正文
人脑在受孕后开始其复杂的发育过程，最初是一个简单的神经管，随后弯曲、折叠和扩张，其中一部分最终形成新皮层特征性的褶皱。在妊娠期间，在形态发生素和转录因子梯度的驱动下，神经管沿吻尾轴（rostrocaudal axis）进行模式形成。此后不久，丘脑皮层轴突开始迁移进入皮层板。对这一交织过程的认识引出了两种有影响力的观点——原图（Protomap）理论和原皮层（Protocortex）理论——关于新皮层如何在发育过程中分别受遗传或丘脑的引导分化为不同的功能区域。目前的共识是，内在（基因）和外在（丘脑）机制共同驱动皮层发育，但将丘脑的作用仅仅视为感觉经验的中介可能过于简化了。
事实上，一方面，大多数感觉信息在到达新皮层之前都会经过丘脑，这使得该皮层下结构处于调节影响皮层分化的外部信号的战略位置。例如，感觉刺激的暴露加速了新生儿大脑的初始突触可塑性，并通过与丘脑的密集相互作用逐渐塑造功能特化。另一方面，受轴突导向分子和转录因子的影响，丘脑核团在发育过程中也形成通往特定皮层区域的直接拓扑投射，这一过程对新皮层的区域分化至关重要。鉴于其重要作用，丘脑皮层连接在生命早期新皮层功能特化中的确切参与情况仍是一个悬而未决的问题。
新皮层功能特化的一个核心原则是它遵循感觉-联合轴，即低级感觉区域的成熟先于高级联合区域（如额顶网络和默认模式网络）的扩展。这一原则也反映在丘脑皮层连接的发育中，即与感觉运动和突显网络的连接在新生儿中已经建立，而与额叶和默认模式网络的连接则发育较晚；然而，由于丘脑由数十个核团组成，要了解其在宏观皮层景观中的全局整合（超越单个亚核团的区域属性）已被证明具有挑战性。最近基于降维的连接拓扑梯度映射（connectopic gradient mapping）技术提供了一个可行的解决方案，因为它们将大脑区域（全脑或特定皮层区域，如丘脑）的高维连接组特征总结为代表其核心功能组织的简约轴。
先前使用该技术的研究报告了一个从一端的与感觉相关的、外向导向的加工，到另一端的与刺激无关的、内向导向的加工的层级梯度。值得注意的是，最近的一项研究显示了这种新皮层组织的年龄依赖性转变，其中儿童期主要锚定在单模态皮层内的主要功能轴在青春期转变为类似成人的层级梯度；然而，早期丘脑皮层相互作用对大规模组织发育的影响仍未被描绘出来。具体而言，目前尚不清楚丘脑皮层梯度是否镜像了皮层-皮层梯度的层级组织（或表现出独特的皮层下特异性连接模式），以及什么样的计算原则构成了丘脑介导的大脑网络生成的基础。
本研究调查了丘脑皮层功能连接的宏观组织及其在婴儿期和儿童期/青年期皮层网络发育中的作用。首先利用连接拓扑梯度映射提取丘脑皮层连接的连续轴，并在不同年龄组中进行分析。然后通过基因本体（Gene Ontology）富集分析表征皮层基因与丘脑新皮层投射图谱之间的关联。最后，我们利用生成网络建模方法来模拟丘脑和遗传信息在大规模功能网络组装中的作用。
通过这种多方法途径，我们发现：
（1）在婴儿期，丘脑皮层梯度既能捕捉到初步的皮层层级，也能捕捉到发育基因表达的空间分布；
（2）从儿童期到青年期，丘脑皮层功能耦合在区分内向和外向导向的功能网络中承担了独特的作用。事实上，丘脑与突显网络的功能连接作为一个关键点，在此处，外向导向（例如视觉/感觉运动和背侧注意网络）和内向导向（例如默认模式网络）系统之间的分离在发育过程中逐渐显现；
（3）生成网络建模表明，当基于丘脑皮层功能连接构建合成网络时，它们表现出与源自实证数据的网络最高的相似度。综上所述，最初在功能网络特化中，丘脑和发育相关基因之间似乎存在平衡的贡献；然而，当进入青年期时，这种平衡发生转变，丘脑通过外部和内部网络的解耦促进了功能分离。
结果
