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本文转自【微生态】公众号
背景：断奶应激引起的腹泻被广泛认为与肠道菌群失调有关。然而，明确哪些特定的肠道微生物及其代谢产物在断奶仔猪的抗腹泻过程中发挥关键作用一直是一个挑战。
结果：在这项研究中，我们首先观察到，与健康仔猪相比，腹泻仔猪的平均日增重较低，腹泻评分较高，脂多糖（LPS）和D-乳酸（D-LA）的水平升高。随后，我们分析了健康和腹泻断奶仔猪之间的肠道微生物组成和代谢物水平的差异。腹泻仔猪表现出肠道菌群失调，主要特征是厚壁菌门与拟杆菌门的比例较高，缺乏Lactobacillus amylovorus 和 Lactobacillus reuteri，但Bacteroides sp.HF-5287和Bacteroides thetaiotaomicron的丰度增加。基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据对肠道微生物群的功能进行了分析，结果显示色氨酸代谢是在腹泻仔猪中最显著受到抑制的途径。大多数色氨酸代谢产物在腹泻仔猪中的浓度低于健康仔猪。此外，我们探讨了日粮中关键色氨酸代谢产物吲哚-3-醛（IAld），对断奶仔猪肠道发育和肠道屏障功能的影响。在日粮中补充100mg/kg的IAld可以通过促进仔猪肠道干细胞（ISC）的扩增来增加小肠指数并改善肠道屏障功能。在猪肠道类器官中也证实了IAld促进ISC扩张的作用。
结论：这些发现揭示了肠道微生物色氨酸代谢产物IAld通过促进ISC扩张来缓解断奶仔猪肠道发育受损。
原名：The gut microbial metabolite indole-3-aldehyde alleviates impaired intestinal development by promoting intestinal stem cell expansion in weaned piglets
译名：肠道微生物代谢物吲哚-3-醛通过促进肠道干细胞增殖缓解断奶仔猪肠道发育损伤
期刊：Journal of Animal Science and Biotechnology
DOI号：10.1186/s40104-024-01111-7
图1显示了健康和腹泻仔猪的典型特征。与健康仔猪相比，腹泻仔猪的平均日增重更低，腹泻评分更高（P < 0.05，图1a和b）。为了研究断奶腹泻对仔猪肠道屏障的影响，我们测量了血清中LPS和D-LA的水平。结果显示，与健康仔猪相比，腹泻仔猪的血清D-LA水平显著更高（P < 0.05），并且血清LPS水平有增加的趋势（0.05 < P < 0.10）（图1c和d）。这些发现表明，腹泻仔猪最有可能表现出肠道屏障损伤。
图1. 对健康和腹泻断奶仔猪的生长、腹泻严重程度和肠道屏障功能进行评估。a 平均日增重。b 腹泻评分。c 血清中LPS的浓度。d 血清中D-LA的浓度。数据表示为均值±标准误差（n=10）。* P<0.05
为了探索腹泻和健康仔猪粪便微生物群之间的差异，我们进行了16S rRNA基因和宏基因组测序，以分析粪便微生物组的组成和功能特征。基于UniFrac的主坐标分析（PCoA）显示，腹泻仔猪的细菌组成与健康仔猪显著不同（P < 0.05，图2a）。然而，通过Chao指数测量的粪便微生物群的α多样性在两组之间没有显示出显著差异（P > 0.05，图2b）。在门水平上，厚壁菌门和拟杆菌门是健康和腹泻仔猪中两个最丰富的门（图2c）。腹泻仔猪的厚壁菌门相对丰度更高，拟杆菌门相对丰度更低，与健康仔猪相比（P < 0.05，图2d）。因此，腹泻仔猪的厚壁菌门与拟杆菌门的比例显著升高（P < 0.05，图2e）。
