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开发能够与治疗性蛋白结合的大环分子通常依赖大规模筛选方法，这些方法资源消耗巨大，并且对结合模式缺乏精确控制。尽管蛋白设计领域已有进展，但目前仍缺乏稳健的方法来实现蛋白结合大环分子的从头设计。

针对当前问题，华盛顿大学蛋白质设计研究所研究团队联合塔尔茨大学、杜塞尔多夫大学、麻省理工学院的研究人员于2025年6月20日在《Nature Chemical Biology》期刊上发表文章，题为“Accurate de novo design of high-affinity protein-binding macrocycles using deep learning”。文章介绍了名为RFpeptides的去噪扩散模型设计流程，用于针对特定蛋白靶点设计大环配体。针对四种不同蛋白，每种测试了不超过20个设计的大环分子，并在所有靶点上都获得了中等到高亲和力的结合分子。

首先评估了RF2结构预测网络对已知大环肽结构的建模能力。在RF2中实现了一种经过修改的环状相对位置编码(图1a)，并观察到其能够稳健地预测天然大环肽结构。将环状位置编码方案加入RFdiffusion，并观察到其能够稳健地产生多样的大环肽(图1b,c)。虽然并未尝试全面枚举环肽单体的结构空间，但RFpeptides可以轻松扩展，用于全面覆盖大环肽可及的结构空间。受到环状位置编码可迁移性的鼓舞，进一步尝试利用RFdiffusion来实现蛋白结合大环分子的从头设计。具体而言，修改了RFdiffusion的蛋白结合物设计流程。对于生成的大环链采用环状相对位置编码，而靶链及链间编码保持标准形式(图1d)。随后，引入ProteinMPNN为RFdiffusion生成的骨架设计氨基酸序列(图1e)。将这一整合流程称为RFpeptides，其能够针对靶蛋白生成包含多样二级结构的大环分子(图1f)，并且结合标准RFdiffusion的功能，能够显著将生成的结合物分布偏向所需的残基。

如图1a所示，环对称相对位置编码能够生成大环肽骨架，其N端与C端通过肽键相连。该相对位置编码通过在索引j相对于索引i超过环的一半时，将正向位置编码(即向右)切换为负向编码(即向左)来实现环化。RFpeptides的设计流程如图1e所示，从随机初始化的原子出发，经由RFdiffusion的逐步去噪过程生成大环骨架，随后利用ProteinMPNN进行氨基酸序列设计。设计模型根据AfCycDesign的结构预测计算指标，以及Rosetta的基于物理的界面质量指标进行筛选。

首先选择髓系白血病细胞蛋白1(MCL1)作为靶蛋白。它在自噬、细胞存活、DNA修复和细胞增殖中发挥作用，是一个有前景的抗癌治疗靶点。针对MCL1，使用RFpeptides生成了9965种多样的大环肽骨架，随后进行了四轮迭代的ProteinMPNN与Rosetta Relax，为每个骨架设计了四条氨基酸序列。为筛选实验测试的候选分子，使用AfCycDesign从大环序列和靶点结构重新预测设计的大环-靶点复合物。筛选标准包括置信度指标(界面预测比对误差iPAE)以及设计模型与AfCycDesign预测复合物的相似性。为了进一步提高筛选严格性，还使用 RF2重新预测复合物结构。进一步利用Rosetta计算界面和大环质量的基于物理的指标，例如预测结合亲和力(ddG)、空间聚集倾向(SAP)以及界面接触的分子表面积(CMS)。在严格过滤后，最终选择了27个设计进行合成，以及生化和生物物理表征。所有入选的设计都结合在功能相关的MCL1-BH3相互作用位点。所有设计均包含一个α螺旋片段，但它们在序列、大环环化位置和与靶点的相互作用方面各不相同(图2)。除螺旋基序外，所选大环的环区也通过侧链和主链介导的相互作用在结合界面中发挥了重要作用。

