前的工作一致，第一个梯度（梯度1）的结构从单模态区域（包括初级视觉、听觉、体感和运动皮层）延伸至跨模态或联合（默认网络）区域（图1b）。第二个梯度（梯度2）的峰值出现在中央沟和距状沟沿线，区分了体感/运动皮层和初级视觉系统（图1c）。前两个梯度解释了FC中相当大比例的方差（梯度1，26%；梯度2，12%）。如文献20最初报道，大规模网络分布在整个皮层上，并沿这两个主要梯度在空间上有序排列（图1d），这是皮层组织的一种特性，反映在跨皮层叶的网络之间的重复过渡中。这些数据突出了互补的分析框架，将大规模皮层网络和功能置于重叠的组织轴上的不同域中。
皮层梯度的单变量细胞关联
源自rs-fMRI的区域划分已被证明遵循某些组织学和结构上定义的构筑分区的边界，例如在体感/运动区域和推定的语言区内。然而，区域性细胞谱与皮层层级组织在空间上共变的程度在体内尚未被完全确定。为了将推断出的离体测量的细胞类型的空间分布与两个主要功能梯度联系起来，我们使用艾伦人脑图谱（AHBA）的死后大块组织基因表达样本，通过一种先前验证过的方法估算了细胞类型丰度（方法；扩展数据图1a）。用于识别AHBA大块样本中细胞类别的转录特征源自Jorstad数据集中报道的八个皮层区域的皮层snRNA-seq数据（扩展数据图1和2）。目前的分析集中于24个具有不同层状特化、发育起源、形态、发放模式和广泛投射靶标的细胞类别（详见扩展数据表1）。这些细胞包括九种GABA能抑制性中间神经元（PAX6、SNCG、VIP、LAMP5、LAMP5 LHX6、Chandelier、PVALB、SST CHODL和SST），九种谷氨酸能兴奋性神经元（L2/3 IT、L4 IT、L5 IT、L6 IT、L5 ET、L5/6 NP、L6 CT、L6b和L6 IT Car3），以及六种非神经元细胞（Astro、Endo、VLMC、Oligo、OPC和Micro/PVM）。我们将广泛使用的Lake数据集中提供的snRNA-seq数据与这些细胞类型进行了比较（补充图3），作为观察到的细胞-功能关系的技术性重复验证（补充信息）。我们估算了可用大块样本中每种细胞类型的丰度，并进一步将其聚合到400个皮层分区中（方法）。然后，我们考察了所得的分区级细胞类型丰度分布与皮层的体内功能梯度组织的关系。统计显著性通过考虑了空间自相关的置换旋转检验来确定，并对每个梯度的24次比较进行了错误发现率（FDR）校正。
梯度与细胞类型之间的关联显示在图2a中（Lake数据集见扩展数据图4）。图2b, c显示了单变量细胞类型关联，完整结果显示在扩展数据图5和6中（Lake数据集见补充图1和2）。推算的细胞类型的相对优势分布在皮层各分区（图2b），表明某些细胞类型的丰度沿梯度分布的功能网络逐渐增加/减少，其相对富集或缺失在某些网络内是明显的（图2c）。细胞类型分数的数值恒为正，梯度值代表各分区相互间的拓扑位置。因此，正相关和负相关都表明给定细胞类型的丰度分布遵循相应的梯度值。梯度1（图2b），跨越单模态-跨模态轴，与SNCG样中间神经元（SNCG; ρ = 0.402, P < 0.001）、中间神经元SST（ρ = 0.308, P = 0.036）和第5层端脑内投射兴奋性神经元（L5 IT; ρ = 0.281, P < 0.001）的推算空间分布呈正相关，表明这三种细胞类型优先富集于梯度1的跨模态端。第4层端脑内投射兴奋性神经元（L4 IT; ρ = −0.423, P < 0.001）与梯度1呈负相关，富集于体感/运动和视觉端，表明其在单模态区域丰度较高。
图2：单变量细胞类型分布与功能梯度拓扑结构一致。