在属水平上，与健康仔猪相比腹泻仔猪的Prevotella、Subdoligranulum、Collinsella、Blautia和Ruminococcus gauvreauii的比例显著更高，而Phascolarctobacterium的比例显著更低（P<0.05，图2f）。在种水平上，腹泻仔猪中Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus reuteri和Ruthenibacterium lactatiformans的相对丰度显著降低，而Bacteroides sp.HF-5287和Bacteroides thetaiotaomicron的相对丰度显著增加（P<0.05，图2g）。这些结果表明，腹泻仔猪显示出肠道微生物群失调。
图2. 健康和腹泻断奶仔猪粪便微生物群的结构和组成。a 主坐标分析（PCoA）。b Chao指数代表α多样性。c 门水平分布。d 厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度。e 厚壁菌门与拟杆菌门相对丰度的比率。f 显示前20个属相对丰度的热图可视化。g 显示前30个种相对丰度的热图可视化。红色字体表示与CON组相比，细菌属和种的相对丰度显著增加。绿色字体表示与CON组相比，细菌属和种的相对丰度显著减少。数据表示为均值±标准误差（n=10）。*P<0.05。
接下来，我们分析了宏基因组测序数据，以研究健康和腹泻仔猪之间微生物组功能特征的差异。首先，比较了微生物KEGG途径。色氨酸代谢显示出最显著的差异（P<0.05，图3a）。为了评估微生物群产生色氨酸代谢物的遗传潜力，我们确定了映射到KEGG色氨酸代谢途径（map00380）的DNA序列读数的标准化相对丰度。与健康仔猪相比，腹泻仔猪中参与色氨酸代谢的基因的相对丰度显著降低（P<0.05，图3b）。此外，基于分配给每个KEGG同源基因（KO）基因的TPM丰度，分析了色氨酸代谢中属水平的序列分布。在腹泻仔猪中相对丰度较低的参与色氨酸代谢的基因主要被系统发育学归类为Bacteroides属（14.50 vs. 25.42）、Prevotella属（14.70 vs. 15.09）、Methanobrevibacter属（8.46 vs. 18.41）、Lactobacillus属（10.89 vs. 12.30）和Clostridium属（9.12 vs. 12.02）（P<0.05，图3c）。我们鉴定了健康和腹泻仔猪中参与微生物色氨酸分解代谢的所有已知酶或KOs。共发现21个KOs，其中3个关键KOs K07130（P < 0.05）、K01667（P < 0.05）和K00128（0.05 < P < 0.10）在健康和腹泻仔猪之间显示出变化或变化趋势（图3d–g）。编码犬尿氨酸3-单加氧酶（kynB）、色氨酸酶（tnaA）和醛脱氢酶（ALDH）的基因的相对丰度负责将色氨酸转化为犬尿氨酸（Kyn）、吲哚、吲哚-3-乙酸（IAA）或吲哚-3-醛（IAld）的酶（图3d）。与健康仔猪相比，kynB酶（P < 0.05）和tnaA酶（P < 0.05）显著降低，ALDH酶（0.05 < P < 0.10）显示出下降趋势（图3d–g）。这表明腹泻仔猪的微生物群产生色氨酸代谢物的遗传潜力显著下调。
图3. 健康和腹泻断奶仔猪粪便微生物组在色氨酸代谢方面的不同功能。a 基于P值的CON组和DIA组之间前10个差异基因表达的功能性分析。b 映射到KEGG色氨酸代谢途径（map00380）的DNA序列读数的标准化相对丰度。c 基于分配给每个KO基因的TPM丰度，色氨酸代谢中属水平的序列的系统发育分布。d 卡通图显示了色氨酸分解为犬尿氨酸（Kyn）、吲哚、吲哚-3-乙酸（IAA）和IAld以及每个途径中涉及的酶。e–g 健康和腹泻仔猪中参与微生物色氨酸分解的酶的相对丰度。KynB，犬尿氨酸3-单加氧酶。tnaA，色氨酸酶。ALDH，醛脱氢酶。结果表示为均值±标准误差（n=10）。* P<0.05。
为了进一步探索腹泻对微生物产生色氨酸代谢物的影响，我们使用靶向代谢组学检测了健康和腹泻仔猪粪便中关键色氨酸代谢产物的浓度。发现了六种色氨酸分解代谢物，与健康仔猪相比，腹泻仔猪的四种分解代谢物（包括IAld、2-吲哚羧酸、3-吲哚丁酸、吲哚-3-羧酸）显著降低（P<0.05，图4a-d）。与健康仔猪相比，腹泻仔猪的吲哚-3-乙酸甲酯呈下降趋势（0.05<P<0.10，图4e）。此外，我们确定了这六种色氨酸分解代谢物与腹泻相关指标之间的相关性。腹泻评分和血清LPS浓度与大多数色氨酸分解代谢物呈负相关，包括IAld、3-吲哚丁酸和2-吲哚羧酸（P<0.05，图4g）。相反，ADG与仔猪粪便中IAld和吲哚-3-乙酸甲酯的浓度呈正相关。总的来说，这些数据表明腹泻仔猪的微生物产生色氨酸代谢物的能力下降。