在化学合成中，有13个设计的正确环化产物收率过低，无法进一步表征。测试了剩余的14个大环对生物素化MCL1的结合，采用表面等离子体共振(SPR)单循环动力学实验。其中三个大环显示出与MCL1的结合活性，最佳结合物MCB_D2(MCL1 binding design 2)(图3a)的结合亲和力为2μM(图3b)。

进一步尝试设计结合MDM2的大环。MDM2是一种与肿瘤抑制蛋白p53相互作用的E3泛素连接酶，在肿瘤生长和存活中具有多种关键作用。生成了10000个大环骨架，长度在16-18 个残基之间，适于化学合成。随后通过多轮ProteinMPNN与Rosetta Relax协议，为每个骨架设计了4条氨基酸序列。设计模型根据AfCycDesign预测的置信度和与设计复合物的相似性，以及Rosetta计算的界面质量指标进行筛选。最终测试了筛选后剩余的8条肽与生物素化MDM2的结合(SPR实验)，在100μM浓度下观察到其中3条肽显示结合信号。最佳设计为MDB_D8(图3g)，在SPR单循环动力学实验中表现出1.9μM的结合亲和力(图3h)。该设计的计算模型在界面上形成了若干关键接触，与天然MDM2-p53复合物结构中的相互作用类似(图3i)。尽管整体结构不同，SPR实验中筛选出的三个结合物均具有类似的结合基序：来自大环螺旋片段的苯丙氨酸、色氨酸以及亮氨酸或蛋氨酸。

最终成功合成了6种设计(纯度>90%)，并使用SPR测试其与GABARAP的结合。其中GAB_D8和GAB_D23显示出纳摩尔级亲和力，分别为6nM和36nM(图4b,e)。为进一步验证其结合特性，检测了这些设计是否能在AlphaScreen实验中干扰GABARAP与线性肽K1(该位点的已知结合肽)的相互作用。结果显示GAB_D8和GAB_D23的半数抑制浓度(IC50)分别为0.7nM和2.5nM(图4i)。据经验所知，GAB_D8是迄今最强效的大环型GABARAP结合物。

进一步尝试设计能够结合无实验结构信息靶点的大环结合物。选择了Rhombotarget A(RbtA) 作为靶点，目前尚无该蛋白的实验解析结构，且基于序列的数据库检索未能找到与其明显匹配的结构。在未设定热点残基的初步设计中，发现了N端结构域的一块潜在结合区域，随后在大规模设计计算中选择了该区域作为目标，并定义Leu144、Phe202、Phe204、Tyr206、Val208、Leu231和Ala269为热点残基以引导肽主链的生成(图5a)。共生成20000条大环主链，并通过多轮ProteinMPNN和Rosetta Relax为每条主链设计四条氨基酸序列。随后基于AfCycDesign的可信度指标和Rosetta的界面质量指标对设计结果进行筛选。最终，根据评价指标，筛选出26个设计进入生化与结构验证阶段。进一步的SPR实验测定表明，最佳结合物RBB_D10的解离常数(K_d)为9.4nM(图5b)。随后进行了结构验证与结合模式确认，结果表明，即便在靶点缺乏深口袋或无已知结构的情况下，RFpeptides依然能够实现高准确和高成功率的大环设计。

在本研究中，作者提出一种基于生成式深度学习的流程RFpeptides，能够针对多种蛋白靶点进行高精度的从头大环结合物设计。设计出的大环结合物对GABARAP和RbtA的亲和力极高，并且大环结合于MCL1、GABARAP和RbtA的晶体结构与设计模型几乎完全一致。RFpeptides设计无需依赖已知的配体或结合伙伴信息，仅凭靶点的结构或序列，即可完成完全从头大环设计，从而能够作用于以往方法难以处理的分子靶点。此外，并不限于生成特定模体或拓扑的大环，其扩散过程可生成具有多种形状与尺寸的大环，并自动选择最适合靶蛋白的拓扑。RFpeptides将能快速实现广泛分子靶点的定制化大环结合物设计，从而加速多种功能性肽的研发。随着深度学习方法和框架的快速进步，尤其是近期全原子扩散模型的出现，未来的目标是将该方法扩展到含有非天然氨基酸、交联剂和多样环化化学策略的大环生成式设计。