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结果：
开发跨实验室复制工作流程
作者首先通过复制 DNA 提取和测序工作，在两个独立实验室中验证 PMP 肿瘤是否具有可重复的细菌特征。作者假设强健的肿瘤相关微生物信号应能在实验室间重复出现（18）。此外，比较从独立提取的 PMP 肿瘤中分离出的细菌分类单元，将使作者更有信心地区分肿瘤相关细菌与实验室特异性背景污染，手术期间发生的污染事件除外。作者还纳入了若干在疝气修复或子宫切除手术期间采集的正常腹膜（NP）对照组织，这些组织来自未被诊断为癌症的患者，因为从 PMP 患者中获得正常腹膜组织较难。NP 对照样本被用作一组可能代表手术和环境污染的扩增子序列变异（ASVs），也可能是腹膜腔内常见但非肿瘤特异性的微生物。
首先，在实验室 1 中，作者从 PMP 肿瘤和 NP 组织中分离出总 DNA，并通过 16S rRNA 基因扩增子测序对肿瘤相关微生物进行了表征。随后从实验室 1 中选取一组看似测序稳健的 PMP 肿瘤和 NP 样本（即>1,000 测序读段和>100 mg 剩余组织）进行独立 DNA 提取和实验室 2 的测序复制（ 图 1A）。为跟踪和报告试剂和实验室污染情况，作者纳入了阴性提取对照（NECs;提取过程中未添加组织样本）和无模板对照（NTCs;即在 PCR 扩增步骤中未添加 DNA 模板）。此外，还将模拟微生物群落纳入正对照组，以评估 DNA 提取效率并进一步追踪背景污染（见方法）。
实验性工作流程和过滤流程。（A）在实验室 1（青绿色）提取并测序了 70 个 PMP 肿瘤和 6 个 NP 样本。每种组织类型的子集被送往 2 号实验室（橙色）进行复制。（B）. PMP 和 NP 提取经历了两组过滤步骤。去除了读取率为<2,000 的样本提取样本（滤镜#1）。根据源追踪估计污染率为 3E20%的提取样本被去除（滤波器#2）。高质量提取中去除了实验室特有性和全球污染物。维恩图显示，六个 PMP 肿瘤和一个 NP 样本有两个高质量复制。（C）箱形图，显示 DADA2 过滤和去除非微生物序列后每次提取序列读取次数。去除了无测序读数和异常值的样本。（D）显示每个样品中污染量的箱形图。SourceTracker2 估算了每个样本中阴性对照的贡献百分比。所有样本均经过稀度处理至 800 次读段，以尽可能保留源追踪的负对照。过滤常见污染物后，取出读数为<800 的样品。虚线红线代表滤波器阈值。白色圆圈代表平均值。
利用实验室 1 和 2 的数据集，作者通过开发分级过滤方法，专注于高质量的肿瘤和对照组织样本，旨在从下游分析中识别并去除质量差且被认为严重细菌污染的样本（见图 1B）。首先，取出测序次数少于 2000 次的样本。作者推断，具有强健微生物特征的样本读数会多于阴性对照读数的中位数（实验室 1=586;实验室 2=1,404）。大多偏离该阈值的样本很可能含有极低甚至无法检测到的肿瘤相关细菌，这些细菌与背景污染无异。
接着，通过利用 NECs 和 NTC 作为潜在微生物“源”的源追踪贝叶斯方法，估算了实验室污染物对肿瘤微生物群落的贡献（23）。移除估计含有超过 20%负面对照组贡献的样本。选择这一保守的界限是为了排除可能被误解为真实生物信号的严重污染样本，同时保留环境污染水平较低的样本，这也是该样本类型所预期的。通过两个过滤器的样本提取被认为质量高，用于研究 PMP 肿瘤微生物组。未通过任一滤网的萃取品被认为质量较低。最后，为减少实验室特异性污染，从高质量样本中剔除了在各实验室阴性对照中发现超过 50%的常见分类单元（如 Turicella 和 Geobacillus）（图 1B）。