我们利用了来自人类连接组计划（HCP）的两个年龄组数据集，包括婴儿期（n=255，149名男性；平均（标准差）年龄=39.7（3.04）周；发育中的HCP（dHCP））和儿童/青年期（n=603，417名男性，平均（标准差）年龄=14.8（3.88）岁；HCP-Development（HCPD）]）。关于参与者纳入和后续主要分析的详细信息在“方法”中提供，并在图1中进行了示意性总结。
图1 神经影像学、转录组学和计算模拟的分析流程
a，使用连接拓扑映射（Connectopic mapping），一种降维技术，来总结复杂的丘脑皮层连接拓扑结构（i）。然后在婴儿期和儿童/青年期组内测试丘脑皮层图谱的年龄效应（ii）。根据Yeo-Krienan 7网络图谱[^28]对丘脑和新皮层的图谱进行剖析。
b，使用偏最小二乘法（PLS）分析量化新皮层投射图谱与源自艾伦人脑图谱（AHBA）的基因表达空间模式之间的关联（i-ii）。使用保持空间自相关的表型零模型（10,000次旋转）测试显著性（iii）。通过PLS分析鉴定的显著基因集被排序，然后提交给基因本体富集分析，以基于BrainSpan图谱表征跨发育阶段的潜在生物学过程和细胞类型特异性表达。
c，利用生成网络模型来研究在估计连接成本如何塑造功能连接组拓扑时，丘脑皮层、遗传和空间约束的影响。SBP，空间大脑表型。
丘脑皮层连接拓扑映射
为了描绘丘脑皮层功能连接的宏观组织，我们将Congrads流程应用于静息态功能磁共振成像（fMRI）的时间序列。简而言之，它对丘脑和皮层之间功能连接的相似性矩阵应用拉普拉斯特征映射（Laplacian Eigenmap）降维。由此产生的丘脑皮层连接拓扑图（CMAPs）在拓扑上代表了丘脑体素间丘脑皮层连接模式的相似或不相似程度，而新皮层投射图（NEOMAPs）则显示了CMAP在皮层上的对应部分（即哪个丘脑区域在功能上连接到哪个新皮层区域）。
丘脑皮层连接拓扑梯度
婴儿期（29-44周；图2a）和儿童/青年期（8-22岁；图2b）的两个组水平CMAP（“丘脑的功能梯度”；根据解释的方差选择图的数量；补充图1）如图所示。CMAP1显示了一个横跨丘脑前/内侧到后/外侧末端的梯度。这一模式在两个年龄组中相对一致（图2；上图），并根据Yeo 7网络丘脑分区大致传达了低级和高级功能网络之间的分化（补充图1）。此外，这种模式显示出与最近一项分析丘脑转录组学和结构连接的研究结果有显著的相关性（补充图2）。CMAP2（图2，下图）在婴儿期包含一个从上到下轴的梯度，虽然总体方向（上到下）在儿童/青年期保持不变，但梯度的下部在后一个年龄组中倾向于向前部和后部区域发散。为了测试稳健性，我们使用了一个独立的数据集（Nathan Kline Institute-Rockland样本（NKI-RS）；n=70（34名男性），年龄范围6-19岁），发现了类似的CMAP模式（HCPD和NKI-RS之间的相关性，两个CMAP的r > 0.70；扩展数据图1a）。
图2 丘脑连接拓扑图及其新皮层投射图
a, b，显示了婴儿期（a）和儿童/青年期（b）的CMAP（丘脑皮层连接拓扑图） 1和2以及NEOMAP 1和2。基于Yeo-Krienan 7网络图谱分类的网络概况显示在每个NEOMAP旁边的箱线图中，并叠加了随机点（顶点数：VIS=2,770，SOM=3,784，DAN=2,118，SAL=2,250，LIM=1,437，FPN=2,317，DMN=3,819）。箱线图显示中位数（中心线）和四分位距（IQR；箱体的范围）。须线延伸至第三四分位数上方1.5倍IQR内的最大值和第一四分位数下方1.5倍IQR内的最小值。IQR代表第25和第75百分位数之间的范围。
c，描绘了源自儿童/青年期NEOMAP的外向到内向轴划分的示意图，以及Yeo-Krienan 7网络图谱的图例。