a, 细胞类型由AHBA大块组织样本中的基因表达推算得出。单细胞特征由来自八个皮层区域的独立组织样本构建。所得的细胞类型丰度按其与每个主要功能梯度的空间相关性进行排序。暖色表示正相关，每个单元格中的数字反映了通过双侧旋转检验计算的相关P值，该检验控制了部分自相关，并对24次比较进行了FDR校正。P < 0.05的相关性由黑色外框标出。经显著性检验筛选后，梯度1的空间模式与两种中间神经元亚型（SNCG和SST）以及两种兴奋性神经元亚型（L5 IT和L4 IT）相关。
b, 推算的细胞类型丰度在皮层的分布表明，SNCG、SST和L5 IT优先分布在梯度1的跨模态端（亮黄色），而L4 IT优先分布在单模态端（深蓝色）。标尺反映了估算的细胞分数。被排除在分析之外且未被AHBA大块样本覆盖的分区为灰色。
c, 散点图中每个皮层分区按相应的功能网络着色，显示细胞类型丰度沿梯度分布的网络逐渐增加/减少，在某些网络内富集/缺失明显。相关性通过斯皮尔曼ρ估算（如a中标尺所示），但为便于观察，也显示了预测细胞丰度与梯度值的拟合线性回归线及95%置信区间（CI）。
SNCG密集分布于颞顶联合区、颞叶、内侧前额叶皮层（mPFC）以及从上额叶到下额叶回的区域。SNCG位于大脑皮层最表层（主要在L1，部分在L2/3），那里是大多数通过局部抑制调节深层兴奋性神经元的GABA能中间神经元所在之处。SNCG起源于端脑的尾侧神经节隆起（CGE），在Lake数据集中与表达胆囊收缩素的第1层中间神经元（CCK/In1（参考文献43））相匹配（扩展数据图3）。在Lake数据集的重复验证中，In1也与梯度1呈最强的正相关（扩展数据图4；ρ = 0.309，P = 0.011）。SNCG在啮齿动物中的同源物反映了经典的CCK篮状中间神经元。中间神经元SST在mPFC、颞极和下额叶回附近达到峰值，并密集分布于顶内沟附近。SST起源于内侧神经节隆起（MGE），在Lake数据集中大致对应于In8（参考文献43）（扩展数据图3b, c）。SST是最大的中间神经元类别之一。在所见的皮层区域中，这些细胞大多数位于L2/3，而特化亚型主要存在于初级视觉皮层的L4-L5。在人类中，L2/3 SST（SST CALB1）细胞具有形态上不同的形式，反映了(1)树突主要靶向L1的马丁诺蒂细胞，(2)树突靶向L1-L5的双花束细胞，以及(3)树突主要靶向L3的篮状细胞。这些亚型表现出从快速发放到规律发放的多样化发放模式。
与跨模态相关的L5 IT在顶下小叶、颞叶、背内侧前额叶皮层以及中扣带回和前扣带回有高丰度。在人类中，与上层的IT相比，L5 IT的基底树突更短（止于L2/3），顶树突更简单。啮齿动物的L5 IT同源物表现出向皮层外侧半球和纹状体的广泛轴突投射。相反，与单模态相关的L4 IT密集分布在初级视觉、听觉、运动和体感皮层。L4 IT主要富集于接收来自丘脑感觉信息的L4层，具有更多样化的亚型，这些亚型高度适应相应的感官输入。我们观察到L4 IT在缺乏细胞密集的颗粒L4层的初级运动皮层中丰度很高，这与啮齿动物模型的研究结果非常一致。虽然这些分析揭示了优先沿功能梯度分布的孤立细胞类型，且主要锚定在每个梯度的极值端，但皮层的大规模组织可能在同时考虑多种细胞类型的分布时才最为明显。我们在下一节将进一步研究细胞类型与梯度的组合对齐。
多变量细胞谱追踪皮层梯度
以上，我们建立了孤立研究的细胞类型与前两个功能连接梯度之间的空间关系。然而，皮层的宏观组织在多大程度上可能反映在多种细胞类型的空间分布中，仍有待确定。为了检验这些多变量细胞谱的存在，我们使用了置换典型相关分析（PermCCA），该方法旨在寻找与每个梯度最大相关的细胞类型分布的线性组合。我们使用旋转检验置换⁴⁴对所得的典型变量进行推断，以考虑空间自相关。