共在实验室 1 提取并测序了 70 个 PMP 肿瘤、8 个 NECs、2 个 NTCs、6 个模拟社区稀释（BEI 资源）和 6 个 NP 组织。在这 92 个样本中，17 个 PMP 肿瘤、1 个 NEC 和 1 个模拟社区在 DADA2 质量过滤和非细菌读段去除后均无测序读段，随后被移除。剩余 53 个 PMP 肿瘤平均保留 5,129 个序列读段（范围：46–94,766）（图 1C）。7 个 NEC 和 2 个 NTC 平均保留了 2,681 次读取（范围：55–11,771）。值得注意的是，两个 NEC 和一个 NTC 的读数超过 3000 次，暗示可能是随机斑点污染。剩余的五个模拟群落稀释平均序列读数为 41,521 个（范围：1–160,717）。六个 NP 对照组织样本平均每个样本保留 1,964 个读数，范围在 413 至 7,460 个之间。
为评估污染情况，同时保留足够的负提取对照，样本稀度降至 800 个。对 53 个 PMP 肿瘤中的 35 个进行了源追踪，读数为 3E800%。平均而言，12.5%的 PMP 读段可归因于 NEC 和 NTC 样本（范围：0%–60.05%）（见图 1D）。SourceTracker2 识别出 64 种潜在的细菌 ASVs。Turicella 和一种未确认的 Prevotellaceae 科 ASV 是实验室 1 PMP 样本中最丰富的推定污染贡献者，分别在 18 个和 6 个 PMP 样本中被发现。虽然松羽荽科和前翅科（Prevotellaceae）通常不常被报告为污染物（22），但通过源头追踪识别出的其他几个分类单元，如科林杆菌和肠球菌， 此前也曾被报道为常见的实验室或试剂盒污染物。
作者还调查了 NP 样本是否主要受实验室污染影响，或是否存在可能代表其他来源（如手术环境或内源性腹膜微生物）的独特微生物群落。作者发现六个 NP 样本中有两个含有足够的读段进行源追踪。平均 6.69%的阅读归因于负面对照来源。
接着，作者通过足够读段分析模拟群落稀释，以确定在具有明确界定群落的样本中是否能识别背景污染。BEI 微生物模拟群落由 22 种细菌以等比例混合组成（见图 S1A）。作者回收了 22 种已知物种中的 20 种，但未能检测到痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌。还识别出 19 种细菌污染物，平均占读数的 1.8%。这 19 种污染物中只有 6 种在实验室 1 的负面对照组中也被发现，这表明可能存在其他污染源（例如制造商工厂）。作者还发现实验室 1 的阴性对照中存在五个模拟群落成员 ——大肠杆菌 、 金黄色葡萄球菌 、 粪肠球菌、齿溶线菌和幽门螺旋杆菌。这些 ASV 是否代表真实的实验室相关背景污染，还是阳性对阴对照交叉污染尚不明确。虽然低级别交叉污染的可能性存在，但这些 ASV 是常见的宿主相关分类单元，可能代表真正的背景污染。
为了区分低质量和高质量样本提取，作者使用了两种高质量滤镜。作者发现 32%的 PMP 肿瘤（17/53）和 33%的 NP 样本（2/6）具有超过 2,000 次测序读段（见图 1C），并通过了第一阶段过滤。为了考虑污染情况，采用了>20%估计污染作为界限;14 个 PMP 肿瘤及两种 NP 样本均通过并保留在数据集中（图 1B 和 D）。
在最初的 70 个 PMP 肿瘤中，选取 21 个肿瘤和 6 个 NP 样本中的 4 个在实验室 2 进行复制（图 1A）。在实验室 2 中，作为 DNA 优化实验的一部分，生成了另外两个 PMP 肿瘤样本 PMP-423、PMP-433 和 PMP-485 的复制品（见方法）。这六个复制体被纳入作者的分析，以探讨实验室内的可重复性。除了 PMP 和 NP 样本外，还提取并测序了 8 个 NECs、4 个 NTCs 和 4 个模拟社区对照（Zymo）。实验室 2 的样本经过 DADA2 级过滤，并以与实验室 1 相同的方式去除非细菌读段。
