导语
氮杂环的氮氧化反应在有机化学领域应用广泛，在众多天然产物及药物和农药中间体的合成过程中扮演着不可或缺的角色。然而，该反应存在效率低以及区域选择性不佳的难题。近日，浙江大学杭州国际科创中心郑文隆研究员在Nature子刊Nature communications发表论文，该研究聚焦Bacillus megaterium来源的P450BM3，深入研究了该酶对氮杂环化合物的氮氧化能力。
氮杂环化合物在药物中的应用及模型反应（来源：Nat. Commun.）
前沿科研成果
首先，作者以喹啉作为模式底物，通过分子动力学模拟（MD），发现活性中心的空间位阻阻碍了氮杂环接近血红素铁氧原子（heme-Fe=O）。经过分子对接，选择了位于活性中心的十二个氨基酸位点，利用简并密码子进行定点饱和诱变。经过筛选，L75F、V78S、F87G、A264P、I401P、A328L和L437G等7个单点突变体表现出氮氧化活性，分别为8.7%、4.5%、82.7%、4.3%、14.3%、16.7%和26.6%。然后作者对这些位点进行了CAST/ISM组合突变，以产生具有提高氮氧化选择性的突变体。以F87G为出发菌株，经过筛选获得两个两点突变体F87G/I401P和F87G/A264G表现出增强的氮氧化选择性，从82.7%分别提高到85.7%和92.7%。其中，F87G/A264G突变体在氮氧化选择性和转化方面表现最好，因此被选中进行进一步进化。在第三轮组合诱变中，F87G/A264G/A328L突变体表现出最高的氮氧化选择性，达到98.5%，转化率达到68.2%。综上，经过几轮迭代组合诱变，F87G/A264G/A328L突变体在喹啉氮氧化方面表现最佳。
野生型P450BM3模型MD及选择性筛选结果（来源：Nat. Commun.）
作者进一步测试了一系列氮杂环底物，包括喹啉、异喹啉和吡啶等，结果表明，F87G/A264G/A328L突变体（GGL）对化合物1a、7a、8a和9a的氮氧化选择性（92.3% ~ 99.0%）和底物转化率（73.5% ~ 99.3%）较高。对于化合物4a、10a和11a， GGL表现出中等的氮氧化选择性，超过80%。此外，F87G/A264G变体（GG）对3a的氮氧化选择性为97.6%，转化率为74.7%。F87G/I401P （GP）突变体对2a的氮氧化选择性为86.6%，转化率为53.8%。
（来源：Nat. Commun.）
为了揭示底物识别和氮氧化的分子机制，作者对野生型P450BM3、突变体F87G和F87G/A264G/A328L配体模型进行了MD模拟。结果显示，喹啉在野生型酶活性中心有明显的结合取向。87位苯丙氨酸残基呈垂直于喹啉苯环的构象，与喹啉形成T-shaped π-π stack相互作用。这种构型施加空间位阻，从而阻止喹啉接近heme-Fe=O。喹啉的氮原子与血红素-o基团的氧原子之间的平均距离（d₁）为6.7±0.6 Å，这一距离不足以支持有效的氮氧化。用甘氨酸取代苯丙氨酸（F87G）缓解了这种位阻，将d₁降低到5.5±0.7 Å，并改善了与活性中心的位阻。随后的突变，包括A328L和A264G，进一步细化了喹啉的结合构象。在GGL突变体中，d₁进一步减小到5.2±0.5 Å，而heme-Fe=O基团与喹啉氮原子之间的角度（θ₁）从147.4±9.7°减小到122.6°±6.2°。
基于以上实验结果，作者提出了一个“推拉”模型来描述P450BM3的底物识别和氮氧化选择性机制。在模型GGL中，A328L突变引入了一个侧链较长的非极性残基，有效地将底物“推向”heme-Fe=O基团。同时，A264G突变降低了位阻，使I263残基与喹啉的芳香吡啶环形成π-stacking相互作用（amide-π stacked and π-alkyl），这在蛋白质与配体的结合亲和力中起着至关重要的作用，将底物拉入最佳催化取向。“推拉”机制在以异喹啉为底物的模拟中也很明显。来自L328的位阻效应，加上I263与异喹啉吡啶环之间的π-alkyl相互作用，促进了“推-拉”相互作用，有效地将异喹啉定位在其最佳催化构象中。
（来源：Nat. Commun.）
为了进一步评估P450BM3突变体的应用潜力，作者将F87G/A264G/A328L突变体在50 ml的反应器中进行放大反应。采用基于GDH -葡萄糖的辅助因子再生系统来维持NADPH的持续供应。反应10小时后，喹啉（1a）的转化率超过99.3%。喹啉的氮氧化选择性超过99.0%。此外，以异喹啉和4-溴异喹啉作为底物。反应10小时后，异喹啉（7a）和4-溴异喹啉（8a）的氮氧化转化率分别达到95.6%和92.5%，选择性为98.0%和97.1%。这些发现强调了工程化P450BM3酶对氮杂环进行绿色高效氮氧化的能力，突出了其可持续制备规模合成的潜力和在工业生物催化中的广泛适用性。
（来源：Nat. Commun.）
论文第一作者为浙江大学化工学院杨柳，通讯作者为浙江大学杭州国际科创中心郑文隆研究员。
论文信息
Regulating the N-oxidation selectivity of P450BM3 monooxygenases for N-heterocycles through computer-assisted structure-guided design
Liu Yang, Zhongji Pu, Jianping Wu, Xiaofeng Liu, Zhe Wang, Haoran Yu, Liuwei Wang, Yan Meng, Gang Xu, Lirong Yang & Wenlong Zheng
Nat. Commun. 2025, DOI: 10.1038/s41467-025-61773-3