微精选

高脂肪、低纤维的西式饮食（WD）会引发微生物组失调，其特征为分类多样性和代谢广度减少，进而增加多种代谢、免疫及全身性病理风险。近期研究证实，WD可能损害微生物组对急性扰动如抗生素治疗的恢复力，但其损害机制及抗生素后长期失调对宿主的特异性后果仍不清楚。本研究通过描述常规饲料（RC）或WD喂养的小鼠在抗生素治疗后肠道微生物组分类与功能特征恢复的轨迹，发现仅有RC组小鼠经历了快速的恢复性演替过程。代谢模型表明，RC饮食促进互养交叉喂养相互作用的发展，而WD组小鼠中，优势分类单元会独占易获取资源而不释放互养副产物。干预实验显示，适宜的饮食资源环境对微生物组的快速稳健恢复既是必要条件也是充分条件，而微生物移植则无法实现此效果。此外，WD组小鼠抗生素后的长期失调使其易受肠道病原体Salmonella enterica serovar Typhimurium（鼠伤寒沙门氏菌）感染。我们的数据挑战了目前对粪便微生物移植（FMT）作为菌群失调干预策略的广泛热情，证明特定饮食干预至少是有效FMT的必要前提，且可能提供更安全、更自然、侵入性更低的替代方案。

饮食诱导的菌群失调使微生物组在抗生素扰动后更易崩溃，但饮食与微生物群落结构对此现象的贡献比例尚不明确，且代谢相互作用对动态过程的解释程度亦未可知。微生物失调可能降低微生物再定植的可行性，而贫瘠的资源环境可能改变恢复生态学与群落多样化进程。理解这些动态机制对于选择最优微生物组修复策略至关重要。本研究通过比较不同宿主饮食下微生物组对抗生素扰动的恢复力与恢复过程，解构饮食与微生物再定植对微生物组恢复的影响，并提出肠道微生物组恢复中饮食驱动的生态演替统一模型。

为探究饮食如何影响肠道微生物组对抗生素治疗的恢复力，86只雌性无特定病原体（SPF）C57BL/6小鼠被分别适应标准低脂高纤维饲料（RC）或WD四周。随后对每类饮食小鼠进行72小时饮用水三抗生素鸡尾酒（Abx）或5% PBS对照处理，并收集4周粪便样本，长期队列收集至9周（图1a及方法）。另有一组12只雄性小鼠执行相同方案至Abx后两周，以确认恢复模式在性别间的一致性（扩展数据图1b,c）。鉴于性别间结果一致，除非特别说明，本文分析仅包含雌性小鼠数据。

我们首先通过富培养基菌落形成单位（CFUs）计数量化肠道微生物组对抗生素治疗的生物量恢复力。结果显示Abx处理后CFU计数急剧下降，但WD组下降程度更显著（图1b及附表1）。RC组小鼠CFU计数在Abx后第4天恢复至基线水平，而WD组至少至第7天仍未恢复。两种饮食的PBS对照组微生物生物量均保持稳定（扩展数据图1b及附表1）。

接下来使用16S核糖体RNA（rRNA）基因测序评估各处理组肠道微生物组的分类恢复。抗生素处理前（第-3天），WD组小鼠系统发育多样性显著低于RC组（图1c及附表2）。抗生素处理后，两组饮食小鼠系统发育多样性均急剧下降。RC-Abx组小鼠自第5天开始恢复，至第11天恢复超半数初始多样性。WD-Abx组在所有队列中至少至第28天、部分队列至Abx后9周仍维持极低多样性水平。PBS对照组系统发育多样性无显著变化。其他α多样性指标重现此趋势（扩展数据图1d-f及附表2）。

