胶质瘤是一种具有免疫抑制微环境的不可治愈恶性脑肿瘤,其髓系细胞的免疫调节表型尚未明确。美国哈佛大学医学院Bradley E. Bernstein团队在《Nature》期刊发表最新研究成果,通过整合单细胞RNA测序、染色质可及性分析、空间转录组学和胶质瘤类器官模型，揭示了胶质瘤中髓系细胞的免疫调节功能及其起源。
胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，具有独特的免疫微环境，限制了免疫治疗的效果。髓系细胞在胶质瘤中含量丰富，可占肿瘤细胞的50%，但其在肿瘤中的具体功能尚不清楚。此外，髓系细胞的起源和发育过程在人类胶质瘤中仍存在争议，且缺乏对髓系细胞与其他细胞相互作用的研究。
在既往的研究中，髓系细胞通常根据细胞类型进行分类和研究。然而，这种基于细胞类型的分类方法难以独立评估其功能活性。此外，关于髓系细胞的起源，通常根据标记基因推断其为小胶质细胞来源或骨髓来源，但在人类胶质瘤中髓系细胞的确切起源仍不确定。目前缺乏对髓系细胞与其他恶性细胞和非恶性细胞之间相互作用的理解，这些相互作用可能形成特定的生态位和免疫微环境。在实验建模方面，肿瘤相关巨噬细胞在单层培养中会迅速改变状态，而小鼠模型无法完全重现人类肿瘤中的小胶质细胞生物学和巨噬细胞程序。因此，本研究旨在通过综合研究人类胶质瘤中的髓系细胞，克服这些限制，为胶质瘤的诊断和免疫治疗策略的发展提供基础。
1. 共识髓系细胞表达程序
我们使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术对新切除的人类成人弥漫性胶质瘤中的免疫细胞和非免疫细胞类型进行了表征。研究纳入多种类型的肿瘤，包括异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变型和野生型（WT）肿瘤、原发性和复发性肿瘤，以及接受不同治疗的肿瘤。将44个前瞻性收集的肿瘤特征与41个来自先前发表的肿瘤特征相结合，形成了一个包含85个样本的分析队列。这些样本被分为发现队列和验证队列，基于标记基因表达对细胞进行注释，并识别恶性细胞中的拷贝数变异。
为了发现髓系细胞中的共识基因表达程序，采用了共识非负矩阵分解（cNMF）以识别在每个发现队列中髓系细胞中协调调控的基因集合。通过层次聚类，识别出3个队列中反复出现的表达程序，并从中衍生出14个共识基因程序。这些共识程序在85个胶质瘤样本中被发现，并在验证队列中得到重现。
共识程序包括细胞身份程序和细胞活动程序。身份程序包含经典髓系细胞类型的标记基因，如小胶质细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和中性粒细胞。为了比较肿瘤相关单核细胞程序与外周单核细胞，研究者对17个匹配的血液样本中的髓系细胞进行了scRNA-seq，并识别出3个外周单核细胞程序（CD14+、CD16+和CD163+）。肿瘤相关单核细胞程序与外周单核细胞中的CD14+和CD163+程序有相似之处，但与CD16+程序不同。此外，该程序还包含与细胞黏附、迁移、分化和初始炎症反应相关的基因（例如VCAN、FCN1、LYZ、CD44和CCR2），这表明单核细胞在肿瘤组织中正在发生分化（图1）。
图1共识髓系细胞身份和活动程序的鉴定。
2. 四种主要的免疫调节程序
通过scRNA-seq和cNMF方法，从胶质瘤样本中识别出四种主要的免疫调节程序。这些程序在髓系细胞中广泛表达，并且在不同的髓系细胞类型（如小胶质细胞、巨噬细胞、单核细胞等）中共享。这些程序的表达不是由髓系细胞类型、发育起源或肿瘤突变状态决定的，而是由肿瘤微环境中的信号驱动，例如肿瘤缺氧、IL-1β、TGFβ和标准治疗药物地塞米松（Dex）。系统性炎症程序的特征基因为IL1B、IL1A、CCL2、TNF、OSM、CXCL8，这些基因编码的细胞因子和趋化因子在髓系细胞的招募和系统性炎症反应中起重要作用。它们能够促进炎症反应，招募其他免疫细胞进入肿瘤微环境。