VIS，视觉网络；SOM，体感网络；DAN，背侧注意网络；SAL，突显网络；LIM，边缘网络；FPN，额顶网络；DMN，默认模式网络。
值得注意的是，我们分析的婴儿期HCP数据集是在睡眠期间获取的，而儿童/青年期的数据集是在清醒状态下收集的。为了研究这种潜在的状态依赖效应，我们进一步分析了一个单独的数据集，该数据集包含个体在睡眠和清醒状态下的扫描（见补充说明“睡眠-清醒状态的比较”）。我们证实目前的发现并非源于状态差异，而是反映了发育时期的差异（扩展数据图2）。同样，由于已知丘脑调节唤醒和活动水平，我们证实我们的主要结果在全脑信号回归后得以复现（补充图3）。
丘脑新皮层投射图
婴儿期和儿童/青年期的NEOMAP（CMAP（丘脑皮层连接拓扑图）的新皮层对应部分）显示出跨发育时期的总体发散模式（图2），这表明丘脑与新皮层功能组织之间的关系发生了转变。
在婴儿期，第一个NEOMAP（新皮层投射图）显示锚定在低级感觉和视觉区域，而另一端则显示出大脑区域间分化较少的模式（图2a，上图）。这一基于成人分区得出的结果在使用年龄匹配的、完全数据驱动的婴儿分区时得到了复现（补充图4）。第二个NEOMAP描绘了一个强烈的几何模式，似乎直接反映了第二个丘脑CMAP的背腹流（图2a，下图）。与此同时，在儿童/青年期，NEOMAP显示出分化更明显的模式（空间上局限于已知的功能分区），表明成熟功能网络的出现（图2b）。具体而言，两个NEOMAP共同显示突显网络位于梯度的一端，而NEOMAP的另一端则截然不同：NEOMAP1延伸向外向导向的区域，如背侧注意和初级感觉网络（图2b，上图），而NEOMAP2主要由内向导向的默认模式网络占据（图2b，下图）。综上所述，丘脑皮层投射似乎参与了一个大规模组织，其中突显网络作为区分外部和内部轴的关键点（图2c和扩展数据图3）。这在两个NEOMAP之间的空间表征及其模式在NKI-RS数据集中得到了复现（HCPD和NKI-RS之间的相关性，两个NEOMAP的r ≥ 0.70；扩展数据图1b）。
丘脑对外部-内部轴分离的影响
为了进一步证实上述假设，我们量化了几个网络层面的指标。首先，我们通过计算突显网络与外向导向区域（SegregationSAL-EXT）以及内向导向区域（SegregationSAL-INT）之间NEOMAP值的差异，在五个不同的年龄组中创建了一个分离指数（图3a）。正如预期的那样，与婴儿期相比，儿童/青年期的突显网络与外向及内向导向网络之间的分离度更高。这表明外部-内部轴在儿童/青年期显现得更为突出。为了证实这一观察结果，我们采用了两个统计估计网络分离程度的指标（轮廓系数和网络重叠），结果证实儿童/青年期的功能网络比婴儿期的更加分离（扩展数据图4和补充说明“网络分离的定量分析”）。
图3 丘脑皮层对皮层网络分离的影响
a，外部-内部网络分离的量化及其随年龄亚组的变化概况。外部和内部轴之间的分化直到儿童/青年期才清晰显现。第一个NEOMAP（新皮层投射图）代表突显网络与外向导向网络的分离，而第二个NEOMAP显示与内向导向网络的分离。箱线图显示中位数（中心线）和IQR（箱体的范围）。须线延伸至第三四分位数上方1.5倍IQR内的最大值和第一四分位数下方1.5倍IQR内的最小值。IQR代表第25和第75百分位数之间的范围。每个年龄组的参与者人数如下：婴儿期（29–37周(w)，n=49；37–40 w，n=59；40 w，n=47；41 w，n=48；42–44 w，n=52）和儿童/青年（8–10岁(y)，n=81；10–13 y，n=125；13–16 y，n=173；16–20 y，n=141；20–22 y，n=83）。