相应地，两组饮食小鼠在Abx处理期间及之后的分类群相对丰度均发生显著改变（图1d）。RC-Abx组微生物群经历连续的再定植阶段：早期以Enterococcaceae科和Lactobacillaceae科等兼性厌氧菌为主，随后严格厌氧菌逐渐多样化。WD-Abx组在生物量恢复前，Abx后低生物量群落以Streptococcaceae科为主。WD-Abx组的恢复过程约在第14天经历兼性厌氧菌包括Moraxellaceae科、Enterococcaceae科和Lactobacillaceae科的演替阶段，之后才恢复严格厌氧菌。尽管不同队列的具体组成变化未完全重复（扩展数据图1i），但某些特征如生物量恢复初期兼性厌氧菌的优势地位，以及所有WD-Abx组Abx后Streptococcaceae科内Lactococcus（乳球菌）属的持续优势具有一致性。

Bray-Curtis差异度主坐标分析（PCOA）显示，所有实验队列中处理组内的微生物组动态遵循相似的组成轨迹（扩展数据图1g-j）。至第14天或更早，RC-Abx组小鼠肠道菌群接近其处理前群落及对应的RC-PBS对照组，而WD-Abx组菌群在第14天仍显著区别于处理前状态。至第28天，RC-Abx组菌群已与RC-PBS对照组无差异，而仅部分WD-Abx组小鼠开始接近初始群落结构（PERMANOVA；附表2）。这些结果表明，与RC组相比，WD组小鼠在抗生素治疗后肠道微生物分类与生物量恢复显著受损。

为确定不完整的分类恢复是否与功能容量改变相关，我们对RC-Abx和WD-Abx组部分小鼠在抗生素处理前关键时间点及整个恢复过程中的粪便样本进行了鸟枪法宏基因组测序（方法）。基因预测结果通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库进行功能注释。

我们首先通过计算不同层级（基因预测、KEGG直系同源（KO）或KEGG类别（KCat））的功能丰富度评估了肠道微生物组功能多样性（扩展数据图2a）。在基因预测层级，WD组小鼠甚至在抗生素处理前就表现出比RC组更低的功能丰富度（附表3）。抗生素处理后，两组饮食小鼠的功能丰富度均严重下降，但至第28天，RC组小鼠恢复了其初始基因数量的69%，而WD组小鼠仅恢复16%。

在更广泛的层级如KO或KCat，抗生素处理期间及之后两组的功能丰富度保留程度更高（扩展数据图2a）。这可能表明功能冗余（即每个KO对应的独特基因预测数量）在抗生素处理前后发生了变化。高功能冗余可在KO层级为个体基因预测的丢失提供稳健性。事实上，我们观察到RC组小鼠在抗生素处理前具有更高的功能冗余，并在处理后显著恢复更多功能冗余，而WD组小鼠的功能冗余丧失持续存在（图2a及附表3）。在RC组小鼠中，KO的初始与最终功能冗余之间的相关性比WD组强得多（扩展数据图2b及附表3），WD组倾向于丧失功能冗余，无论特定KO的初始冗余度如何。

为评估功能冗余恢复是否在不同功能子系统间存在差异，我们在KEGG系统层级映射了恢复率强（>75%）或差（<25%）的KO（图2b）。尽管WD组小鼠中表现出差恢复的KO数量更多且其中大多数（55%）映射至代谢功能，但KEGG系统的比例分布在处理组间和恢复水平间几乎相同（图2b）。因此，WD组小鼠在抗生素处理后经历功能多样性和冗余的丧失，其强度在KO组间存在差异，其中代谢冗余的损失最为显著。

为聚焦数据中功能可解释性最强的方面，所有后续宏基因组分析均在KO层级进行。我们在处理前时间点与所有处理后时间点之间进行配对比较，以研究恢复期间微生物组的功能特征并识别差异丰度KO。RC组小鼠在第2天相对于处理前有658个显著缺失的KO，至第4天增至835个，但至第14天这些KO几乎全部恢复至基线水平（扩展数据图2c及附表4）。在第2天和第4天，富集或缺失的基因存在部分重叠但不同的子集（扩展数据图2d,e），表明恢复过程中存在独特的中间功能阶段。