经过高质量过滤后，21 个 PMP 肿瘤平均每个样本保留了 5,670 个序列（范围：749–33,825）（图 1C）。平均而言，优化样本每个样本剩余的读段为 8,073 次。八个 NEC 和四个 NTC 平均保留了 1,592 个序列读段，范围在 364 到 3,716 个之间;其中一个 NEC 包含超过 3000 次读取。四个模拟社区样本平均每个样本保留 23,169 个序列读段（范围：18,033–29,209），四个正常对照组织样本平均每个样本保留 5,578 个读段（范围：1,364–17,089）。作者观察到，PMP 肿瘤测序读段在两个实验室中差异很大，可能受多种因素影响，包括人类基因组 DNA 干扰和细菌负荷的变化。然而，作者注意到扩增子测序研究通常表现为测序深度不等（24）。
再次使用实验室特异性 NEC 和 NTCs 的源追踪，估算稀释后足够读数（>800）对 20 例 PMP 肿瘤的实验室污染贡献。作者发现，平均 11.75%的测序读段可归因于实验室 2 的阴性对照来源（范围：0.23%–43.38%）。SourceTracker2 识别的两个污染最严重的分类单元—— 地蓝杆菌和不动杆菌，此前曾与阴性提取对照相关（22）。值得注意的是，SourceTracker2 的污染特征具有实验室特异性。在实验室 1 和 2 的 PMP 样本中仅发现三种 SourceTracker2 污染物，其中只有一种（ 肠球菌 ）贡献了超过 500 次读数。
正常腹膜样本的负对照贡献为7.38%，与实验室1的结果相似。
实验室 2 的模拟群落由八种不同细菌种类混合，比例不均。作者发现 31 种平均占 2.4%读数的细菌 ASV 被鉴定为实验室 2 的阳性对照污染物，其中 15 种也出现在实验室 2 的 NECs 和 NTCs 中（图 S1C）。作者再次发现多个模拟社区成员污染了实验室 2 组阴性对照组（大肠杆菌 、 金黄色葡萄球菌和粪便酵母菌）。这些发现结合实验室 1 的阳性对照数据，展示了仅凭在负面对照样本中存在 ASV 就有可能从生物样本中去除 ASV 的风险，并凸显了交叉污染的频率。
对实验室中 2 个 PMP 和 NP 样本进行了两个过滤步骤，结果显示 21 个 PMP 肿瘤中有 9 个，4 个 NP 样本中有 2 个含有>2,000 序列读段，并通过了第一个过滤步骤。经过第二次污染过滤后，这九个 PMP 肿瘤中有七个排出，两个 NP 对照组织样本也排出（见图 1B）。
作者共识别出 14 例高质量的 PMP 切除肿瘤，均在实验室 1 处理，7 例在实验室 2 处理。这 21 例摘除代表了 15 名不同患者的 PMP 肿瘤，可能携带强健的肿瘤相关微生物特征。此外，实验室 1 处理的两例正常腹膜采集和实验室 2 的两例，代表三种不同的对照组织，可能含有手术污染特征或腹膜腔内的微生物群落（见图 1B）。随后利用这 25 条高质量提取物的微生物群落，用于区分肿瘤相关微生物与潜在污染，并对 PMP 肿瘤微生物组进行表征。
为评估过滤标准是否识别出具有严重背景污染的低质量样本，作者使用 Bray-Curtis 主坐标分析（PCoA）（图 2A 和 B）对 PMP 和 NP 组织样本及其阴性对照组进行了可视化。作者预期低质量样本主要由背景污染组成，因此在阴性提取和阴性模板对照组附近聚集。总体而言，作者发现随着污染百分比的增加，组织样本与阴性对照组之间的距离趋于缩短（见图 S1F）。实验室 1 的低质量 PMP 和 NP 样本与阴性对照组在统计学上无显著差异（置换多变量方差分析[PERMANOVA] q 值 =0.293），表明两组相似。然而，部分低质量的实验室 2 样本在 PC1 上聚集，表明它们的微生物群落存在差异，尽管估计含有严重污染（PERMANOVA q 值 = 0.0015）。作者怀疑这很可能是由样本到阴性对照的交叉污染引起的。这些低质量 PMP 样本中不动杆菌的相对丰度与两个负方对照组的相对丰度高度吻合（见图 S1D），导致 SourceTracker2 高估污染水平。无论如何，作者的目标是识别并研究明确高质量的样本提取。因此，这些样本被排除在进一步分析之外。这些发现进一步表明复杂背景污染的评估和减缓具有多么困难。