b，使用双尾偏最小二乘（PLS）回归评估儿童/青年期NEOMAP（新皮层投射图）与核心-基质丘脑投射之间的关联。通过将潜在得分的实证相关性与从PLS的空间置换检验（10,000次迭代）生成的零分布进行比较来确定统计显著性，以控制空间自相关（Pspin = 3.05 × 10^−25）。NEOMAP，新皮层投射图；SAL，突显；EXT，外部；INT，内部；CALB，钙结合蛋白；PVALB，小清蛋白。
最后，与倾向于更加区域局限的外向导向网络（视觉和体感网络）相比，那些用于内部过程的网络似乎在大脑皮层招募了广泛分布的区域。这种分化可能反映了基于“核心（Core）”和“基质（Matrix）”细胞相对密度的潜在丘脑投射的不同模式。富含小清蛋白（parvalbumin）的核心细胞主要位于感觉丘脑核团，投射到初级感觉皮层的特定区域，而富含钙结合蛋白（calbindin）的基质细胞在高级丘脑核团中更为常见，更弥散地投射到整个皮层。使用偏最小二乘（PLS）分析，我们发现NEOMAP与基于细胞构筑的核心和基质细胞的丘脑投射之间存在显著关联（r=0.65，Pspin=3.05×10^−25）。此外，功能性和细胞构筑性丘脑投射的潜在结构之间的相关性揭示了一个外部-内部轴，其中突显网络位于分布的中间（图3b）。
CMAP（丘脑皮层连接拓扑图）和NEOMAP（新皮层投射图）的年龄依赖性变化
丘脑皮层CMAP和NEOMAP显示出显著的年龄效应（扩展数据图5和补充说明“丘脑皮层连接拓扑梯度和投射图的年龄相关差异”以获取以下结果的统计细节）。具体而言，在婴儿期，CMAP的每一端都发生了随年龄增长的整体扩展（更多的功能分化），因为前部区域的正梯度值显示正年龄效应，而丘脑后部的负梯度值显示负年龄效应，表明发散的年龄效应（PFDR < 0.05）。NEOMAP中也描绘了类似的模式（PFDR < 0.05）。在儿童/青年期，发现了相当一致的年龄效应，尽管与婴儿期相比要弱一些。与主要显示梯度扩展的婴儿期相反，儿童/青年期组在CMAP和NEOMAP上呈现出片状的年龄效应，表明随年龄增长既有扩展也有收敛（PFDR < 0.05）。补充视频中显示了梯度值随年龄的横断面渐进变化。
利用来自NKI-RS的纵向数据也观察到了这种年龄依赖性趋势。首先，在混合效应模型中（我们将年龄作为固定效应，参与者作为随机效应），我们检查了突显、外部和内部网络之间的分离指数。我们的分析揭示，在发育过程中，突显-内部（t=2.35，P=0.02）和外部-内部（t=2.63，P=0.009）网络之间的分离显著增加，以及突显-外部网络（t=1.25，P=0.21；扩展数据图6a–c）的边缘趋势。其次，我们将监督学习框架（五折交叉验证）应用于同一纵向数据，以阐明丘脑皮层连接发育的早期影响对后期发育阶段新皮层网络分化的作用。我们发现基线和随访之间丘脑皮层NEOMAP（新皮层投射图）的变化可以显著预测“皮层”梯度内内部和外部网络之间的功能分离（平均绝对误差=1.91；中位相关系数=0.33，P=0.005；扩展数据图6d）。
丘脑皮层投射图的转录组学分析
至此，我们已经表明丘脑皮层功能连接显示出具有独特模式的广泛新皮层投射，反映了皮层网络的大规模功能组织。简言之，婴儿期NEOMAP1揭示了低级感觉和高级跨模态区域之间的初步分化，而儿童/青年期的NEOMAP共同描绘了参与外向与内向导向过程的功能网络之间的分离，这两者都以突显网络为锚点。相比之下，婴儿期NEOMAP2（图2a，下图）在生物学含义方面尚不清楚；然而，其沿背腹轴的分级表达类似于发育中新皮层的特征性区域模式化，这通常由形态发生素和转录因子驱动。为了证实这一观察结果，我们利用艾伦人脑图谱（AHBA）和PLS分析（一种无监督多变量相关方法），检查了其与皮层基因表达的关联。为了将多变量遗传关联置于生物学过程的背景下，我们使用ShinyGO v.0.77进行了基因本体富集分析。最后，我们使用BrainSpan数据集进行了细胞类型特异性表达分析（CSEA），以比较跨多个发育时期的发育表达谱。
