作者：陶芷欣，南京农业大学硕士在读，主要研究土壤生物复合污染。
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导读
细菌性肠道感染导致全球5岁以下儿童死亡率的9.2%，在基础设施薄弱的城市非正规住区尤为严重。过去的研究多聚焦于人畜共患的直接接触传播路径，证实家禽等动物与人类的密切接触可促进菌株交换，但对饮用水、土壤等环境介质在传播网络中的桥梁作用认知有限。传统的单菌落测序因通量限制难以捕捉菌株多样性，而宏基因组方法因灵敏度不足常遗漏低丰度菌株共享事件。更为复杂的是，抗生素耐药基因（ARGs）的扩散机制仍不明晰——克隆传播与水平基因转移的相对贡献仍存争议。这些知识空白严重制约了干预策略的制定。
为填补这一研究空缺，加州大学伯克利分校等机构的研究团队在2025年5月发表于《Nature Microbiology》的最新研究中，采用分离菌落混合测序技术（Pooling Isolated Colonies-seq，简称PIC-seq），系统分析了家庭尺度上不同宿主和环境介质之间的大肠杆菌传播网络。研究对象涵盖人类（132份粪便）、家禽（111份泄殖腔拭子）、犬类（17份粪便）、土壤（39份）和储存饮用水（22份）。通过PIC-seq技术对每份样本中最多5株大肠杆菌进行混合测序（总计1,516菌落），研究克服了传统测序的覆盖局限与分辨率不足的问题，从分子层面提供了“水–人–人”这一关键传播路径的直接证据。
一、研究对象与样本特征
研究团队共采集321份样本（人类粪便132份、家禽泄殖腔拭子111份、犬类粪便17份、储存饮用水22份及土壤39份）。使用PIC-seq对每份样本中最多5个菌落进行混合测序，共获得1,516个菌落，最终鉴定出800个菌株，聚类为299个独特的代表性参考菌株（279株大肠杆菌、1株Escherichia albertii、6株E. fergusonii及13株志贺氏菌（11株福氏志贺菌、1株痢疾志贺菌、1株未分类）。
分析显示，每份储存饮用水的菌株数量显著低于其他样本，而土壤样本则表现出最高的菌株多样性。家禽与犬类样本的菌株多样性介于土壤与人类粪便之间。系统发育群分析显示：A群在所有样本中占主导地位（31.4%–46.4%），而与致病性相关的B2群与D群在人类粪便样本中特异性富集（分别占12.3%和11.7%），在饮用水样本中也保持较高比例（B2群8.6%、D群11.4%）。此外，MLST聚类表明ST10为最常见型别。人类与饮用水样本的菌株系统发育群高度重合，为“水–人”传播提供了关键线索。
图1 研究设计和 StrainGE 检测到的跨样本类型的大肠杆菌菌株概述
通过对已组装的序列中毒力基因的系统分析，研究团队评估了不同样本类型中致病性大肠杆菌和志贺氏菌的流行特征。人类粪便中致病型最为多样，其中肠聚集性大肠杆菌（EAEC）和肠致病性大肠杆菌（EPEC）分别出现在13.6%与7.6%的人类样本中。犬类样本中EAEC与EPEC的检出率均为5.9%（1/17）。在家禽样本中，EAEC（1.8%）、EPEC（0.9%）与ETEC（0.9%）均有检出。
储存饮用水样本中仅检测到EAEC（4.1%），而土壤样本中EAEC、EPEC和ETEC检出率分别为7.7%、2.6%、7.7%。弥散粘附性与肠侵袭性大肠杆菌在所有样本中均未检测到。在志贺氏菌方面，家禽泄殖腔拭子检出率最高（19.0%），其次为犬类（11.8%）、土壤（10.3%）和人类（6.1%），而饮用水中未检出任何志贺氏菌。这些结果表明，家禽和犬类的志贺氏菌高检出率提示其可能是潜在传播源，对环境及人类健康构成潜在威胁。