在所有评估时间点，WD组小鼠显著缺失的KO数量均多于RC组，甚至至第28天仍有291个KO未恢复至处理前水平（扩展数据图2f及附表4）。与RC组小鼠不同，WD组第14天和第28天缺失的KO几乎均为第2天缺失KO的子集（扩展数据图2g）。WD组小鼠在所有时间点还存在少量部分重叠的KO集合，其相对于处理前显著富集（扩展数据图2h）。跨时间点和饮食的特定功能表征的进一步分析见扩展数据图2i-n及附表4。

为直接检测肠道的资源环境，我们对RC-Abx和WD-Abx组小鼠在抗生素处理前后的粪便微生物组相关化合物（包括氨基酸、碳水化合物、胆汁酸等）进行了靶向代谢组学筛查。我们发现，对于RC组小鼠，许多化合物的标准化丰度在抗生素处理后立即偏离基线，但至第11天时恢复至基线水平（图2c）。这一结果通过PCOA聚类分析得到统计学确认（扩展数据图3b,c及附表5）。我们的热图和PCOA揭示了恢复过程中的两个拐点：第3天后和第7天后。第3天后的变化主要由棉子糖和蜜二糖的动态驱动，这两种植物来源的α-半乳糖苷化合物在RC饮食中高度富集。这些化合物的丰度在抗生素处理后显著增加并持续至第3天，但至第5天恢复基线。第二个拐点反映了多种化合物的动态，包括核糖、葡萄糖和阿拉伯糖等碳水化合物单体以及多种脂肪酸——这些化合物在抗生素处理后减少，但在第7至11天间恢复。次级胆汁酸（石胆酸、脱氧胆酸和1,2-酮石胆酸）以及较低程度的一级胆汁酸（胆酸）同样减少至第7天，但至第11天时丰度超过基线。与此形成鲜明对比的是，WD组小鼠的代谢组特征直至第14天几乎未显示恢复迹象（图2c及扩展数据图3b,c）。胆汁酸在整个采样期间持续严重减少。蔗糖、烟酸和脂肪酸（在RC组小鼠中最初减少但第7天后恢复）在WD组小鼠中始终维持低水平。纤维二糖、阿拉伯糖和肌醇等碳水化合物相对于基线过度富集且未恢复至基线水平。

由于短链脂肪酸（SCFAs）是微生物代谢的明确产物并直接影响宿主，我们进行了单独的代谢组学分析以量化RC-Abx和WD-Abx组小鼠盲肠样本中SCFAs的绝对水平。RC组小鼠在第14天和第28天的乙酸盐、丁酸盐和丙酸盐浓度与处理前无统计学差异，而WD组小鼠在第14天时这些化合物减少，并持续低水平至第28天（图2d-f及附表5）。

我们探讨了观察到的代谢物丰度变化是否与产生或降解这些化合物的微生物基因丰度变化相关。为评估这一可能性，我们绘制了多个精选微生物基因子集的相对丰度随时间变化图，并叠加相关代谢物丰度（方法）。例如，蜜二糖和棉子糖含有α-1,6键，可被细菌α-半乳糖苷酶基因水解但不被宿主酶分解。在RC组小鼠中，当微生物α-半乳糖苷酶基因最缺乏时，蜜二糖和棉子糖在抗生素处理后达到更高浓度，随着这些基因的恢复，其丰度下降（扩展数据图3d及附表6）。在WD组小鼠中，α-半乳糖苷酶基因或蜜二糖/棉子糖的丰度变化极少。淀粉和阿拉伯聚糖可分别代谢为葡萄糖和阿拉伯糖单体。在RC组小鼠中，当淀粉和阿拉伯糖代谢基因减少时，葡萄糖和阿拉伯糖丰度降至低位，随着这些多糖代谢基因丰度增加，其单体分解产物的丰度也相应上升（扩展数据图3e,f）。在WD组小鼠中，代谢物或基因丰度在恢复过程中再次显示极少变化。这些数据表明，在RC饮食的小鼠中，微生物群可能以WD组微生物群不具备的方式响应或与资源环境（尤其是复杂碳水化合物）相互作用。