基因表达与婴儿期NEOMAP2之间的关联揭示了一个单一的潜在变量，该变量在保留原始空间自相关的旋转测试后是显著的（r=0.65；Pspin < 0.001）。该潜在变量解释了NEOMAP2中41.7%的方差。事后载荷分析揭示了总共813个具有负载荷和负载荷的强贡献基因。进一步的基因富集分析显示，候选的负相关和正相关基因主要涉及不同的潜在生物学过程。值得注意的是，从中枢神经系统的发育（错误发现率（FDR）= 0.0008），到头/脑发育（FDR = 0.002），再到参与神经元分化的细胞形态发生（FDR = 0.008），涉及中枢神经系统发育的多个过程都与负相关基因有关（图4a和补充表1）。这些结果使用其他基因本体富集工具Enrichr和g:Profiler得到了复现（补充图5）。为了证实我们发现的特异性，我们采用了严格的零-脑-基因模型，该模型基于随机选择的在脑组织中过表达的基因（n=2,711，通过qFDR < 0.05筛选，在比较脑组织和其他身体组织时）生成零分布。发育过程相关基因与婴儿期NEOMAP2之间的关联强于随机选择的脑基因的预期（β=0.49，Pnull-brain-gene < 0.001）。同时，具有正载荷的基因属于与跨膜转运过程相关的各种通路（补充表2）。
图4 显示与婴儿期NEOMAP2负富集基因有显著关联的生物学过程的顶级富集基因本体术语
a，显示使用ShinyGO 0.77得出的富集GO术语的图表。富集倍数（Fold enrichment）是衡量特定术语在感兴趣基因中相对于背景基因集过度表达程度的指标。FDR指示富集代表假阳性发现的可能性。
b，对于细胞类型特异性表达分析，我们的基因列表与在特定脑区和发育时期富集的转录本之间的重叠使用经过Benjamini–Hochberg校正的Fisher精确检验来确定。转录本表达的特异性通过跨越四个阈值（0.05, 0.01, 0.001 和 0.0001）的特异性指数P值（PSI）来评估，其中较低的PSI值表示这些基因对脑区和发育时期的特定组合更具特异性。从外到内的六边形大小分别对应PSI阈值（0.05, 0.01, 0.001 和 0.0001）。颜色表示经FDR调整的P值。
虽然由于AHBA具有广泛的全脑空间覆盖而被使用，但我们必须注意它源自六个死后成人大脑。因此，鉴于婴儿期和成年期之间基因表达的潜在差异，我们纳入了BrainSpan图谱的数据，该图谱涵盖了从受孕后8周到40岁的更广泛年龄跨度，尽管空间覆盖较少。使用CSEA检查这些基因在特定细胞类型中的发育表达谱，我们发现其在丘脑和皮层中集中表达，且从胎儿期到婴儿期显著富集（FDR < 0.05；图4b）。
计算建模分析
最后，为了从机制上理解丘脑皮层连接是否以及如何促进皮层功能组织的发育，我们利用了最近提出的生成网络建模方法。该模型使用定义的规则或约束来概率性地建立节点之间的连接，生成反映真实大脑网络基本特征的模拟网络。使用这种方法可以直接比较模拟的和实证的皮层网络，有助于阐明皮层组织的潜在原则。我们的主要兴趣是比较丘脑皮层连接和基因表达在功能网络生成中的相对影响。对于模型比较，我们根据先前的研究测试了相关空间和拓扑特征的影响。模型性能基于Kolmogorov–Smirnov（KS）统计量进行评估，该统计量根据节点度、节点聚类、节点介数和边长分布量化合成网络与实证网络之间的差异。
