构建肝脏疾病模型需要能够复现疾病进展过程的体外系统。目前基于组织来源的类器官无法重现体内观察到的复杂细胞组成和组织架构。本研究描述了一种由成熟肝细胞、胆管上皮细胞和间充质细胞组成的多细胞类器官系统，该系统不仅再现了肝脏门管区结构特征，经调控后还能模拟胆汁淤积性损伤和胆道纤维化的病理过程。首先建立了具有功能性胆管网络的可复制肝细胞类器官,这些类器官完整保留了体内组织的形态学特征。通过将这些肝细胞类器官与胆管上皮细胞及门静脉成纤维细胞共培养，构建出能模拟门管区细胞互作的组装体。这些组装体具备生理功能，可稳定地将胆汁从胆小管引流至胆管。值得注意的是，仅通过调控门静脉间充质细胞的相对数量就足以诱导出类似纤维化的状态，且这一过程无需免疫细胞参与。通过构建突变型与野生型细胞的嵌合组装体，或进行基因敲除实验，我们验证了该系统适用于研究基因功能和细胞自主性机制。综上所述，肝脏组装体作为一体化研究模型，可全面模拟胆小管形成、胆汁引流过程，并阐明不同细胞类型在胆汁淤积性疾病及胆道纤维化中的机制。
胆汁流量或胆小管（BC）与胆管（BD）之间的联系失调导致胆汁淤积性肝病，可发展为纤维化、肝硬化，最终导致肝功能衰竭。在胆汁淤积性疾病中，无论是在胆管结扎（BDL）和Mdr2小鼠动物模型还是在人类疾病中，门脉间充质细胞和门脉成纤维细胞（PFs）以及胆管细胞发生激活和增殖。最近的空间转录组学分析显示，在健康和胆汁淤积的肝组织中，许多分子参与了汇管区周围细胞之间的细胞间通讯。然而，这些细胞如何促进内稳态、再生或纤维化仍不清楚。
目前尚无体外系统能够模拟复杂的门脉周稳态或纤维化细胞相互作用，更无法重现门脉区特异性功能及中观尺度结构。组织来源的成年小鼠导管（胆管细胞）或肝细胞类器官仅由上皮细胞构成。虽然已有报道在二维培养体系中实现胆管细胞与肝细胞祖细胞的上皮共培养，但这类培养体系存在显著局限——既无法维持超过一周的长期培养，又不能再现胆小管网络的三维结构特征，且缺乏基质细胞成分而无法模拟门脉区上皮-基质相互作用。近期研究证实，胆管细胞-间充质类器官共培养体系虽能部分保留三维组织形态特征及双细胞类型相互作用，但该模型仍未涵盖门脉区存在的其他细胞类型。
本研究成功构建了具有生理性3D胆小管网络结构的肝细胞类器官（HepOrg），并将其与胆管细胞及门脉区间充质细胞共培养，建立了可重现体内胆小管-胆管细胞间相互作用及组织架构的门脉周肝脏类器官模型（门脉周类组装体）。借助这一创新体系，我们成功模拟了胆汁淤积性肝纤维化的多个关键病理特征——包括肝细胞死亡、细胞外基质沉积及胆管细胞增生扩张，但该模型目前尚不能再现炎症反应过程。此外，本研究首次论证了肝脏类组装体在探究肝病分子机制及细胞自主性机制方面的应用潜力。
1. HepOrg形成3D胆小管网络
现有模型构建的胆小管网络密度不足，难以形成可靠的胆小管-胆管连接结构。首先对HepOrg培养体系进行优化，在保持类器官充分扩增能力的同时，构建出具有生理学意义的BC网络。补充WNT3a配体或WNT替代物后类器官的大小和细胞数量都有所增加，与之前的方法相比，类器官形成效率显著提高（提高2-3倍），并且实现长期稳定培养。优化后的HepOrg保持了肝细胞的特异性身份特征，稳定表达肝细胞标志性分子（如HNF4α、Albumin）以及胆小管转运蛋白MDR2（Abcb4）和MRP2（Abcc2）。该类器官不表达胆管细胞标志物（如SOX9、KRT19）或非上皮细胞标记物，其分子表型特征与新鲜分离的原代肝细胞高度一致。优化后的HepOrg成功重现了体内组织中肝细胞复杂的极性特征：紧密连接蛋白（ZO1）和CD13等极性标志物定位于相邻肝细胞顶端表面，而E-钙黏蛋白（ECAD）则特异性分布在基底外侧膜区域。图像分析进一步证实，优化的HepOrg不仅展现出更长的胆小管网络结构，而且分支数量显著增加，其形态学参数更接近真实肝组织特征（图1）。
图1肝细胞类器官保留了组织的标记表达和细胞极性。
RNA原位杂交（RNAscope）与免疫荧光双重分析显示：门静脉周围区标志物（Gls2-RNA、ALB蛋白、ECAD蛋白）与中央静脉周围区标志物（Cyp1a1-RNA、CYP2E1蛋白、GS蛋白）呈现特征性空间分布差异——中央静脉区标志物更集中表达于类器官表面/外周区域。在基本培养基（MM）中培养的HepOrg获得了更显著的门静脉周围区基因表达特征。MM培养体系下的HepOrg BC直径分布范围更窄（1.5-2.5 μm），显著细于肝细胞培养+30% Wnt（CMHM-Wnt）体系（2-7 μm）。BC网络连通性进一步提高，与肝组织相似。荧光标记的胆汁酸类似物CLF和CMFDA，以及磷脂酰胆碱（PC）定位在胆小管膜上的MRP2、BSEP和MDR2三种胆汁转运蛋白。这些荧光标记物被摄取并转运至胆小管腔内，这一结果不仅证实了肝细胞类器官中胆小管网络的功能完整性，也与我们在HepOrg培养体系中观察到的顶端转运蛋白基因表达特征完全吻合（图2）。