低质量样本与阴性对照相似。Bray-Curtis PCoA 图，显示 PMP 肿瘤、正常腹膜对照组织及阴性对照组，均在（A）实验室 1 和（B）实验室 2 提取。所有样本均经过稀度处理，每个样本需 800 个读段。去除了具有<800 读段的读段。样本的颜色根据 SourceTracker2 估算的污染百分比进行着色。最大颜色设置为 20%，代表污染阈值。阴性对照样本以黑色涂色。形状表示样品是否通过了或未通过两个质量滤波器。
尽管背景污染主要依赖实验室（见图 S1B 和 D;表 S5），作者假设某些污染物可能在实验室间可重复出现，且它们在肿瘤复制品中的存在可能被错误地解读为真实的生物学信号。两个实验室的阴性对照组共发现了九种全球污染物。作者搜索并发现这九种 ASV 中有三种在肿瘤复制间也具有可重复性。已知的阳性对照组（Zymo 和 BEI）中已知成员的 Escherichia-Shigella 和 Staphylococcus ASVs 在一个组织（PMP-187）和四个组织（PMP-150、PMP-211、PMP-254、NP-24）中均被发现。不动杆菌在两种肿瘤中被发现（PMP-187，PMP-211）。
为了更好地理解这三种 ASV 是否由污染引起，还是确实与肿瘤相关但也存在于阴性对照组中，作者采用了微生物群落污染去除源追踪（SCRuB）（25），该方法能够考虑并净化从高到井的污染。作者还将其他六种全球污染物纳入分析。SCRuB 几乎完全将 Escherichia-Shigella 读段识别为污染。去污后， 不动杆菌和金黄色葡萄球菌分别保留了 100%和 85%的总读数（见图 3A），表明这两个分类群可能确实与样本相关。在去除质量差的样本和实验室特异性污染后，作者从数据集中去除了 SCRuB 识别的 Escherichia-Shigella 及另外两种全球污染物（ 肠球菌和短杆菌 ）（图 1B 和 3A;图 S2A）。
细菌信号可通过高质量 DNA 提取复制。（A）条形图，显示 SCRuB 流水线运行前（红色）和蓝色后，每种全球污染物 ASV 的总读数。对所有 PMP 和 NP 样本进行了读段相加。仅展示了在“高/高”质量组中可重复的 ASV。（B）箱形图显示按质量类别分组的重复 PMP 和 NP 样本中发现的 ASV 数量。“High/High”表示两个复制都符合质量过滤标准;“高/低”表示一次通过和一次失败;“低/低”表示两次复制均未达到质量标准。带有 Bonferroni 校正的 Kruskal-Wallis 检验。（C）散点图显示实验室 1 和 2 高质量重复样本中 ASVs 的相对丰度（RA）。每个点代表一个 ASV。在阴性（橙色）、阳性对照（蓝色）或两者（黄色）中也发现的 ASV 会被高亮显示。Pearson 相关系数（r）用于评估微生物群落的可重复性。
在质量评估和 ASV 去污后，作者进一步研究肿瘤相关的微生物信号在不同实验室提取的样本复制间是否可重复出现。作者假设高质量样本提取可能包含可重复的肿瘤相关微生物特征，而低读数和/或严重污染的低质量样本复制则几乎没有共同特征。尽管细菌细胞分布在部分肿瘤内可能异质性，但作者期望 ASV 在高质量样本复制间的重复性应更高。在两个实验室提取的 21 个 PMP 和 4 个 NP 样本根据质量被分为三组。“高/高”组包含六个肿瘤和一个 NP 样本，且两次复制均为高质量。“高/低”组包括四个肿瘤和两个 NP 样本，其中一个复制体符合高质量标准。最后一组“低/低”由 12 个肿瘤和 1 个 NP 样本组成，均未通过质量标准重复。随后，作者考虑了每个质量组样本复制间的 ASV 复制数量，并比较它们的相对丰度。