总的来说，基于发育因素（基因表达和丘脑皮层连接）的模型表现优于空间和拓扑因素（图5a和扩展数据图7）。丘脑皮层连接规则特别是在拟合儿童/青年期的实证数据方面产生了最佳效果（平均 KSthal=0.09，KSgene=0.16，KSspatial=0.45；图5a）。相反，基因表达和丘脑皮层连接规则在婴儿期表现出相似的性能（KSthal=0.20；KSgene=0.19；KSspatial=0.43；图5a）。我们进一步重建了源自模拟的个体邻接矩阵，并计算了组水平的皮层功能梯度、网络模块化和分离指数。值得注意的是，源自根据丘脑皮层连接规则构建的合成网络的功能梯度产生了与儿童/青年期典型皮层梯度极其相似的模式（图5b）。与基于其他规则的合成网络相比，基于丘脑皮层连接的合成网络在儿童/青年期发现了显著更高的网络模块化（模块化 Q=0.53；图5c）。最后，为了证实我们的实验发现，丘脑皮层模型在儿童/青年期显示出突显网络与外向导向以及内向导向网络之间最大的分离指数（图5d）。这在控制了由于NEOMAP和皮层-皮层梯度之间高度相似而可能导致的循环论证问题后（扩展数据图8），在不同的网络阈值下得到了复现（补充图6），并在一个独立数据集（NKI-RS；扩展数据图9）中也得到了复现。
图5 生成网络建模
a，使用KS统计量测量模型性能，其中较低的值意味着与实证数据具有更高的相似性。采用经Bonferroni校正调整多重比较、显著性阈值为P=0.001的双尾t检验来比较性能指标。对于婴儿期，基因与空间（t = −43.4, P = 2.2102 × 10^−119）以及丘脑皮层与空间（t = −24.4, P = 1.5961 × 10^−68）之间发现了显著差异，样本量（n）为255。基因与丘脑皮层布线规则之间没有显著差异（t = −1.4972, P = 0.14）。对于儿童/青年期，所有三个对比都发现了显著的组间差异：丘脑皮层与基因（t = −52.6, P = 2.6144 × 10^−227），丘脑皮层与空间（t = −288.8, P = 0）以及基因与空间（t = −249.5, P = 0），经过Bonferroni校正（n = 603）。
b，显示了针对每种不同布线规则从合成网络的亲和矩阵中提取的前两个皮层梯度。
c，使用ANOVA（n = 603）及Bonferroni校正分析了基于不同布线规则从每个合成网络计算出的网络模块化比较，结果显示婴儿期（F = 1,418.9, P = 1.2103 × 10^−257）和儿童/青年期（F = 516.56, P = 3.8966 × 10^−178）存在显著的组间差异。
d，显示了基于不同布线规则在婴儿期（n = 255）和儿童-成年期（n = 603）从个体合成网络计算出的分离指数，误差条表示标准差。
thalcort，丘脑皮层连接；gene，相关基因表达；SAL，突显网络；EXT，外向导向网络；INT，内向导向网络；w，周；y，岁。
接下来，为了进一步查明丘脑皮层连接对不同年龄段功能组织的直接影响，我们在通过一系列生长模型（一种利用年龄依赖性发育模式为网络模拟提供信息的方法；图6a）中对丘脑-突显连接进行了扰动。扰动被应用于不同的发育时期（8-12岁；12-16岁；16-22岁）或应用于所有时期，然后与无扰动生长模型进行比较。正如预期的那样，扰动损害了内部和外部轴的分离，但值得注意的是，它对突显-内部轴的影响更为剧烈，这表明丘脑皮层连接对青年期内部处理区域的发育有更高的贡献（图6b）。特别是，扰动在发育的较晚阶段（>12岁）产生了深远的影响，此时涉及默认模式网络的大多数高级认知功能正在积极发育。在跨不同发育时期的模拟皮层梯度中也观察到了类似的模式（图6c）。最后，一系列“零模型”验证了我们发现的特异性（即与对其他[初级感觉或随机选择的]连接的扰动相比，对丘脑-突显连接的扰动是否对网络分离产生更剧烈的影响）。结果表明，与零模型相比，对丘脑-突显连接的扰动导致网络分离度更低，皮层梯度分化更不清晰（扩展数据图10）。