微胶质细胞炎症程序的特征基因为CXCR4、CXCL12、CCL3、CCL4、CX3CR1、RHOB、JUN、KLF2、EGR1、PDK4、P2RY13，这些基因涉及淋巴细胞和单核细胞的招募、应激反应以及神经相互作用。该程序在脑部肿瘤中特有，能够促进炎症反应和免疫细胞的招募。
补体免疫抑制程序的特征基因为C1QA、C1QB、C1QC、C3、VSIG4、CD163
功能：这些基因编码的补体因子在伤口愈合和抗炎细胞因子反应中起作用，并与免疫抑制相关。它们能够抑制免疫反应，促进肿瘤微环境的免疫抑制状态。
吞噬免疫抑制程序的特征基因：MRC1（CD206）、MSR1（CD204）、CD163、LYVE1、COLEC12、STAB1、NRP1、RNASE1、CTSB，这些基因编码的吞噬受体能够清除细胞碎片和病原体，同时抑制T细胞功能，促进免疫抑制。
3. 免疫调节程序是共享的
91%的胶质瘤相关髓系细胞表达了这四种免疫调节程序中的至少一种。这些程序在多种髓系细胞类型中均有表达，且每种髓系细胞类型可以表达多个程序。这种广泛的但差异化的免疫调节程序表达是髓系细胞在胶质瘤中的一个显著特征。当使用传统的Louvain聚类和UMAP可视化方法重新分析这些单细胞数据时，免疫调节程序并未被重现。这些传统方法将细胞视为单一单位，并根据细胞之间的相似性进行聚类，主要按细胞类型组织数据，未能捕捉到活动程序。与之相比，cNMF方法能够隔离活动程序，从而揭示了髓系细胞在胶质瘤中的功能和生理。
4. 免疫调节状态贯穿中枢神经系统肿瘤
为了进一步研究这些免疫调节程序在其他中枢神经系统（CNS）肿瘤和非CNS肿瘤中的分布情况,我们整合了已发表的scRNA-seq数据集，并计算了髓系细胞中这些免疫调节程序的使用情况。在所有85个胶质瘤样本中，这四种免疫调节程序在所有样本中均有检测到。在其他CNS肿瘤中，如儿童胶质瘤和室管膜瘤，也观察到了完整的免疫调节程序。非CNS肿瘤的脑转移瘤保留了原发肿瘤的特征，几乎不表达微胶质细胞炎症和吞噬免疫抑制程序。在非CNS肿瘤中,系统性炎症和补体免疫抑制程序几乎在所有肿瘤类型中都有表达。然而，微胶质细胞炎症和吞噬免疫抑制程序主要特异性地存在于CNS肿瘤中。非肿瘤性脑组织中的髓系细胞表达了三种免疫调节程序，但吞噬免疫抑制程序缺失，这进一步支持了其在原发性CNS肿瘤中的特异性。
5. 髓系细胞状态的起源与可塑性
我们接下来考虑了发育起源、髓系细胞类型和免疫调节表型之间的相互关系,通过使用MAESTER工具,检测髓系细胞的线粒体DNA突变来推断其起源,分析了肿瘤相关髓系细胞和匹配的外周血单核细胞（PBMC）的线粒体DNA突变。研究发现，表达小胶质细胞程序的细胞更可能携带驻留细胞特异性变异，而其他髓系细胞类型更可能具有外周血变异。这表明，骨髓来源的髓系细胞可以在肿瘤中激活类似小胶质细胞的表型。
为了评估骨髓来源的外周细胞获得胶质瘤相关髓系表型的能力,我们利用了胶质瘤类器官（GBO）系统。通过将PBMC与免疫细胞耗竭的GBO经过一周的共培养后，GBO被髓系细胞广泛浸润。这些浸润的髓系细胞不仅分化为巨噬细胞表型，还上调了典型的小胶质细胞标记。相比之下，留在GBO外部的髓系细胞表达这些标记物的可能性要小得多。这些数据共同表明，血液来源的单核细胞可以激活所有与胶质瘤相关的髓系程序，包括小胶质细胞程序。研究证明了免疫调节程序的表达并不依赖于发育起源或细胞类型，并突出了髓系细胞在胶质瘤微环境中的可塑性。