“高/高质量”组的六个 PMP 肿瘤样本在可重复性方面存在差异。PMP-254 拥有最多的可重复 ASV 数量（n=24），PMP-187 次之多（n=8）。PMP-150 和 PMP-127 在复制体之间仅有两个 ASV 相同，这可能表明某些微生物在某些肿瘤的组织中分布异质。NP-24 是“高/高”质量组中唯一的对照组织样本，且含有许多可重复的 ASVs（n=20）。平均而言，在高质量样本复制中共复制了 8.71 个 ASV（见图 3B）。
作者在“高/低”质量组和“低/低”质量组的复制之间发现几乎没有或没有可重复性（见图 3B;图 S2B 和 C）。平均而言，“高/低”组共享 ASV 少于“高/高”组的样本对（平均=2.33），但这一差异在统计学上并不显著（q 值=0.3815）。正如预期，作者发现“低/低”质量组的可重复性最低。12 个重复样本中有 5 个 ASVs 没有共同，平均可重复 ASV 数量为 1.17，显著少于“高/高”组（图 3B;q-value = 0.01568）。
为进一步评估肿瘤微生物组的可重复性，作者考察了每次复制中 ASVs 是否以相似的相对丰度回收。相对丰度之间的正皮尔逊相关表明微生物群落组成是可重复的，并进一步表明至少部分细菌分类单元均匀分布于肿瘤组织中。作者发现，在“高/高”质量组中，从肿瘤复制体 PMP-254、PMP-433、PMP-187、PMP-211 和 NP-24 分离出 ASVs 的相对丰度与显著正相关（见图 3C）。相反，PMP 肿瘤 127 和 150 之间的复制性较低。这两种肿瘤在复制株之间仅共享两个极低丰度的 ASV，且复制性不可重复（ 分别为 r = −0.095 和−0.27）。高质量样本的低重复性可能是由于 DNA 提取和 PCR 等过程中引入的技术变异所致，也可能是微生物群落分布异质的结果，如先前观察到的（6， 8， 12， 26）。
当作者比较“高/低”和“低/低”质量组的样本对时，仅发现一颗肿瘤 ASV 相对丰度呈显著正相关（见图 S2B）。从剩余肿瘤中恢复的 ASVs 和这些质量组对照组织中，复制间要么无显著相关，要么呈负相关。这一结果，加上低质量样本与可重复 ASV 数量较少的观察，表明这些低质量样本几乎不含肿瘤相关的微生物信号。或者，这些发现可能是由于对含有异质分布细菌群的 PMP 肿瘤组织进行低采样所致，如 PMP-127 和 PMP-150 所见。
为确定“低质量”肿瘤是否源于异质分布细菌对组织的低采样，作者检查了部分 PMP 肿瘤（423、433 和 485），这些肿瘤在实验室 2 优化实验中产生了额外的生物复制（每个生物复制品需进行两次技术复制;详见方法）。作者假设，如果微生物细胞存在于肿瘤中异质分布的生态位中，随着采样的增加，作者预计会产生一些高质量的提取。根据实验室 2 的质量结果，额外的 PMP-423 和 PMP-485 重复序列因测序读数不足（<2,000）被认为质量较低，而额外的 PMP-433 重复序列则被认为质量较高（3E2,000 次读段和 3C20%污染率）。这些发现表明，被归入“低/低”质量组的 PMP 肿瘤样本（例如两次未完成的提取）并非采样不足，而是可能未被微生物群落定殖，至少未达到可检测水平。然而，对于被评为“高/高”（例如两次高质量萃取）的 PMP-433，作者能够在所有额外复制中检测出最丰富的分类单元，表明至少在本例中，肿瘤小样本（~200 mg）内的微生物群落似乎是均匀的（见图 S4）。作者怀疑被归类为“高/低”的样本可能代表细菌负荷中等且可边缘检测的肿瘤，但仍需更多研究。
接着，作者评估了高质量的 NP 对照提取物是否存在手术污染。本研究纳入的六个对照组织中，只有 NP-24 有两个具有可重复分类单元的高质量复制（n=20）。该样本采集自一名接受局部纤维粘连腹腔镜切除及卵巢切除术的患者。NP-24 由皮氏菌科的 ASVs 占主导（见表 1），其中许多曾从临床标本中分离出，已知存在于皮肤（如 Corynebacterium）（27）、胃肠道（如 Prevotella）（28）或阴道（如 Peptoniphilus、Fenollaria 和 Ezakiella）（29， 30）。