在这里，所得的细胞类型复合分数反映了与每个功能梯度最大相关的、所有细胞类型空间分布的线性组合。如图3所示（Lake数据集见扩展数据图7和补充图3），在三次技术重复验证中，细胞类型复合分数都与第一和第二梯度相关（图3a, d，扩展数据图7a, d和补充图3a, d）。在图3b, e中（Lake数据集见扩展数据图7b, e和补充图3b, e），我们展示了与第一和第二功能梯度相关的每个细胞类型复合分数的参与强度，并将其投射到皮层表面。在单变量水平上，如上所述，这些与梯度相关的细胞类型出现了一个共同的空间分布，其富集谱锚定在梯度的一端（图2）。与此模式一致，如我们的PermCCA细胞类型载荷所反映，梯度1（r = 0.615, P = 0.004）与SNCG、SST和L5 IT的正相关性最强，与L4 IT的负相关性最强。这里，细胞的顺序反映了它们与梯度1的单变量相关强度顺序（图2a）。梯度2（r = 0.528, P = 0.026）与L4 IT的正相关性最强，L4 IT在Lake数据集中与Ex4相匹配（扩展数据图3）。Ex4也是与梯度2的细胞多变量相关性的主要贡献者（扩展数据图7和补充图3）。
图3：多变量细胞谱遵循皮层的宏观组织。
a, 散点图显示了PermCCA（置换典型相关分析）的结果，其中第一个功能梯度与细胞类型丰度的复合分数呈正相关（95% CI）。
b, 与第一个功能梯度相关的细胞类型复合分数投射到皮层表面。
c, 每种细胞类型对复合分数的典型载荷表明SNCG、SST、L5 IT、少突胶质细胞（Oligo）、第6b层兴奋性神经元（L6b）、星形胶质细胞（Astro）、第5/6层近投射兴奋性神经元（L5/6 NP）、L4 IT和内皮细胞（Endo）的参与（红色，正相关；蓝色，负相关）。
d, 第二个功能梯度与细胞类型丰度的复合分数呈正相关（95% CI）。
e, 与第二个功能梯度相关的细胞类型复合分数映射到皮层表面。
f, 每种细胞类型对复合分数的典型载荷显著地牵涉到L4 IT、第5层脑外投射（L5 ET）、VIP和L6 CT。a和d中的P值是在校正两次比较后通过双侧旋转检验计算的。c和f中的点表示经过FDR校正后的显著载荷。
虽然在孤立分析中与梯度相关的细胞类型在多变量分析中也优先关联，但使用复合分数解释的方差现在从单变量分析中的17.9%（梯度1；图2c）增加到37.8%（梯度1）和27.8%（梯度2；图3a, d）。因此，观察到的拓扑相似性可能并非特定于孤立的细胞类别，而是在考虑皮层多种细胞类型的组合空间谱时最为明显。为了检验这一想法，我们迭代重复了PermCCA，排除了反映梯度1和2主要贡献者的不同细胞组合（补充表1-3）。关键的是，当同时移除单变量分析中揭示的所有与梯度显著相关的细胞类型（梯度1：SNCG、SST、L5 IT和L4 IT）时，梯度1的PermCCA结果仍然成立（r = 0.503, P(FDR) = 0.002）。因此，虽然某些细胞类型可能优先遵循皮层的梯度结构，但观察到的空间关系是稳健的，并且在多种细胞类型中广泛保守（见补充图4和5中的细胞类型丰度相关矩阵）。
大规模功能网络的细胞组成
某些细胞类型可能与特定的功能网络有优先关系，这暗示了存在支持特定网络专门化属性的计算模块。为了评估这些网络-细胞关系，我们计算了每种细胞类型在七个经典功能网络中的富集分数（见方法部分）。为便于解释，我们将具有相似细胞富集谱的网络和具有相似网络富集谱的细胞类型通过层次聚类进行分组（图4a和Lake数据集见扩展数据图8）。细胞类型层次聚类的主要分歧遵循与梯度1相关的细胞类型（图2a和3c）。大多数中间神经元和支持细胞广泛分布于单模态或跨模态端的网络中，如聚类1、2、6和8所示。其中，SNCG、枝状小白蛋白表达中间神经元（Chandelier）、少突胶质细胞（Oligo）和微胶质细胞/血管周巨噬细胞（Micro/PVM）在边缘网络中显著富集。
图4：大规模功能网络表现出独特的细胞谱。