6. 髓系细胞状态与肿生态位的关联
为了研究潜在的微环境驱动因素，通过整合scRNA-seq数据和胶质母细胞瘤的空间转录组学数据，揭示了髓系细胞的免疫调节程序在不同肿瘤生态位中的分布模式。我们使用10x Visium空间转录组学技术，分析了23个胶质母细胞瘤样本的68,830个50 µm大小的组织切片区域。通过cNMF（共识非负矩阵分解）方法，他们识别了六个主要的“生态位程序”，包括灰质和白质结构生态位、缺氧和血管代谢生态位、增殖癌细胞生态位以及由免疫细胞和反应性星形胶质细胞基因组成的炎症生态位。通过量化每个50µm切片区域中cNMF程序的表达，估计了每个区域的细胞含量。这种空间分析揭示了肿瘤中髓系细胞程序、癌细胞程序和其他细胞类型的清晰生态位特异性模式。研究发现，缺氧生态位通常被炎症生态位所包围，炎症生态位又与增殖癌细胞生态位相邻，增殖癌细胞生态位进一步延伸至白质区域。这种结构与临床观察到的大多数胶质瘤出现在白质中的现象一致。缺氧和炎症生态位也被血管生态位所包围，表明血管增殖是对缺氧的响应，也可能代表免疫细胞浸润的入口点。
缺氧也组织了髓系程序。吞噬免疫抑制程序，在血管和缺氧生态位中富集；补体免疫抑制程序，被排除在缺氧生态位之外，与周围的炎症和血管生态位相关；系统性炎症程序，与缺氧和炎症生态位相关；微胶质细胞炎症程序，在炎症和血管生态位中富集，但被排除在缺氧生态位之外。
通过空间回归模型分析细胞-细胞相互作用，发现吞噬免疫抑制程序与缺氧和血管生态位中的几乎所有细胞程序（包括MES2、MES1和单核细胞程序）之间存在多重相互作用。这些连接通过正交方法（如scRNA-seq数据集）得到验证，表明这些程序的平均使用率与手术样本中的吞噬免疫抑制程序高度相关（图2）。
图2免疫调节髓系程序与空间肿瘤生态位相关。
7. 髓系程序的临床相关性
我们接下来研究了髓系细胞身份和免疫调节程序是否与临床因素（如突变状态和治疗方法）相关.我们分析了髓系程序在不同临床背景下的表达模式，并评估了这些程序对免疫治疗反应和患者预后的影响。先前的研究报告称，IDH突变型肿瘤表现出更强的炎症表型，这被认为与突变产生的代谢物2-羟基戊二酸（2-hydroxyglutarate）有关。然而，研究者发现，这种差异更多地与肿瘤分级而非IDH突变状态相关。具体来说，IDH突变型肿瘤和IDH野生型肿瘤在4级（高级别）时的髓系程序组成非常相似，而在低级别IDH野生型肿瘤中，髓系程序的组成与低级别IDH突变型肿瘤相似。因此，髓系程序的差异更多地反映了肿瘤分级。
我们也研究了临床治疗是否会影响髓系状态。我们比较了原发性肿瘤与复发性肿瘤（后者均接受过肿瘤靶向治疗）的髓系程序组成，未发现显著差异。然而，我们发现补体免疫抑制程序与地塞米松治疗显著相关。地塞米松是一种常用于减少脑水肿的皮质类固醇，其剂量增加时，补体免疫抑制程序的表达也随之增加。在未接受地塞米松治疗的肿瘤中，该程序的表达显著降低。Dex通过激活糖皮质激素受体（GR）来影响转录活性，我们通过分析公共的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和RNA-seq数据，确认了地塞米松快速上调补体程序中的多个基因，这些基因中的许多是GR的直接结合靶点（图3）。
图3免疫调节髓系程序的临床相关性。
8. 髓系细胞与免疫疗法反应
为了进一步探讨了髓系细胞的免疫调节程序与免疫治疗反应之间的关系,我们分析了髓系程序在免疫治疗反应中的作用，并评估了这些程序对免疫治疗效果的影响。先前的研究发现,SIGLEC9阳性巨噬细胞与胶质瘤对免疫治疗的非反应性相关.我们重新分析了12例接受新辅助PD1阻断治疗的胶质瘤患者的单细胞RNA测序数据。研究发现，SIGLEC9阳性细胞在免疫调节程序的表达上具有异质性。只有表达吞噬免疫抑制程序的SIGLEC9阳性细胞在非反应性肿瘤中富集。此外，吞噬免疫抑制程序与非反应性胶质瘤的相关性比单独的SIGLEC9表达更强。