图4. 健康和腹泻断奶仔猪之间微生物产生色氨酸代谢产物的差异以及色氨酸代谢产物与腹泻相关指标之间的相关性。a–f 仔猪粪便中IAld、2-吲哚羧酸、3-吲哚丁酸、吲哚-3-羧酸、吲哚-3-乙酸甲酯和3-吲哚丙酸的浓度。g 六种色氨酸代谢产物与腹泻相关指标之间的相关性分析。数据表示为均值±标准误差（n=10）。* P<0.05。
4.吲哚-3-醛促进断奶仔猪肠道屏障功能和小肠上皮细胞增殖
为了研究微生物群中的关键色氨酸代谢产物IAld在断奶仔猪肠道屏障功能和发育中的作用，我们进行了为期两周的饮食干预，通过在基础饮食中补充100毫克/千克IAld。干预后，与CON组仔猪相比，IAld组仔猪的小肠重量/长度比和小肠指数显著增加（P<0.05，图5a和b）。日粮中补充IAld还显著改善了小肠形态，增加绒毛面积（P<0.05，图5c和d）。为了进一步探索IAld对肠道屏障功能的影响，我们进行了Villin和Mucin2的免疫荧光染色。值得注意的是，日粮中补充100mg/kg IAld显著增加了杯状细胞（由Mucin2标记）的数量和Muc2 mRNA的表达（P<0.05，图5g–i）。相比之下，IAld组和CON组小肠中的肠上皮细胞（以Villin标记）数量没有显著差异（P>0.05，图5e和f）。此外，在IAld组中，紧密连接蛋白Occludin的表达上调（P < 0.05），而Claudin 1的表达显示出增加的趋势（0.05 < P < 0.10）（图5j和k）。
图5. IAld对断奶仔猪小肠组织学和肠道屏障功能的影响。a 小肠重量与长度的比率。b 小肠指数。c 来自CON组和IAld组仔猪小肠组织切片的代表性H&E染色（比例尺，200μm）。d 绒毛面积。e CON组和IAld组仔猪小肠免疫染色抗Villin抗体（红色）并用DAPI（蓝色）复染的代表性图像（比例尺，200μm）。f 小肠中Villin的平均荧光强度。g CON组和IAld组仔猪小肠免疫染色抗Mucin2抗体（红色）并用DAPI（蓝色）复染的代表性图像（比例尺，200μm）。h 小肠每绒毛的Mucin2阳性细胞数。i MUC2的相对mRNA表达。j 小肠中Occludin和Claudin1的免疫印迹分析（n=4）。k 小肠中Occludin和Claudin1的相对蛋白表达水平（n=4）。数据表示为均值±标准误差(a–i) n=8。* P<0.05。
接下来，我们探索了IAld对肠道上皮细胞增殖和分化的影响。免疫荧光染色显示，补充IAld显著增加了Olfm4+ ISCs的数量（P<0.05，图6a和b），并显著促进了小肠中ISCs的分化（由KRT20标记）（P<0.05，图6c和d）。此外，在IAld组，ISCs标志物（Olfm4和Lgr5）、增殖（PCNA）和Paneth细胞（LYZ）的mRNA表达水平上调（P<0.05，图6e）。补充IAld可上调CYP1A1（AHR靶基因）、β-catenin和Wnt/β-catenin靶基因c-Myc的mRNA表达（P<0.05，图6f和g）。AHR（IAld配体）和Wnt/β-catenin靶基因Cyclin D1的mRNA表达在IAld组中显示出增加的趋势（0.05 < P < 0.10，图6f和g）。Lgr5和活性β-catenin/β-catenin的蛋白表达也在IAld组中上调（P<0.05，图6h–j）。综合这些发现表明，IAld在促进断奶仔猪小肠的肠道屏障功能和ISCs扩张中发挥着重要作用。