a, 该表显示了每个经典功能网络内的相对细胞类型富集或缺失情况。为便于观察，具有相似细胞富集谱的网络和具有相似网络富集谱的细胞类型通过层次聚类进行分组。字母（A, B, C）和数字（1-8）分别表示网络和细胞类型聚类。细胞类型名称按大类颜色编码，中间神经元为粉色，非神经元细胞为橙色，兴奋性神经元为绿色。每种细胞类型的经验丰度在七个大规模功能网络内进行聚合。相应的零分布由分区级旋转检验构建，该检验考虑了空间自相关。表格填充色反映了z分数，通过从观察到的经验丰度中减去零分布的均值，然后将差值除以零分布的标准差得出。这里的z分数表示相对于零分布的经验富集。暖色表示正值（相对富集），冷色表示负值（相对缺失）。每个单元格中的数字代表通过控制空间自相关并对24次比较进行校正的双侧旋转检验计算的相关P值。反映了从体感/运动网络到边缘网络存在一个细胞类型富集梯度，每个网络都显示出独特的细胞类型谱。标记的框反映了显著的富集（P < 0.05）。
b, 每个网络的24种细胞类型的z分数极坐标图表明，可能存在可用作区分每个功能网络的指纹的细胞谱。分数>0的线（虚线）表示相对于皮层分区的整体分布，某个细胞类型在特定网络内富集，而分数<0则反映该细胞类型的相对缺失。
兴奋性神经元显示出相对特定的网络富集模式（聚类3、4、5和7），暗示了可能支撑相关网络功能的细胞基序。例如，聚类4中的L5 IT和L2/3 IT优先分布在参与自上而下注意定向和执行过程的背侧注意和额顶网络中。L5 IT的树突终止于L2/3 IT层，后者的轴突反向靶向第5和第6层。在聚类5中，表达血管活性肠肽的中间神经元（VIP）、第6层端脑内投射兴奋性神经元（L6 IT）和第6层皮层-丘脑投射兴奋性神经元（L6 CT）倾向于在参与自下而上感觉驱动的注意/反应的体感/运动和腹侧注意网络中共同富集。L6 CT主要由来自高阶皮层区的IT支配，部分由局部和丘脑投射支配，而L6 IT倾向于与第6层的局部神经元建立相互连接。在聚类2中，Chandelier、表达LAMP5和LHX6的中间神经元（LAMP5 LHX6）和Car3样第6层端脑内投射兴奋性神经元（L6 IT Car3）在腹侧注意和边缘网络中（边际）富集。与靶向锥体细胞胞周域并广泛促进兴奋-抑制平衡的快速发放PVALB不同，规律发放的Chandelier优先支配轴突始段，从而加强输出控制。尽管Chandelier可以存在于第2-6层，但LAMP5 LHX6与L6 IT Car3更专门地位于同一层。
图4a的列显示了每个大规模功能网络中跨细胞类型的富集谱。与其功能拓扑和/或空间邻近性一致（图1a, d），体感/运动、视觉和背侧注意网络被归为聚类A，而默认和额顶网络被归为聚类B。功能和空间上独特的腹侧注意和边缘网络被归为聚类C。值得注意的是，腹侧注意网络中存在一种混合的细胞组成，其中单模态和联合区域的特性都显而易见。虽然腹侧注意网络主要遵循边缘系统的细胞谱，但它也以与体感/运动网络大致一致的方式显示出L6 IT、VIP和L6 CT细胞。
除了从单模态到联合区域的细胞丰度梯度外，如图4b的极坐标图所示，视觉上独特的网络级富集谱也很明显。位于第一个功能连接梯度（图1b）的不同端点，单模态的体感/运动网络和边缘网络在各种细胞类型中都表现出最高或最低富集谱之间的最大对比，腹侧注意网络在细胞富集中也表现出显著的变异性。总的来说，功能网络中存在独特的细胞指纹，这表明从死后组织样本中得出的细胞谱可能反映并能预测给定皮层分区的功能归属。
在死后组织中预测网络归属