在我们评估的所有分类和功能指标中，WD组小鼠经历了比RC组更严重的生态系统崩溃，且恢复更缓慢、更不完全（图1-2）。这不能归因于WD组小鼠抗生素清除速度较慢（扩展数据图4及附表7）。为探索资源环境塑造群落恢复模式的机制，我们开发了代谢模型，利用微生物成员的功能知识和整合组学数据预测各群落随时间的代谢相互作用及动态（方法）。图1中大部分扩增子序列变体（ASVs）与RefSeq中至少一个完全注释的分离株基因组中的16S序列高度匹配，我们通过KBase中的ModelSEED2流程重建了代表性概率基因组尺度代谢模型（prGEMs）（补充方法）。单个prGEMs（菌株-代谢物相互作用概率谱；扩展数据图5）和丰度加权样本群落（微生物组-代谢物相互作用概率谱）的代谢潜力表征见补充讨论。

为预测恢复过程中哪些代谢功能由哪些ASVs执行及其饮食间差异，我们进一步将基于ASV的prGEMs整合为群落模型，并在观察到的代谢物和ASV丰度动态约束下模拟各时间点区间内每条代谢通路的通量。这些模拟确定了每个区间内ASVs最可能的代谢行为（扩展数据图6及附表8），并揭示了RC与WD处理组间的深刻代谢差异。在RC群落中，生态复杂性和互养交叉喂养相互作用在抗生素处理后立即维持并贯穿恢复全程，形成复杂交错的代谢网络（图3a,b及扩展数据图6）。相比之下，WD群落在抗生素处理后至第7-11天几乎丧失所有互养相互作用，代之以单一具有广泛代谢能力的Lactococcus ASV主导，其产生的互养副产物极少。RC群落包含相同的Lactococcus ASV，但在RC饮食背景下，其通过与其它菌株的营养复杂性和相互依赖性达到平衡，因此从未主导微生物组。尽管氨基酸在图3a中未显示以保持视觉清晰，但相对于WD微生物组，RC中更高的代谢交互性、互养性和复杂性的观察模式同样适用于氨基酸代谢（图3b及附表8）。

群落模拟进一步揭示了RC微生物组恢复中的代谢演替。抗生素处理后，两组小鼠耗氧ASV集的通量均增加（WD组更显著；扩展数据图6h及方法）。在RC组小鼠中，Muribaculum丰度下降，为纤维二糖消耗留下生态位。这一空缺由多种兼性厌氧Enterococci填补，其消耗纤维二糖和棉子糖并产生柠檬酸和苹果酸等代谢产物，促进需氧Acinetobacter出现。Enterococcus持续产生苹果酸与Acinetobacter产生的肉豆蔻酸为厌氧Akkermansia及复杂碳水化合物消耗菌Alistipes和Muribaculum开辟生态位。至第7-11天，Muribaculum基本取代Enterococcus成为纤维二糖和棉子糖的主要消耗者（如处理前状态），且随着严格厌氧菌的出现，需氧通量恢复至基线。WD组小鼠在第7-14天观察到的部分恢复同样始于肠球菌的出现，但在该饮食背景下，其不足以推动群落完全恢复，且耗氧菌的通量持续维持高位。

综上，我们的模型表明，纤维二糖和棉子糖等复杂碳水化合物的代谢（其在RC饮食中比纯化WD更丰富）驱动了促进演替、多样化和恢复的互养相互作用。在WD饮食下，尽管微生物组存在重叠的分类单元且抗生素后代谢相同化合物的能力相对广泛，但单糖的更高可利用性促进了单一分类单元的主导。因此，饮食资源可利用性从根本上塑造了现有分类单元与环境及其他微生物相互作用以促进或阻碍恢复的方式。