图3 家庭内部和家庭之间的菌株共享模式
图4 根据储存饮用水中存在大肠杆菌污染对家庭内部的菌株共享进行分层
为比较菌株追踪方法的灵敏度，研究团队选取相同的110份人类粪便样本，同时采用PIC-seq与传统宏基因组测序技术进行分析。结果显示，在相同的110份人类粪便样本子集中，PIC-seq检测出248个菌株，略高于宏基因组所检出的230个菌株。在菌株共享分析中，PIC-seq成功识别出50对样本共享事件，而宏基因组方法仅识别出7对（其中5对与PIC-seq结果重叠）。差异主要源于宏基因组在E. coli低丰度样本中的测序深度不足，难以准确捕捉微小基因组差异。研究指出，PIC-seq以其高灵敏度、较低成本及对目标菌种的聚焦优势，尤其适用于资源受限地区的细菌传播监测。
研究基于Illumina短读长数据，并结合参考基因组分箱与de novo组装策略，重建了不同样本类型的耐药组。相比单纯de novo组装（15.1–27.8%），结合分箱的策略将耐药基因重构率提升至81.6%–89.2%，远超传统方法（15.1%–27.8%）。结果显示，家庭周边土壤样本中的ARG簇数量最多（中位数266个），而饮用水样本最少（152个）；人类与动物样本之间无显著差异。
对于Rank I类高危耐药基因（与ESKAPE病原体相关、具迁移潜力的ARGs），人类样本显著富集β-内酰胺类与大环内酯类耐药基因，家禽样本中则富集了更多编码对甲氧苄啶与喹诺酮类耐药的高危ARG簇。值得关注的是，64.2%的Rank I ARGs位于可移动遗传元件（MGEs）附近，提示其具有较高的水平转移风险。blaCTX-M-15作为临床重点关注的ESBL基因，在人类（20.5%）、犬类（23.5%）、土壤（15.8%）等样本中广泛检出，说明其已在人类–动物–环境系统中建立稳定传播网络。
图6 非移动和移动电阻组相似性模式与应变共享模式的 Spearman 相关性分析
结论
本研究系统揭示了饮用水污染对家庭内部大肠杆菌传播的关键作用。人类与饮用水之间的菌株共享率在家庭内部显著高于家庭间（0.065 vs 0.0003），且污染饮用水的家庭中人–人共享率显著升高（0.32 vs 0.090）。在两个家庭中，人类成员与饮用水样本中检出相同菌株，为“污染水源–人–人传播链”提供了直接证据。
系统发育分析显示，人类与饮用水样本间共享的菌株在B2和D群占比接近，支持了“摄入饮用水后菌株可在肠道定植”的假设。本研究中Kibera储水污染率为37.5%，显著低于前期研究报道的Dagoretti South社区68.2%，佐证饮用水处理可有效打断传播链。值得警惕的是，即使在使用氯化水的社区中，储水容器在使用过程中的二次污染仍是细菌传播的关键风险点。
研究进一步发现，家庭内部菌株克隆传播是ARGs传播的主要驱动机制，家庭内人–水样本对的耐药组相似性甚至高于人–动物样本。这一发现强调，未来抗生素耐药防控策略应将“改善家庭饮水管理与储水卫生”作为重点干预方向，尤其在资源受限的城市非正规住区。
方法学上，PIC-seq技术通过混合测序1,516个菌落（来自321份样本），成功识别出50对菌株共享事件，灵敏度显著优于传统宏基因组方法（仅7对）。结合参考分箱与de novo组装的混合策略，使耐药基因检出率提升至81.6-89.2%。该技术为资源受限地区开展细菌传播和耐药性监测研究提供了一种相对高效的解决方案，其兼顾菌株分型与耐药基因检测的双重优势，虽暂限于特定菌种研究，但可拓展至其他细菌的传播追踪。