我们的发现提出了一个重要问题——从大块组织样本中推算的细胞谱能否用于直接推断大脑组织的体内特性？上述分析确定了优先遵循皮层网络拓扑的单个细胞类别，暗示了存在网络特异性的细胞指纹。我们以此为基础，直接检验分区级细胞谱在多大程度上可用于预测其相应的功能网络分配（通过fMRI得出）。我们训练了支持向量机（SVM）来根据分区级细胞丰度预测死后组织样本的网络归属（方法）。我们将根据经验数据训练的模型的性能与一套日益严格的综合零模型进行了比较——(1) 假定分区来自特定网络时的理论正确预测概率（1/7，P(chance)），(2) 随机置换网络标签（P(perm)），或 (3) 在控制空间自相关的情况下打乱标签（P(spin)）。在这里，我们将解释重点放在最严格的显著性零模型上（P(spin)；备选显著性阈值和Lake数据集见图5和扩展数据图9）。
图5：大规模功能网络的分配可以由死后组织中的细胞类型丰度预测
a, 直方图显示了SVM的召回率，即正确将一个分区分类到相关网络的概率。这些数据表明，分类器能够以显著高于偶然水平的概率预测体感/运动、腹侧注意和边缘网络。深色分布由1000个在真实网络标签上训练的分类器构建，而浅色分布代表在通过控制空间自相关的旋转检验打乱的网络标签上训练的分类器。实线表示中位数，虚线表示分布的四分位数。经验召回率的P值由日益严格的双侧检验构建——(1) 理论机会（1/7，P(chance)），(2) 在随机置换的网络标签上训练的模型（P(perm)），或 (3) 通过旋转检验打乱的标签（P(spin)）。
b, 跨皮层分区的网络分配准确率，由所有测试集计算得出。
c, 混淆矩阵的每一行代表特定网络中被预测属于七个网络中每一个的分区比例。对角线代表每个网络内被正确分类的分区百分比。这里的混淆矩阵表明，体感/运动、视觉和边缘网络具有优先独特的细胞谱。虽然其余联合皮层网络的分类准确率较低，但背侧注意、默认和控制网络在彼此之间的误分类率高于与单模态网络的误分类率。
SVM模型成功解码了整个皮层的分区级网络分配（经验F1中位数 = 0.377，零模型F1中位数 = 0.231，P(spin) = 0.001；分布图见补充图6），表明从切除的死后组织推断出的细胞丰度反映了大脑组织的功能相关特性。在考虑单个网络时，在分区级推算细胞密度上训练的SVM模型成功预测了体感/运动（P(spin) = 0.023）、视觉（P(spin) = 0.036）、腹侧注意（P(spin) = 0.026）和边缘（P(spin) = 0.038）网络（所有其他P(spin) > 0.084；图5a）。当将分区级准确率投射到皮层表面时（图5b），网络内变异性很明显，表明细胞组成的空间异质性以及相关的网络级分配准确率（补充表4）。图5c中的混淆矩阵突出了体感/运动、视觉、腹侧注意和边缘网络的分配稳定性。值得注意的是，虽然在其余三个网络中分配准确率降低，当额顶、背侧注意和默认网络的分区发生误分配时，它们很可能被分配到其他相邻网络。例如，位于体感/运动和额顶网络之间的背侧注意网络更可能被误分配为这两者之一。由技术重复数据集和不同数据排除标准得出的SVM结果显示在补充图6-12中。总之，这些数据证实了某些功能系统中存在独特的细胞指纹，并支持需要对网络拓扑的细胞构筑决定因素进行更多研究。
讨论
基于文献中关于大脑皮层灰质组织学结构存在区域性差异的首次观察，对死后组织样本的切除揭示了关于中枢神经系统细胞组成的核心见解。最近，方法学的进步使得在体内绘制大脑功能宏观组织成为可能，为深入理解皮层组织的遗传、分子和细胞基础提供了潜力。在此，我们整合了转录组和神经影像数据，证明了推算的细胞类型分布遵循皮层的层级功能结构。我们发现，特定的细胞类型在空间上与皮层梯度和网络组织的某些方面耦合，这在区分高阶联合区域和单模态区域时最为明显。多变量细胞指纹捕捉了功能梯度拓扑和分区级网络分配中相当大一部分的空间变异性，这表明细胞谱的区域差异可能反映了皮层组织的层级方面。最后，从死后组织中得出的推算细胞类型密度可用于准确预测分区级的网络分配，证明了通过rs-fMRI评估的网络级大脑功能存在细胞标记物。总之，这些结果表明，皮层的功能组织与其细胞类型分布的空间变异性之间存在密切联系，这对于研究健康与疾病状态下大脑功能的细胞基础具有重要意义。