作者评估了另外两个对照组织 NP-18 和 NP-29 的高质量提取物，以确定它们是否与 NP-24 共享可能代表普遍手术污染的微生物特征。这些对照组在两个实验室均提取，但各仅有一次高质量提取（即“高/低”质量组）。NP-18 由Clostridia-UCG-014和诺卡迪亚德斯主导（ 图 4A），这两种基因在复制间均不可重复。NP-29 由不动杆菌、葡萄球菌和乳酸杆菌主导，但同样无一可重复性。作者发现，许多可重复的肉桂科属是 NP-24 独有的，这表明它们可能代表孤立的外科污染事件或潜在感染。此外，实验室 1 阴性对照中常见的试剂盒污染物缓根瘤菌是三个对照组织中唯一发现的分类单元，表明手术可能不构成广泛且可重复的污染源。
PMP 核心肿瘤微生物组。（A）分类单元条形图，显示每个高质量正常腹膜和肿瘤摘出在属级层面的相对丰度百分比。显示前 19 名属。（B）属级核心微生物组。分析中包含所有高质量的 PMP 提取样本。（C）热力图显示了高质量 PMP 肿瘤摘除中 75 个最丰富的属的日志 10 次读段。具有复制的肿瘤被分组，ASVs 被合并后在属级层面坍缩。
正常腹膜样本和 PMP 肿瘤共享多个分类单元。在众多肿瘤及 NP-24 和 NP-29 摘除中均存在红杆菌 、 金黄色葡萄球菌、铜珠菌和不动杆菌（图 4A）。值得注意的是，Corynebacterium、Staphylococcus 和 Pseudomonas 仅能在 NP-24 复制中重复出现，且读段数量较少（范围：12–302 次/重复）。尽管 NP 和 PMP 样本共享部分细菌，PERMANOVA 显示这些样本类型彼此显著不同（见图 S5A 和 B）（Jaccard P = 0.031，Bray-Curtis P = 0.043）。作者注意到 NP 样本量较 PMP 肿瘤小，这可能影响研究结果。总体而言，作者在高质量 NP 对照组中未发现明显的手术污染特征。然而，在 NP 和 PMP 样本中发现的一些可重复且低丰度的类群（如 Corynebacterium、Staphylococcus 和 Pseudomonas）很可能是污染物，但由于这些组织是从接受与 PMP 队列无关的无癌患者中分离出来的，这一发现难以解释。
Gilbreath 等（20）报告称，PMP 肿瘤和黏液被包含蛋白质门（Proteobacteria）、放射菌门（Actinobacteria）、坚硬螺（firmicutes）和拟杆菌门内细菌的核心微生物群定殖。为了确认 PMP 肿瘤是否拥有一组核心微生物类群，作者首先考虑了具有两个高质量复制体的 PMP 肿瘤，这两组复制在作者的数据集中是最稳健且可重复的。ASVs 首先在门级坍缩，然后对各个门类进行了样本总和。在门层面，作者发现蛋白菌、坚墙菌、放线菌和拟杆菌在 80%或以上的 PMP 肿瘤摘除中存在，这一发现与 Gilbreth 等人（20）相似。在属层面，Gilbreth 识别出 34 种核心微生物，其中作者仅确认为核心样不动杆菌 、 葡萄球菌、铜绿单胞菌 （占作者高质量 PMP 提取的 50%）、链球菌 （50%）、杆菌（40%）和柯林杆菌 （40%）（见图 S5C）。
作者的分析范围超出了仅在实验室间复制的肿瘤，纳入了所有高质量肿瘤提取中发现的 ASV（n=21 个样本）。变形菌、坚墙螺、放线菌和拟杆菌的患病率降至 70%。假单胞菌和金黄色葡萄球菌在 70%的肿瘤 DNA 中被发现（见图 4B），而不动杆菌和红粉球菌则存在于 50%。作者还在 40%的 PMP 提取中发现了链球菌和菊花科的一个未识别属。尽管 Gilbreath 等人（20）对比的核心属较小，但两项 PMP 研究中均一致鉴定出铜绿假单胞菌、不动杆菌和链球菌 （见表 2）。然而，考虑到这些核心类群的发现，尚不清楚这些核心类群是否真的与肿瘤相关，还是仅代表手术污染。