我们的数据表明，WD组恢复受限的主要原因是简单与复杂碳水化合物可利用性的失衡，而非缺乏代谢能力强的分类单元。为验证此假说，我们进行了干预实验，在抗生素处理后控制饮食和微生物再暴露（图4a及方法）。简言之，抗生素处理后，每组小鼠被转移至无菌悉生笼，并以析因方式施加不同的处理后饮食（RCD和WDD）及微生物再暴露（RCM和WDM）。微生物再暴露通过FMT在抗生素后24小时和第14天实施；每组中一亚组接受无菌PBSM灌胃作为无移植对照。收集处理前后及恢复期至第28天的粪便样本。我们选择第14天作为评估RC与WD组恢复动态差异的关键时间点（完整时序数据见扩展数据图7及补充讨论）。各组无抗生素对照作为”恢复”基准，通过16S rRNA测序（图4b）、PCOA聚类分析（扩展数据图7及附表9）和ASV丰富度（图4c及附表9）评估整体群落组成。

我们首先验证该实验模型能否复现原始实验表型：未改变饮食或微生物再暴露的小鼠（RC→RCD/RCM和WD→WDD/WDM）与图1描述的RC-Abx和WD-Abx表型一致。从相对丰度图可见，无论处理前饮食或处理后微生物移植如何，肠道菌群组成主要按处理后饮食分组（图4b）。PCOA证实肠道菌群组成通过主成分1（PC1）按处理后饮食分离，RCD组小鼠PC1值更低且更接近无抗生素对照（扩展数据图7及附表9）。类似地，所有RCD组小鼠在第14天的ASV丰富度恢复程度均优于WDD组（图4c及附表9）。

在摄食处理后WDD的小鼠中，微生物移植对恢复影响可忽略，所有WDD处理组在第14天均表现出严重降低的ASV丰富度，并与WD无抗生素对照明显分离。这些实验表明，适宜饮食是抗生素后肠道菌群快速稳健恢复的必要且充分条件，而微生物移植既不必要也不充分。这支持我们的模型预测：恢复主要由饮食资源可利用性（尤其是简单与复杂碳水化合物的平衡）驱动，而非特定分类单元的存在与否。

在健康状态下，微生物组通过”定植抗性”保护宿主免受机会性病原体侵袭。例如，病原体Salmonella enterica serovar Typhimurium（ST）无法在无链霉素预处理的SPF小鼠中建立下消化道感染或引发结肠炎。然而，现有ST定植抗性模型仅在抗生素预处理后24小时评估感染易感性。我们假设WD组小鼠经历的长期抗生素后失调可能使其在抗生素处理后14天仍对ST感染易感。

为评估此可能性，我们进行了包含五组雌鼠和一组雄鼠的实验（方法）。抗生素或PBS处理后，小鼠恢复14天，随后每组按饮食和抗生素处理分为感染（INF）和无感染（PBS）亚组（图5a）。研究表明，即使无抗生素预处理，WD相较RC更易促进ST感染；通过比较各饮食的Abx与无Abx对照组，我们分离出饮食与饮食诱导的抗生素后失调的特异性效应。收集感染后96小时内（hpi）的粪便样本和体重数据。

我们首先评估感染后各时间点ST载量（图5b）。未感染对照组ST未检出，证实无污染。如假设，WD-Abx-INF组最易感，在24-48 hpi期间ST载量显著高于所有其他组（较WD-PBS-INF组中位数高约105倍；附表10）。72-96 hpi期间，WD-Abx-INF和WD-PBS-INF组ST载量均显著高于所有RC饮食组，复现了WD本身足以削弱定植抗性的既往结论。尽管WD-Abx-INF组至96 hpi中位ST载量仍高于WD-PBS-INF组，但48 hpi后差异不再显著。

我们对下消化道组织感染严重性进行靶向分析以聚焦ST肠型定植抗性模型（非播散性伤寒）。盲肠组织病理学评分和ST诱导炎症标志物的定量PCR（qPCR）分析显示，WD-Abx-INF组炎症病理更严重（图5c,d）且炎症标志物表达更高（图5e,f、扩展数据图8及附表10）。值得注意的是，未感染的WD-Abx-PBS对照组出现程度不一但偶发严重的炎症（类似WD-Abx-INF组），提示WD组小鼠抗生素处理可诱发无ST攻击的炎症。然而，仅WD-Abx-INF组持续发生下消化道感染和肠炎，支持WD组长期抗生素后失调削弱下消化道定植抗性的假说。