为了将这种关联扩展到更广泛的肿瘤类型，我们以调节性T（Treg）细胞作为免疫抑制环境和不良免疫反应的替代指标进行了研究。我们分析了髓系程序与Treg频率之间的关系。研究发现高Treg细胞频率的样本中，髓系细胞更倾向于表达吞噬和补体免疫抑制程序，而微胶质细胞炎症程序的表达则较少。因此，各自的髓系程序与不同的T细胞富集和免疫微环境相关。
最后，我们调查了免疫调节程序是否与总生存期相关。我们使用每个程序中的顶部基因对IDH野生型胶质母细胞瘤进行评分,并根据估计的髓系细胞含量进行调整.我们发现吞噬免疫抑制程序的高表达与总生存期缩短显著相关,而其他髓系活动程序或先前发表的髓系基因集均未显示出这种相关性.这些结果分析表明，胶质瘤特异性清除免疫抑制程序是T细胞免疫微环境、对检查点疗法的反应和总生存率的关键决定因素。
9. 免疫调节程序的调控因子
我们接下来试图将免疫调节表达程序与基因调控元件和上游转录因子（TFs）相关联。我们利用单核转座酶可及性染色质测序（snATAC-seq）数据，分析了20个人类胶质瘤中的36,675个单个髓系细胞的。基于推断的基因活性评分，计算每个髓系细胞的免疫调节程序使用情况，并为每个免疫调节程序创建了伪批量可及性分析。通过聚类分析，识别了与特定免疫调节程序相关的差异可及性位点，这些位点可能包含调控这些程序的启动子和增强子。进一步的基序扫描分析揭示了与特定免疫调节程序相关的转录因子结合基序。
我们结合单细胞调控网络推断和聚类（SCENIC）分析，进一步连接表达程序与转录因子网络。研究发现，系统性炎症程序与NF-κB相关转录因子强相关。吞噬免疫抑制程序与AP-1基序显著富集，其显著性比系统性炎症程序高出一个数量级。这表明AP-1可能在驱动吞噬免疫抑制程序中起关键作用（图4）。
图4与免疫调节髓系程序相关的调控回路。
10. 髓系细胞状态之间的反馈相互作用
我们进一步探讨了髓系细胞状态之间的反馈相互作用，特别是这些状态如何通过信号通路和环境配体相互影响。通过整合scRNA-seq数据和NicheNet数据库，识别了可能激活特定转录因子的配体。研究发现，NF-κB信号通路与系统性炎症程序相关的配体包括IL-1β、TNF、CCL2、IL-1α和IFNγ。AP-1信号通路与吞噬免疫抑制程序相关的配体包括IL-1β、TNF、PLAU、OSM、IL-10、IL-6和TGFβ。
我们使用GBO直接测试全身炎症程序表达的配体是否影响清除免疫抑制程序。研究发现，IL-1β和TGFβ显著诱导吞噬免疫抑制标记物的表达，其中IL-1β诱导的增加超过四倍。IFNγ增加系统性炎症标记物的表达，并减少免疫抑制标记物的表达。以上结果明确胶质瘤微环境中对系统性炎症和吞噬免疫抑制程序具有相反影响的特定配体。研究还表明，系统性炎症配体可能促进吞噬免疫抑制程序的表达，这可能是CNS肿瘤中限制炎症的一种反馈机制。
11. 髓系细胞状态与肿瘤生态位的关联
我们进一步探讨了Dex对髓系细胞状态的影响，特别是其诱导的免疫抑制表型的持久性。通过实验验证了Dex对髓系细胞的影响，并评估了这种影响的持久性。将Dex作用于含有内源性髓系细胞的GBO和被外周血髓系细胞浸润的GBO中。研究发现Dex特异性地诱导了补体免疫抑制程序的表达，而对吞噬免疫抑制程序没有影响。这种效应在含有内源性髓系细胞的GBO和被外周血髓系细胞浸润的GBO中均被观察到。通过分析公共的ChIP-seq和RNA-seq数据，确认了Dex快速上调补体程序中的多个基因，这些基因中的许多是GR的直接结合靶点。同时，Dex还抑制了NF-κB信号通路，这与系统性炎症程序相关。