特定的细胞基因标记物可能在空间上与fMRI信号变异性的区域差异耦合。单标记物和多基因细胞反卷积已经建立了体内fMRI信号振幅的遗传方差与死后脑组织中小白蛋白表达拓扑结构之间存在空间依赖关系。在这一工作的基础上，我们证明了区域细胞密度与皮层功能梯度结构之间存在空间对齐。大多数抑制性中间神经元广泛地遵循这种宏观结构。SNCG（在Lake数据集中为CCK/In1）和SST优先与主梯度（梯度1）的跨模态端对齐，而PVALB通常在单模态及邻近区域丰度较高。这些中间神经元群组之间存在的二分关系，嵌入在层级的体感/运动-联合梯度中，呼应了它们在早期胚胎发育过程中的定位。 注定分化为中间神经元的细胞类型源自腹侧端脑内不同的胚胎祖细胞区。CGE中的神经祖细胞产生SNCG (CCK)，而背侧和腹侧MGE的祖细胞则沿着反相关的空间梯度产生SST和PVALB。神经发生后，这些大的细胞类别受到独立的转录级联的调控，这些级联指导它们进行切向迁移、层特异性定位和成熟，并具有独特的形态-电学特性。理论上，单模态和异构模态联合区域的不同计算特性被认为反映了相关细胞类型的相对优势及其在感觉和认知中的专门化作用。
SNCG、SST和PVALB在一系列形态和发放特性上有所不同，形成了能不同程度地影响网络振荡的独特局部回路。作为一种快速发放的篮状细胞，PVALB具有多极树突和放射状排列的轴突，这些轴突广泛地与皮层投射神经元的胞周区形成突触，以调节输出。啮齿动物的计算模型表明，相对于SST，PVALB的相对增加可能导致对皮层特定区域内兴奋性神经元的更强反馈抑制。这种兴奋性特征被认为能够实现较短的激活时间尺度，可能最适合处理快速变化的感觉运动刺激。相反，SNCG细胞包含CCK中间神经元，它们表现出广泛的发放模式，从可能增强抑制精确定时的同步传递，到被认为调节抑制强度和信号持续时间的异步重复激活。这种宽泛的发放谱非常适合联合皮层，使其能够整合来自不同来源的信号。尽管未来的建模工作是必要的，但这些数据表明，局部细胞回路的迁移和成熟与更广泛的功能系统的后续发展和完善之间存在联系。在这里，我们确定了与成人功能梯度相关的细胞类型。尽管这些细胞类别在生命早期就到达了它们的皮层目的地，但相关的发育和成熟轨迹会一直延伸到青春期。细胞成熟、精炼和突触连接如何与整个生命周期的皮层组织联系起来，仍有待确定。
嵌入在跨越皮层的广泛细胞和转录梯度中，特定的功能网络共同富集了不同的兴奋性和抑制性神经元群组，这可能反映了相应的计算基序。L4 IT细胞富集于单模态感觉区域，尤其是初级视觉皮层，主要分布在第4层（如果区域层状结构中缺少第4层，则为第3/5层），该层高度专门化用于处理传入的感觉信息。在啮齿动物中，L4 IT的树突简单，不成簇，适合接收来自投射到第4层的丘脑神经节细胞的视觉信号。L4 IT的局部轴突主要向上投射到第2/3层的IT神经元，作为前馈通路的一部分，最终投射到联合区的第5层。在这里，L2/3 IT和L5 IT由于它们在各网络中共享的富集谱而被聚类到同一细胞组。这在参与自上而下注意定向和执行功能的背侧注意和额顶网络中尤为明显。L5 IT的树突终止于L2/3 IT层，后者的轴突反向靶向第5层。虽然L5 IT和L2/3 IT之间的细胞间连接模式需要进一步研究，但观察到的共同富集谱表明，可能存在支持跨联合网络的自上而下过程的神经回路。同样，L6 IT、L6 CT和VIP在支持自下而上感觉驱动的注意/反应的体感/运动和腹侧注意网络中共同富集。与上层的IT不同，L6 IT缺乏终止于第1-4层的簇状树突，但与第6层的局部神经元具有相互连接。