图6. 图6 IAld对断奶仔猪小肠上皮细胞增殖和分化的影响。a CON组和IAld组仔猪小肠免疫染色抗Olfm4抗体（红色）并用DAPI（蓝色）复染的代表性图像（比例尺，200μm）。b 小肠中Olfm4的平均荧光强度。c CON组和IAld组仔猪小肠免疫染色抗KRT20抗体（红色）并用DAPI（蓝色）复染的代表性图像（比例尺，200μm）。d 小肠中KRT20的平均荧光强度。e 小肠中Olfm4、Lgr5、PCNA和LYZ的相对mRNA表达。f 小肠中AHR和CYP1A1的相对mRNA表达。g 小肠中β-连环蛋白、c-Myc和Cyclin D1的相对mRNA表达。h 小肠中Lgr5、活性β-catenin、β-catenin和PCNA的免疫印迹分析（n=4）。i 小肠中Lgr5和PCNA的相对蛋白表达水平。j 小肠中活性β-catenin与β-catenin相对蛋白表达水平的比率。数据表示为均值±标准误差。(a–g) n=8。* P<0.05。
从分离的肠道隐窝培养出的类器官通常被用作模型，以重现肠道的正常生理学。为了进一步确认IAld在促进ISC扩张中的作用，我们使用了猪的小肠类器官模型。IAld显著增强了类器官的出芽效率和表面积（P<0.05，图7a–c）。此外，IAld组中AHR和CYP1A1的mRNA表达水平显著提高（P<0.05，图7d）。与对照组相比，IAld组中Lgr5和活性β-catenin的蛋白表达水平也显著更高（P<0.05，图7e和f）。总体而言，这些发现表明IAld促进了仔猪小肠中ISC的增殖。
图7. IAld对小猪小肠类器官增殖的影响。a 第3天的肠道类器官的代表性图像（比例尺，100μm）。b 和 c 小猪类器官的出芽效率和表面积。d 小猪类器官中AHR和CYP1A1的相对mRNA表达。e 小猪类器官中Lgr5和活性β-catenin的免疫印迹分析。f 小猪类器官中Lgr5和活性β-catenin的相对蛋白表达水平。数据表示为均值±标准误差（每个组别3个孔）。* P<0.05。
人们普遍认为，断奶后腹泻与肠道菌群失调密切相关。为了识别断奶仔猪抗腹泻过程中的关键肠道微生物种类和微生物代谢产物，我们首先比较了腹泻和健康仔猪的肠道微生物及其代谢产物。结果显示，患有腹泻的仔猪肠道微生物产生的色氨酸代谢产物显著减少。此外，我们证明了IAld，一种关键的色氨酸代谢产物，能够改善肠道屏障功能，提高腹泻仔猪血清中的D-LA和LPS水平，这表明肠道通透性增加，导致腔道细菌、毒素和抗原转移到上皮下组织。这种转移可能是断奶后腹泻的一个关键原因。
肠道菌群失调是断奶后腹泻的一个标志。本研究中的微生物群分析揭示了断奶腹泻改变了仔猪肠道微生物群的结构和组成。厚壁菌门与拟杆菌门的比例被广泛认为是维持肠道稳态的关键因素，通常用作炎症性肠病（IBD）的指标。在本研究中，腹泻仔猪表现出更高的厚壁菌门与拟杆菌门的比例，这表明这些仔猪的微生物群维持肠道稳态的能力下降。许多研究支持了微生物群失调与益生菌减少和肠道病原体增加有关的概念。例如，Li等人报告说，腹泻仔猪的肠道微生物群失调特征是缺乏乳酸菌，大肠杆菌丰富，以及脂多糖生物合成的增强。值得注意的是，我们发现腹泻仔猪中Lactobacillus amylovorus和Lactobacillus reuteri的丰度减少，而Bacteroides sp.HF-5287和Bacteroides thetaiotaomicron的丰度增加。乳酸菌被认为是改善肠道屏障功能的有益的益生菌。据报道，当饮食中的多糖稀缺时，Bacteroides thetaiotaomicron会将其代谢从饮食多糖转变为宿主衍生的粘液糖蛋白，最终导致粘液屏障的破坏。重要的是，这些微生物变化伴随着腹泻仔猪中LPS产量的增加，这可能对肠道上皮层产生不利影响。总体而言，这些发现表明，患有腹泻的仔猪表现出微生物组紊乱，其特征是微生物组成和功能的显著变化，这与不良健康结果有关。。