总体而言，作者发现了 60 个属于 14 个不同属的 ASVs，这些 ASVs 此前通过 Glibreath 等人（20）研究从 PMP 肿瘤和黏液质中分离出来。这些属在流行率和相对丰度上各不相同（见表 2），包括本书中被确定为核心 PMP 成员的属（ 如铜绿单胞菌属、 葡萄球菌属、 不动杆菌属和科林杆菌属）。为了确定这些分类单元是否可能因污染，作者在两个实验室的负对照组中搜索了它们的存在。作者发现，在阴性对照组中，几个最常见的属的相对丰度接近或超过 1%，这可能表明存在污染。然而，鞘单胞菌 、 玫瑰单胞菌和德尔菲塔菌在多名患者中存在，平均相对丰度范围为 0.1%至 5%。与此处报道的其他分类单元一样，Sphingomonas 和 Delfita 此前已从胃肠道肿瘤组织中分离出来（31， 32）。与 Gilbreath 等人（20）中甲基杆菌是最丰富的属不同，甲基杆菌仅在一个肿瘤样本中发现，且丰度较低（0.3%）。
此前由 Glibreath 等人（20）分离并培养的若干细菌也在此被鉴定。其中包括 3 个属 1 科（ 甲壳食科 ）中的 17 种 ASVs。值得注意的是，Gilbreath 等（20）发现了甲壳吞肉科中一种未分类分离株，在体内与分泌 MUC2 细胞相互作用 ，表明 PMP 相关细菌可能将粘液作为碳水化合物来源。虽然未在作者的数据中检测到这种未分类的甲壳食科分离株，但作者从该科中识别出两种不同的 ASV（见表 2）。 甲壳食科通常与土壤相关，但在与实验室相关的对照组中未发现，表明它们可能与肿瘤相关。综合这些发现表明，之前识别的一些属可能与肿瘤相关，而另一些则可能是污染的结果。
接着作者关注了那些不被视为“核心”分类单元但通过高质量肿瘤复制的最强细菌信号，这强烈表明它们代表了真实的生物学信号（见表 1）。由于阑尾癌相对罕见且肿瘤相关细菌的研究有限，作者试图比较可重复的 PMP 相关细菌与结直肠癌（CRC）相关的细菌。CRC 和 PMP 肿瘤具有不同的突变特征。高比例的 CRC 肿瘤含有 APC 和 TP53 基因突变，而 KRAS 和 GNAS 突变在 PMP 肿瘤中更为常见（33）。尽管存在这些差异，两种肿瘤类型暴露于类似的肠道微生物，这些微生物在癌症进展和生存结果中可能扮演类似角色。
作者发现了若干具有可重复性、与 PMP 相关的属（见表 1），这些分类群已被归入 CRC。脆弱杆菌 、 核杆菌和幽门螺旋杆菌最常与 CRC 的发生相关（1,34–36）。 虽然作者的测序策略未能实现物种级分辨率，但作者识别出 4 个与 PMP-254 相关的可重复拟拟杆菌 ASV，共 367 个读段。在高质量的另外三个肿瘤（PMP-127、PMP-152 和 PMP-345）提取中发现了其他拟杆菌序列，合计超过 3000 次读段。在实验室 1 提取的三个不同肿瘤（PMP-185、PMP-252 和 PMP-433）中发现了褐色杆菌的低丰度，但在肿瘤复制间不可复现。在一次从 PMP-420 提取中发现了螺旋杆菌 （n=236 次 read）。
Alistipes 和链球菌最近被发现为 CRC 的潜在贡献者，并在多个肿瘤中被发现（37， 38）。PMP-254 包含三支可重复的 Alistipes ASVs，共计 450 次读数。该属也在低丰度的单个 PMP-127 和 PMP-187 提取中被发现（n=87 次总读段）（图 4C）。PMP-433 复制中仅重复出现一条链球菌序列（n=196 次读段）。然而，作者在另外 7 个患者中发现了链球菌 ASV，共计 476 次阅读。多个与 CRC 相关的属分布于多个 PMP 肿瘤，表明这些癌症可能共享相似的肿瘤微生物组。
虽然通常与食管及其他癌症相关（39），但作者发现一个 PMP 肿瘤存在强烈的支原体信号。 支原体占优（n=2,911 次读数），且在实验室内外均可重复出现（图 4A;图 S4）。值得注意的是，两家实验室的阴性对照组均未检测到支原体 ，且未被认定为常见的实验室污染物。