图2 HepOrg具有与组织相当的生理和功能胆管大小和网络。
2.组装体模拟门静脉周围区结构
将来自导管类器官和门脉间充质细胞的一定数量的单个胆管细胞与一定数量的肝细胞类器官混合，并在MM中进行培养。摇摆平台和AggreWell™培养板都能高效地形成多细胞结构（约占总肝细胞类器官的70%）.HepOrg预先在共培养基中进行预处理，这一效率可进一步提高至约90%。这些多细胞结构保持了组织的细胞比例，并重现了组织的结构特征。单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析表明，组装体中的细胞能够维持其原有细胞身份及特异性表达谱。进一步分析发现，间充质细胞富集基底膜、金属蛋白酶活性及细胞外基质相关特征；胆管细胞富集细胞间连接相关特征；而肝细胞则显著富集代谢过程及胆固醇转运等相关功能。这些组装体细胞的转录组特征与多个公开小鼠肝脏细胞图谱中的肝细胞、胆管细胞及门静脉间质细胞高度吻合。在门静脉区组装体中，当胆管细胞整合在结构内部时，BC与BD之间的连接（BC:BD）100%重现了天然肝脏组织的结构特征。通常可见多个BC汇入同一个BD，且其周围通常紧密环绕着Msc，这与天然组织中的情况一致。这种BC-BD连接具有功能活性，检测的荧光标记的胆汁酸类似物CLF从肝细胞的BBC网络被转运至BD腔内，其转运时间尺度与天然组织相近（图3）。
图3组装体再现了中尺度组织结构和基因表达。
3.类器官组装体能够模拟胆道纤维化
当门脉区间质细胞数量达到非生理水平（过量10倍）时，所形成的组装体结构相较于生理数量条件下表现出更为显著的形态异常。RNAseq显示，高比例Msc的组装体中，胆管细胞标志物和多种胶原蛋白的表达水平显著上调，且这种上调趋势在延长培养时间（2.5周）后仍持续存在甚至进一步加剧。scRNA-seq分析显示在肝细胞-间充质相互作用中最显著的是Fgb/Fgg-Itgbl。参与加速肝纤维化的信号通路显著富集，并且已知在胆汁淤积性损伤中被激活。在纤维化样组装体中，Msc（SCA1+, PDGFRα）初始数量的增加影响了其他两个群体：肝细胞和导管细胞，而在稳态组装体中没有。肝细胞数量显著减少，也表现出形态异常、细胞膜扭曲和染色质染色弱。Cleaved caspase 3染色表明肝细胞死亡至少部分是通过凋亡。在肝细胞死亡的同时，增殖性胆管细胞数量显著增加，这种增殖现象在长期培养（>40天）的组装体中更为明显。类纤维化组装体中纤维性胶原沉积显著增多，这一发现与基因表达谱数据及胆道纤维化小鼠模型结果高度一致（图4）。
图4门静脉周围组装体在体外模拟胆道纤维化的某些方面。
4.类器官组装体作为研究纤维化的工具
与对照组相比，类器官组装体在培养过程中未发生显著形态改变（对照组随时间推移出现明显收缩）。Msc敲除ITGB1或敲低CDH11基因均导致胶原沉积量显著减少，这一现象与间充质细胞间相互作用的破坏直接相关。由MDR2基因敲除小鼠建立的HepOrg类器官模型呈现出胆汁淤积性肝病的典型特征：包括胆小管扩张、顶端隔膜形成、胞质内泡状突起以及肝玫瑰结样结构聚集。这些病理特征同样出现在Mdr2基因敲除小鼠的肝组织中，但在对照组组织及野生型同窝对照小鼠来源的HepOrg中均未观察到。进一步将Mdr2敲除的胆汁淤积型HepOrg与野生型胆管细胞、野生型门脉间充质细胞共培养，构建了嵌合型组装体。由Mdr2-/-肝细胞形成的组装体，而不是WT对照组，表现出导管细胞扩张，类似于在体内观察到的Mdr2-/-小鼠的导管增殖（图5）。
图5门脉周围组装体作为研究疾病机制的工具。
该研究构建的门脉周围类组装体模型成功在介观和细胞尺度上重现了肝脏的精细结构及细胞间相互作用机制。该模型作为首个器官模型系统，能够在单一的体外肝脏平台中同步实现以下研究目标：胆小管形成过程的动态观察、胆汁引流功能的模拟分析，以及肝细胞、胆管细胞和门脉间充质细胞在胆汁淤积性肝病中各自发挥的细胞自主性或细胞特异性作用机制研究。
参考文献
Dowbaj AM, Sljukic A, Niksic A, Landerer C, Delpierre J, Yang H, Lahree A, Kühn AC, Beers D, Byrne HM, Seifert S, Harrington HA, Zerial M, Huch M. Mouse liver assembloids model periportal architecture and biliary fibrosis. Nature. 2025 May 29. doi: 10.1038/s41586-025-09183-9. Epub ahead of print. PMID: 40441268.