肠道微生物群产生的代谢产物被认为是宿主-微生物交流中的关键信号分子。在本研究中，微生物群的功能特征显示，在各种代谢途径中，色氨酸代谢在健康仔猪和患有腹泻的仔猪之间显示出最显著的差异。具体来说，与健康仔猪相比，腹泻仔猪的微生物群产生色氨酸代谢产物的潜力显著降低。在仔猪的肠道微生物群中，色氨酸酶在拟杆菌属、普雷沃菌属、甲烷杆菌属、乳酸菌属和梭菌属中广泛表达。其中一些，包括乳酸菌属、拟杆菌属和梭菌属，已被报道能够代谢色氨酸。值得注意的是，我们的数据表明拟杆菌属是产生色氨酸酶和色氨酸代谢产物的主要属。一些拟杆菌种已被报道能够产生吲哚、IAA、吲哚-3-乳酸（ILA）。我们进一步鉴定了参与色氨酸代谢的关键酶，包括KynB、tnaA和ALDH，在腹泻仔猪中显示出较低的丰度。tnaA酶在革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中都有表达，可以将色氨酸转化为吲哚。KynB酶负责犬尿氨酸（Kyn）的生物合成，而ALDH参与IAA和IAld的合成。这些鉴定的酶进一步支持了肠道微生物群可以产生色氨酸代谢产物的观点。基于上述研究，我们推测拟杆菌属和梭菌属等细菌可能共同导致腹泻仔猪中IAA或IAld的减少。
越来越多的研究表明，微生物色氨酸代谢产物在调节各种生理过程中的多效性作用。例如，据报道，微生物衍生的IAld通过促进白介素-22的产生，对念珠菌病和结肠炎有保护作用。在本研究中，腹泻仔猪体内几种色氨酸分解代谢物的含量较低，包括IAld、吲哚-2-羧酸（2-ICA）、3-吲哚丁酸（IBA）、吲哚-3-羧酸（I3CA）和吲哚-3-乙酸甲酯。对这六种色氨酸代谢产物与腹泻相关指标之间的相关性分析表明，包括IBA和IAld在内的色氨酸代谢产物水平与腹泻评分和血清LPS水平呈负相关。这些发现表明，色氨酸代谢产物的变化，尤其是IAld，与仔猪腹泻的发生有关。
吲哚-3-醛是肠道微生物群产生的一种众所周知的色氨酸代谢产物。为了研究色氨酸代谢产物在宿主生理过程中的作用，选择了IAld作为断奶仔猪日粮补充剂。肠道屏障功能依赖于肠道微生物群、粘液层、紧密连接蛋白和肠道上皮之间的复杂交流。我们假设微生物群衍生的IAld在肠道上皮的发展乃至肠道屏障功能中发挥着关键作用。正如研究所示，饮食中的IAld改善了断奶仔猪的绒毛形态，增加了MUC2+细胞的数量，并增强了Villin和紧密连接蛋白的表达。粘液MUC2是粘液层的主要蛋白质成分，对保护肠道上皮起着至关重要的作用。Villin是一种主要的微丝相关蛋白，位于刷状边微绒毛中，是肠道上皮发展的重要标志。因此，结果表明，饮食中的IAld促进了断奶仔猪小肠粘膜屏障功能的发挥。
断奶期间肠道上皮的发展深刻影响猪的长期表型和肠道屏障功能。肠道干细胞，特别是Lgr5+隐窝基柱细胞，推动肠道上皮的持续发展。我们发现日粮中的IAld显著促进了肠道上皮细胞的增殖。值得注意的是，IAld在体内外促进了Lgr5+ ISCs的增殖。规范的Wnt/β-catenin途径对于决定ISCs的命运至关重要。在本研究中，IAld激活了Wnt/β-catenin信号，调节了下游靶基因如c-Myc和Cyclin D1的表达，同时上调了LYZ mRNA的表达，LYZ是Paneth细胞的生物标志物。此外，AHR激活已被证明以配体特异性方式调节肠道上皮发展。 有趣的是，我们发现饮食中的IAld上调了AHR（IAld配体）和CYP1A1（AHR靶基因）的表达，表明IAld激活了AHR信号途径。同样，吲哚乙酸，另一种微生物色氨酸代谢产物，通过在小鼠中激活AHR表现出抗炎效应。此外，近期研究表明Wnt/β-catenin途径可以被AHR激活。IAld-AHR信号如何调节Wnt/β-catenin途径，从而影响ISCs扩张的分子机制需要进一步研究。总体而言，饮食中的IAld促进了断奶仔猪小肠中ISCs的扩张。
总之，我们证明了断奶后腹泻会导致肠道菌群失调，以及随之而来的色氨酸代谢紊乱，导致血清中LPS和D-LA水平增加。此外，我们揭示了饮食中的IAld，一种关键的微生物色氨酸代谢产物，通过促进断奶仔猪的ISC扩张，改善肠道发育和屏障功能（图8）。
图8. 断奶后腹泻导致肠道菌群失调，以及随之而来的色氨酸代谢紊乱，导致血清中LPS和D-LA水平增加。饮食中的IAld，一种微生物群衍生的色氨酸代谢产物，通过促进断奶仔猪的ISC扩张，改善肠道发育和屏障功能。IAld，吲哚-3-醛；2-ICA，吲哚-2-羧酸；IBA，3-吲哚丁酸；I3CA，吲哚-3-羧酸；LPS，脂多糖；D-LA，D-乳酸；ISC，肠道干细胞。
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