2025年10月7日，瑞士伯尔尼大学Britta Engelhardt在Nature communications发表：In vivo imaging of the barrier properties of the glia limitans during health and neuroinflammation，揭示了健康和神经炎症期间胶质界膜屏障特性的活体成像。
胶质界膜包裹着整个中枢神经系统（CNS）实质的外表面以及血管周围间隙，由一部分星形胶质细胞构成，这些星形胶质细胞战略性地位于这些实质外周边界处。目前对胶质界膜在健康状态和神经炎症期间的屏障特性仍了解不足。通过开发一种水通道蛋白-4（Aqp4）-mRuby3基因敲入报告小鼠可实现对表层和血管周围胶质界膜的活体成像，胶质界膜对可溶性介质、微珠和免疫细胞均构成屏障。将Aqp4-mRuby3报告小鼠与针对血管、软脑膜或髓系细胞的其他报告基因小鼠联合使用能够精确区分免疫细胞位于中枢神经系统边界区域还是实质内部，从而明确其在中枢神经系统免疫监视与神经病理过程中的功能作用。Aqp4-mRuby3报告小鼠的出现将有助于进一步加深对胶质界膜在中枢神经系统免疫豁免中所起主动作用的理解。
图一 Aqp4-mRuby3基因敲入报告小鼠的表征
为了实现对胶质界膜的活体可视化，作者利用了水通道蛋白4（AQP4）在形成胶质界膜的血管周围和软膜下星形胶质细胞中的极性表达特性。
研究人员构建了Aqp4-mRuby3基因敲入小鼠，将红色荧光蛋白mRuby3插入水通道蛋白AQP4的第二胞外环，使其在星形胶质细胞表面正确表达并形成正交颗粒阵列（OAPs）。该融合蛋白定位于血管周围终足和脑脊髓表面的胶质界膜，与内源性AQP4分布一致并靠近基底膜、血管内皮和星形胶质细胞标志物。小鼠发育正常，遗传稳定且在血-视网膜屏障处也有表达。结果表明，AQP4-mRuby3能真实反映AQP4的生理定位，是研究星形胶质细胞极性和胶质-血管界面的可靠工具。
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图二 杂合子小鼠中AQP4-mRuby3的表达不影响神经炎症
研究发现，纯合子Aqp4-mRuby3小鼠大脑含水量轻微但显著增加，提示AQP4功能可能受影响；而杂合子小鼠脑和脊髓含水量正常，水分调节未受损。在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中，杂合子小鼠的临床症状、免疫反应、炎症细胞浸润及疾病进展与野生型小鼠无异且AQP4-mRuby3融合蛋白在炎症区域同样出现极性丢失，与内源性AQP4变化一致。结果表明，杂合子Aqp4-mRuby3小鼠能正常表达融合蛋白，不影响生理水分平衡或神经炎症进程，是研究AQP4动态变化的可靠模型。
图三 Aqp4-mRuby3基因敲入报告小鼠可用于胶质界膜的活体成像
接下来，作者通过在右脑半球皮层表面放置的颅窗或磨薄颅骨制备以及在颈椎脊髓处开窗，利用双光子活体显微镜对杂合子Aqp4-mRuby3报告小鼠进行成像，以探索其用于大脑和脊髓胶质界膜活体检测的适用性。
结果：
在双光子活体显微镜成像过程中，通过注射10 kDa的FITC-葡聚糖来显示血管腔。使用1045 nm的激发波长，可以在预期的脑部血管周围和表层胶质界膜位置检测到AQP4-mRuby3信号。研究利用Aqp4-mRuby3杂合子小鼠结合双光子活体显微镜和共聚焦成像，发现AQP4-mRuby3在血管周围星形胶质细胞终足呈强极性表达，而在表层胶质界膜则呈弥散分布。电镜和共聚焦成像证实，表层胶质界膜由星形胶质细胞胞体和突起构成，其AQP4-mRuby3极性分布于细胞外表面，且从表层到血管周围呈连续过渡。双光子成像中，二次谐波信号可清晰标记胶原结构，辅助定位。结果表明，Aqp4-mRuby3小鼠能真实反映AQP4的极性分布，适用于大脑和脊髓胶质界膜的活体动态成像研究。
图四 在Aqp4-mRuby3小鼠中对胶质界膜的可视化能够实现体内区分CX3CR1-GFP+脑膜巨噬细胞和小胶质细胞
胶质界膜有助于中枢神经系统分区的形成，从而构建出容纳不同亚群中枢神经系统常驻髓系细胞的区域。研究通过杂交Aqp4-mRuby3和CX3CR1-GFP小鼠，结合双光子活体成像，实现了对中枢神经系统不同髓系细胞的精准区分。利用AQP4-mRuby3标记的胶质界膜和胶原的二次谐波信号，可清晰定位硬脑膜、蛛网膜下腔和血管周围间隙中的边界相关巨噬细胞，以及实质内的小胶质细胞。
结果：
结果显示，硬脑膜巨噬细胞呈圆形、静止；边界相关巨噬细胞沿血管分布于胶质界膜外侧，形态偏阿米巴样；小胶质细胞位于实质内，突起动态扫描并接触胶质界膜。在脊髓中，边界相关巨噬细胞丰富，而小胶质细胞数量明显少于大脑，与既往研究一致。该模型有效解决了传统CX3CR1-GFP小鼠难以区分巨噬细胞亚群的问题，为研究脑-脊髓免疫微环境提供了高精度的活体成像工具。
该研究通过新型Aqp4-mRuby3报告小鼠，实现了对胶质界膜屏障的活体动态成像，首次在活体水平清晰区分小胶质细胞与边界相关巨噬细胞，并揭示其在健康与神经炎症中的空间关系和结构变化，为理解神经免疫交互、屏障功能失调及开发靶向治疗提供了关键工具和新视角。
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