同样位于第6层的L6 CT细胞接收来自局部和“高阶”皮层深层IT的信号，并向丘脑发送传出投射。分布在第2和第3层的规律发放VIP，其树突和轴突广泛延伸至第1-6层。VIP主要调节其他中间神经元，可能间接促进了这些过程。突显/腹侧注意网络与成人样皮层组织的加速成熟有关。在此，注意网络中中到深层细胞类型的共同富集可能暗示了皮层发育的潜在机制，因为转录程序在发育阶段的细胞类别内是协调的。未来的工作应直接检验皮层网络支持的专门化认知过程是如何从空间上独特的细胞连接基序中涌现出来的。
皮层的大规模网络结构包括嵌入在连续功能梯度中的突变。广义上说，在通过细胞染色和形态学分析定义的皮层图谱中也存在类似的模式，其中在局部区域内可见同质的细胞成分，而在一些相邻区域之间可能发生突变。新兴证据表明，皮层的体内网络划分与某些细胞构筑边界的存在有关。在这里，功能网络定义的边界和分区被观察到与特定的组织学定义区域相符，包括布罗卡区（第44区）和中央后沟的某些部分（第2和第3区）。在目前的分析中，我们使用死后组织中神经元和非神经元细胞的推算丰度，证明了皮层分区的网络归属通常是可以预测的。尽管分区级的预测在整个皮层普遍存在，但在连接细胞谱与网络分配的关系中，存在着显著的空间异质性。体感/运动、视觉、边缘和腹侧注意网络表现出最独特和可预测的细胞谱。这种预测谱的出现，是通过体感/运动、视觉和边缘网络中细胞相对于其他网络的优先富集或缺失，以及腹侧注意相关分区中存在单模态和跨模态相关细胞的独特混合而产生的。相比之下，控制、背侧注意和默认网络在各种细胞类型中显示出更平滑和/或更同质的空间过渡。这种模式可能反映了联合网络边界附近存在平滑的细胞组成模式，这与先前关于皮层转录独特性的报告一致。这些数据突出了多尺度神经科学方法的转化潜力，证明了连接整个皮层细胞谱与人脑体内功能组织之间的预测关系。
局限性：
在解释当前工作时应考虑几个局限性：
首先，报告的细胞类型丰度是根据从snRNA-seq构建的基因表达特征，从大块组织的微阵列数据中推算出来的。微阵列方法不提供基因转录的直接估计；相反，我们检查的是样本间探针内的差异。为获得跨供体稳健的估计，需要将大块样本聚合到分区中，这限制了空间分辨率。随着分区和细胞类型定义的改进，观察到的模式可能会展现出更多细节。
其次，我们通过使用额外的单细胞数据，对我们的细胞推算方法进行了技术性重复验证。推算方法之间的相关对应关系在补充材料中报告。值得注意的是，可用组织样本缺乏空间粒度，可能导致对连接细胞类型拓扑分布与大脑功能之间真实关系的低估。在小鼠中，中间神经元细胞类型在皮层区域间广泛保守，而锥体细胞的多样性则显示出更高的空间变异性，这在文献38中来自八个皮层区域的人类数据中得到部分反映。在可用的单细胞样本中常见的细胞类型的推算空间分布显示出稳健的模式，但细胞类型的多样性如何在整个人类皮层中变化尚不清楚。随着覆盖更多皮层区域的单细胞样本逐渐被开发出来，未来的工作在考虑细胞丰度时应纳入这些空间变异的谱系。
最后，在目前的工作中，细胞是根据转录组学定义的。尽管初步研究检查了转录谱、形态或发放模式，并证明了多模态特征与广泛的转录细胞类型（24个细胞类别）之间存在可靠的映射，但这些广泛类别内的更精细聚类显示出细微的形态-电学多样性。后续研究应考虑如何在分析中最好地整合这些多样化细胞定义的层级结构，同时也要考察体内脑功能组织的其他组织模型。
总结：
目前的结果表明，大脑皮层的功能梯度和网络与细胞谱的空间变异性有关。这些数据表明，从死后组织推算的细胞类型密度捕捉了通过rs-fMRI评估的FC的全局模式，揭示了在研究人脑功能时，有可能在体内和离体方法之间架起桥梁。总的来说，这些发现突出了皮层的功能组织与其细胞基础之间的联系，对于理解健康与疾病状态下大脑功能的细胞基础具有重要意义。