图6 发育知情生长模型的扰动
a，基于随年龄跨度变化的丘脑-突显连接布线规则的生长模型示意图。与无扰动模型相比，测试了四个在不同发育年龄组扰动丘脑-突显连接的模型：(1) 应用于8–12岁年龄组的扰动；(2) 12–16岁年龄组；(3) 16–22岁年龄组；以及 (4) 所有年龄组。
b，计算每个生长模型的分离指数（突显-外部；突显-内部）。百分比表示与无扰动模型相比的差异量。
c，显示了从每个生长模型的模拟亲和矩阵中提取的皮层梯度。
讨论
大规模脑网络在发育过程中，其功能特化在连接组特征方面经历了广泛的变化。在本研究中，我们在实验和理论上都证明了丘脑在关联多个功能子系统中的年龄依赖性作用，特别关注于外向和内向导向的网络。我们发现，在婴儿期，丘脑为低级和高级区域之间的层级分化提供了功能支架，同时也与参与发育过程的皮层基因相互作用；然而，一旦皮层功能排列稳定成不同的网络，丘脑就会促进外向和内向导向系统之间的系统级分离。这些结果通过生成网络的计算模拟得到了证实。具体而言，丘脑皮层连接约束不仅产生了最逼真的皮层网络，而且有助于功能子系统之间的分离，并产生了与皮层-皮层梯度极为相似的连接拓扑结构。此外，对丘脑-突显连接的扰动在不同发育阶段对外部-内部网络分离和皮层梯度产生了不同的影响。综上所述，这些结果为丘脑在发育中的大脑大规模功能网络表现中的作用提供了广阔的视角。
婴儿期层级功能脑网络的发育
先前的工作已经确立了丘脑在脑结构组织早期发育中的作用。事实上，髓鞘和皮层厚度等结构属性在接收一级丘脑中继的皮层区域发育最早。与此同时，与高级丘脑中继相关的跨模态皮层的长期成熟显示出经验依赖的可塑性。在此，我们扩展了先前的发现，并揭示了婴儿大脑中的丘脑显示出主要锚定在感觉运动和视觉区域的新皮层功能耦合，而那些推测与高级区域相关的区域尚未完全特化。这种发育延迟可能是因为高级功能网络的形成前提是皮层各分布区域的整合，这反过来需要建立长程连接和贯穿整个儿童期的高效突触修剪。此外，我们的发现与丘脑和皮层区域之间特化连接的既定模式相一致。婴儿期NEOMAP1显示，低级感觉皮层区域与后/外侧丘脑区域（如枕核、内侧膝状体核和腹后外侧核，已知分别投射到视觉、听觉和体感区域）具有高连接性。另一方面，丘脑的前部区域（例如，前核、背内侧核和腹前核，这些已与高级功能相关联）表现出与前额叶皮层和后部联合区域的强连接。
在围产期，神经元之间的连接增强激增，随后是一个持续到青年期的更长时间的选择性修剪过程。在这个初始阶段，各种细胞机制如突触发生、轴突发生和树突分支构成了与出生后表面积扩张相关的动态变化的基础。在我们的研究中，婴儿期NEOMAP2显示出与富含相关过程（如轴突发生、神经元分化以及细胞投射形态发生和信号传导）的基因有关联。这与之前的研究相一致，这些研究支持丘脑轴突投射在新皮层区域形成和划定中的关键作用。或者，NEOMAP2中描绘的反映丘脑皮层连接拓扑模式的倾斜下-上轴可以根据双重起源（Dual Origin）理论进行解释。该理论将皮层分化的顺序进程概念化为起源于梨状皮层（古皮层）和海马（原皮层），并扩展到感觉运动和前额叶皮层区域，这同样促进了NEOMAP2的下-上轴。
儿童/青年期外部-内部轴的解耦
构成认知发展基础的皮层组织的一个核心方面体现在从感觉功能区域到联合功能区域的组织轴上。这一原则涵盖了与细胞构筑、结构连接和功能连接的皮层组织相关的广泛发育特征。我们的研究发现，这一原则总结在丘脑皮层功能的“两个主轴”中。