最后，我们研究了这种Dex诱导的免疫抑制表型是否可逆。鉴于绝大多数胶质瘤患者在围手术期接受皮质类固醇治疗，并且免疫疗法试验通常在短期Dex停药期后开始，这是一个重要的临床问题。我们将Dex处理GBO两天后，将Dex洗脱，并在两周后评估补体免疫抑制程序的表达。研究发现，即使在Dex消除后两周，补体免疫抑制程序的表达仍未逆转。这表明Dex诱导的免疫抑制表型具有持久性。我们还测试了Dex对外周血单核细胞的影响。研究发现，Dex能迅速诱导PBMC中补体标记物的表达，且这种变化在单核细胞分化进入GBO后得以维持，即使在Dex撤除后也是如此。总的来说，这些数据表明，Dex通过激活激素响应的GR靶点并抑制默认的NF-κB相关的系统性炎症程序，从而推动了补体免疫抑制程序。这些结果突显了髓系细胞状态在胶质瘤浸润、分化和治疗过程中的可塑性，但同时也揭示了Dex诱导的免疫抑制状态具有显著的持久性，其不可逆性具有重要的临床意义。
12. 通过p300i靶向AP-1和吞噬程序
考虑到清道夫免疫抑制程序在胶质瘤中作为炎症和免疫反应抑制剂的突出作用，我们探讨了是否可以重新编程以创建更具炎症性的微环境。利用GBO测试了多种表观遗传调控因子抑制剂对髓系细胞表型的影响。
我们使用了GNE-781，一种选择性的p300/CBP溴结构域抑制剂（p300i），来处理GBO，并观察其对髓系细胞表型的影响。结果发现，经过7天的GNE-781处理，吞噬免疫抑制程序的使用显著减少，而系统性炎症程序的表达增加。这表明p300i能够重新编程髓系细胞，从免疫抑制表型转变为炎症表型。
为了探究GNE-781调节免疫抑制程序的机制，我们对处理过的GBO中的髓系细胞进行了ATAC-seq分析。研究发现，与GNE-781处理前相比，处理后髓系细胞中可及性降低的位点显著富集AP-1基序。这与AP-1在激活吞噬免疫抑制程序中的作用一致,并可能解释了GNE-781对髓系细胞表型的影响。以上结果表明,GNE-781通过抑制p300/CBP的活性,降低了AP-1的活性，从而减少了吞噬免疫抑制程序的表达,并促进了系统性炎症程序的表达（图5）。
图5免疫调节程序的功能诱导与逆转。
在这项研究中,我们通过整合单细胞RNA测序、染色质可及性分析、空间转录组学和胶质瘤类器官模型等多种技术手段，研究揭示了胶质瘤中髓系细胞的四种主要免疫调节程序：系统性炎症、微胶质细胞炎症、补体免疫抑制和吞噬免疫抑制。这些程序在不同髓系细胞类型中广泛共享，且由肿瘤微环境而非细胞类型或起源决定。研究还发现，地塞米松可诱导持久的免疫抑制状态，而p300抑制剂（p300i）能通过靶向AP-1重新编程髓系细胞，减少免疫抑制并增强炎症反应，为胶质瘤免疫治疗提供了新策略。
参考文献
Miller TE, El Farran CA, Couturier CP, Chen Z, D’Antonio JP, Verga J, Villanueva MA, Gonzalez Castro LN, Tong YE, Saadi TA, Chiocca AN, Zhang Y, Fischer DS, Heiland DH, Guerriero JL, Petrecca K, Suva ML, Shalek AK, Bernstein BE. Programs, origins and immunomodulatory functions of myeloid cells in glioma. Nature. 2025 Feb 26. doi: 10.1038/s41586-025-08633-8IF: 50.5 Q1 IF: 50.5 Q1 B1.