虽然许多细菌与整体生存率较低有关，但作者在 PMP 肿瘤中发现了若干类群与 CRC 结局的改善相关（36， 40）。在 PMP-254 中发现了两条可重复的 Odoribacter 属序列，共 240 条 read。作者还发现了可重复的 Blautia（n=23 次 reads）和 Ruminococcus（n=72 次 reads）ASVs，这些 ASVs 也与 PMP-254 相关，同时还发现了另外三个属于 Lachnospiraceae 科的序列。该患者的现状未知;然而，在最后一次就诊时，他们的无病生存期为 60.8 个月（中位数弥散性腹膜腺素病无病生存期=41.9 个月）（41）。Blautia 和 ruminococcus 均从其他肿瘤中分离出来（分别为 n=48 和 n=48 次总读数）（见图 4C）。这些结果凸显了不同细菌种类、宿主与疾病之间的复杂关系，并进一步说明由于作者对这些微生物在肿瘤微环境中的功能了解有限，解读结果的挑战。
除了标准的细胞缩减手术（CRS）和高温腹腔内化疗（HIPEC）外，转移性阑尾癌通常采用结直肠型全身化疗方案治疗（33， 42）。患者可在手术前接受系统性 FOLFOX（叶酸、氟尿嘧啶和奥沙利铂）或 FOLFIRI（叶酸、氟尿嘧和 irinotecan）化疗以缩小肿瘤，术后再进行一次以治疗残留肿瘤并延缓高危患者的复发（43， 44）。本研究中的若干患者在细胞减排手术前接受了系统性 FOLFOX、FOLFIRI 或顺铂治疗，手术中肿瘤样本已采集或曾接受 CRS 和 HIPEC 治疗，并正在接受后续 PMP 复发手术。
由于化疗药物具有细胞毒性，具有抗菌特性（45， 46），且已知会影响肠道微生物组组成（47， 48），作者希望更好地了解以往治疗对 PMP 肿瘤微生物组可能产生的影响。高质量肿瘤摘除的无加权 Unifrac PCoA 分析显示，曾接受化疗的患者肿瘤微生物组与从未接受治疗的患者有明显差异（图 5A）（PERMANOVA P = 0.007），且α多样性较低相关。作者发现，在接受化疗手术的患者中，独特的细菌 ASVs 数量和 Faith 的系统发育多样性较低（图 5B 和 C）。分析了带偏倚修正的微生物组组成（ANCOM-BC），以确定某些分类单元在各组间是否存在差异性丰度，但未发现显著差异。作者还假设先前的化疗可能降低样本质量，但未发现相关性（卡方 P = 0.2）。这里呈现的结果表明，至少某些类型的化疗可能会减少细菌多样性，并可能掩盖重要的生物信号。
既往化疗与 PMP 肿瘤微生物组多样性降低相关。（A）未加权单片状 PCoA 图，显示所有高质量肿瘤样本，按独特 ASV 数量着色。菱形代表曾接受过化疗的个体。高质量肿瘤提取样本被稀度化至每个样本 2000 个读段，然后将具有复制的肿瘤分组。Permanova P = 0.007。（b）显示独特 ASV 数量的箱状图，以及（C）Faith 系统发育多样性指标，按从未接受过化疗的患者（否）和在细胞减小手术前接受过全身性或 HIPEC（HIPEC）化疗方案的患者分组，采样时采样。具有高质量复制的肿瘤被分组。
总结
作者发现了本研究中的若干局限性，这将有助于指导后续研究。最重要的是，作者缺乏一个稳健、与患者匹配的外科抽样对照。作者打算用非 PMP 患者的腹膜样本作为对照，但作者假设腹膜腔，尤其是在急性创伤（即手术）期间是无菌的，可能并不正确。因此，未来研究中可能需要收集多种类型的对照，以综合评估手术污染情况。其次，作者的测序方法未能提供物种层面的分辨率，因此作者发现的若干可能与 CRC 相关的分类群（如胡松杆菌 、 拟杆菌等）的具体分类是不可知的。需要更多全面描述 PMP 肿瘤微生物组并测试其对致癌、进展及治疗结果影响的研究，以超越相关性并确立因果关系 。对这篇文章的思路感兴趣的老师，
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