NEOMAP1从突显网络延伸到其他参与外向导向过程的皮层网络，如背侧注意和低级感觉区域。这些网络是由外部驱动的，本质上是相位的（phasic），意味着对特定感觉输入的这种选择性注意过程。在NEOMAP2中，一个内向导向的系统（如默认模式网络）位于突显网络的另一端。这种梯度可能代表了丘脑如何有助于塑造内部心理模型构建，或环境的生成模型。事实上，压后皮层（一个与默认模式网络密切相关的区域）显示出与前丘脑核团和海马的强连接，这些区域可能协调更新现有的心理表征。
至关重要的是，突显网络作为两个NEOMAP的关键组成部分，显示出跨越皮层更远距离和不同区域的整合连接，从而在促进多级系统之间的通信中发挥关键作用。它主要负责从外部世界的复杂感觉输入中选择与稳态最相关的信息，以不断更新我们的内部模型。这一过程需要协调外向和内向导向认知处理之间的大脑网络动力学，鉴于突显网络位于“感觉-离心”轴（sensory–fugal axis）中间的位置，它是最有能力做到的。总之，包含这些网络的丘脑皮层投射可能参与高突显性外部输入的选择和门控，以此作为分配注意资源和更新先前信念的手段。
丘脑皮层投射在发育中脑网络生成模型中的意义
基于神经影像学的发现，我们通过生成网络建模进一步证实了丘脑皮层连接确实是大规模功能组织的核心机制。在之前的研究中，合成生成的网络已被证明能够忠实地重现实证数据中观察到的网络组织的主要特征。在我们的研究中也是如此，当网络生成受到丘脑皮层连接引导时，皮层网络的功能分离自然涌现，其模式与真实大脑中的模式惊人相似，而基于不同布线规则的模型则并非如此。具体而言，与基于空间距离、拓扑特征或遗传相关性的模型相比，只有丘脑皮层连接模型驱动了具有意义的功能分离的层级大脑网络的形成。这与我们来自儿童/青年期的建模结果有关，而与婴儿期无关，证实了两个年龄组之间CMAP和NEOMAP的发散关联。使用允许跨迭代（类似于真实大脑中的发育阶段）追踪脑网络生成的生长模型，我们发现丘脑对功能分离的影响在发育后期要大得多。特别是，与外向导向的功能区域相比，内部区域的分离受到丘脑-突显连接的更强调制，暗示其在默认模式网络成熟中的作用。我们的结果提供了丘脑皮层连接如何影响全脑功能连接组发生（connecto-genesis）的机制线索。
局限性与未来方向
应注意几个局限性。首先，我们的结果基于丘脑皮层连接分析的静态（“非动态”）模型；然而，最近对脑活动非平稳方面的强调表明，未来的研究可以使用不同的分析方法（如共激活模式分析）探索丘脑在皮层同步中的作用。其次，尽管不同的数据采集条件（睡眠和清醒）限制了我们的解释，但在一个包含两种状态下扫描个体的独立数据集中，我们发现其底层架构保持不变。未来的数据收集应考虑对跨不同唤醒状态的结果进行更系统的重测信度调查。最后，由于我们的转录组学发现基于利用死后组织的AHBA，有必要提及最近一份强调与活体脑组织相比基因表达差异的报告。虽然这是对未来基因成像分析的一个值得注意的警示，但他们的发现基于从帕金森病患者前额叶皮层采样的区域组织，因此不能一概而论地削弱死后分析的效用，特别是那些基于全脑空间相关性的分析。
总结
综上所述，我们揭示了丘脑皮层连接拓扑梯度及其相应的新皮层投射图谱中随年龄变化的差异。神经影像学和转录组学分析为我们提供了关于其在婴儿期和儿童/青年期宏观功能组织中角色转变的新见解，而计算模型证实了丘脑皮层连接在功能网络分离中的贡献。虽然我们的研究集中在丘脑和皮层之间的相互作用，但进一步的研究可能会考虑丘脑与其他皮层下区域（如基底神经节和小脑）的广泛连接。此外，考虑到最近的一个生成网络模型解释了网络形成中连接权重的强度，未来的研究可能会纳入加权的丘脑皮层连接，以揭示丘脑在大规模功能性脑组织涌现中的发育作用的更细微图景。最后，由于丘脑是调节皮层网络的关键区域，丘脑皮层连接的改变可能是异常全脑连接的预兆，这种异常连接构成了各种发育状况的基础，包括精神分裂症、癫痫和自闭症。