碎片化的研究已开始概述复杂碳水化合物与纤维来源促进微生物组恢复的机制。我们的工作代表了对这些概念在单一体内系统中的转化性重要整合与扩展。我们复现了纤维在抗生素后微生物组恢复中的重要性（既往研究已在低脂饮食小鼠中证实），但在低纤维高脂肪的临床相关西式饮食背景下记录了更严重且持久的菌群失调。我们重申复杂碳水化合物促进互养作用与群落复杂性的发展（如体外确定微生物群落的既往研究所示），但在复杂内源性体内生态系统中证实此效应。我们通过新型代谢建模方法超越了抗生素处理后初期氧化还原与宏基因组扰动的研究，预测了介导恢复的饮食驱动演替动态。综上，我们提出统一模型：缺乏纤维导致抗生素后严重氧化还原失衡（可能因WD高脂条件下活性氧生成增加而加剧），促进优先利用脂肪与单糖而非复杂碳水化合物的兼性需氧菌生长。缺乏复杂碳水化合物的分解，群落无法通过互养促进性相互作用开辟生态位空间并多样化。明确量化纤维与脂肪对此过程的贡献需进一步实验。

鉴于全球西式饮食消费增加及抗生素滥用，我们的发现具有重大临床意义。在人类中，抗生素后微生物组恢复的个体差异已有充分记录但机制不明。我们的数据提示饮食可能是驱动微生物组恢复个体差异的核心因素，应在人类研究中明确评估。我们结果的某些方面（如兼性厌氧菌早期优势及零纤维饮食对微生物组恢复的整体损害）确已在人类中证实。因此，我们预期饮食对抗生素后恢复的影响及微生物移植疗效的广泛结论在宿主系统中具有保守性，且这些动态主要可由微生物代谢相互作用解释。

我们的结果还强调了长期抗生素后失调的重大风险，尤其对机会性感染易感人群。尽管抗生素、肠道准备方案或腹泻等扰动导致的微生物组失调已被证明可促进扰动后即刻的机会性感染，但我们的工作表明饮食条件可显著延长易感窗口期。当微生物组的医源性损伤不可避免时，应跨临床情境研究围抗生素期饮食干预作为促进微生物组恢复的安全经济途径。

迄今，快速发展的微生物组治疗领域主要聚焦于微生物替代策略（如FMT、益生菌或活体生物治疗剂），但其疗效存在个体与疾病间差异。值得注意的是，目前极少数人类研究明确评估受体饮食对微生物移植成功的影响，且绝大多数甚至未报告受体饮食信息。我们的干预实验表明，饮食对恢复的基础性作用超越微生物再定植，且缺乏适宜饮食资源环境时，微生物移植不足以促进恢复。在微生物灭绝更显著的背景下（如本实验所示），微生物替代可能在恢复中仍具重要作用。然而，我们的数据表明，除非微生物移植遇到支持定植、生长与多样化的资源环境，其疗效至多有限。因此，辅助性饮食干预或可提高现有微生物移植策略的一致性与疗效。

最后，我们提出将生态演替作为微生物组修复的新范式。在此模型下，现存分类单元与其周围资源环境通过迭代反馈过程相互作用以指导群落发展进程。先至微生物可能通过产生互养副产物或改变资源环境（如氧水平、pH与胆汁酸池）促进或抑制后至微生物生长。若群落缺乏正确分类单元或分类单元无法获取适宜资源，则无法进入下一阶段。我们的数据与模拟表明，即使存在正确分类单元，WD也无法提供启动此演替过程所需的单糖与复杂碳水化合物平衡。在此意义上，WD小鼠的FMT类似将成熟森林移植至火灾后的贫瘠土壤：土壤无法支持其生长。通过应用本文所述代谢模型等方法，我们可解析健康与疾病状态间的过渡动态，并学会通过匹配特定饮食或微生物干预与群落当前需求来支持各阶段演替。由此，我们可促进再次容纳顶极群落生长所需的环境变化。