作者： 岳修枫，南京农业大学硕士在读，主要研究原噬菌体与土壤健康。
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为保证自身的成功繁殖，噬菌体已经进化出多种策略来克服宿主防御系统并操纵细菌的生物合成。与此同时，细菌也进化出了大量抵抗噬菌体的元件，这些元件包括核酸酶、解旋酶、蛋白酶和激酶。其中，来自 RM 系统（限制性修饰）和 CRISPR-Cas 系统的核酸酶能切割噬菌体 DNA ，已被广泛研究。然而，蛋白酶在噬菌体防御中的作用却鲜有研究。本文作者从铜绿假单胞菌噬菌体 PaoP5 中鉴定出一种名为 Dap1 的噬菌体蛋白，该蛋白具有调节细菌宿主行为和防御 Lon 蛋白酶介导的新型噬菌体抵抗机制的双重作用。此外， Dap1 能够提高噬菌体的生存优势、显著提升噬菌体治疗效率。 在这篇文章中作者识别到噬菌体 PaoP5 中的蛋白 Dap1 并对该噬菌体蛋白进行了功能鉴定，发现 Dap1 能够调节细菌的游动和生物膜的形成并设计了相关实验，同时通过 CRISPR-Cas9 系统敲除 PaoP5 中的 dap1 基因来研究其对噬菌体适应性的影响，进一步评估 Dap1 的功能。与此同时作者发现 Dap1 在噬菌体逃避抗噬菌体免疫中起着重要的作用，并将 Dap1 运用到小鼠模型中评估其在噬菌体疗法中的作用。通过一系列的实验和分析，详细阐述了噬菌体蛋白 Dap1 在调节细菌行为和逃避宿主免疫反应中的重要作用，并探讨了其在噬菌体治疗中的潜在应用。
一、 噬菌体蛋白 Dap1 抑制细菌运动
首先鉴定了裂解性噬菌体 PaPo5 中的基因，发现其具有相对广泛的宿主范围（图 1a ）。细菌运动和生物膜是 P. aeruginosa 的重要毒力因素，因此作者首先探究了来自 PaPo5 中的 60 个假定 orfs 的生物活性并发现 orf002 、 orf157 、 orf160 、 orf163 、 orf164 、 orf165 或 orf176 在 PAO1 中的表达引发了显著的生长缺陷（图 1b 第一排），这表明这些基因产物对 P. aeruginosa 具有潜在毒性，而在这些基因产物之中， orf003 （以下简称 Dap1 ）过表达显著抑制细菌游动和聚集（图 1b 第二排）但不影响细菌生长，这表明 Dap1 的靶点应该是细菌活力蛋白。之后作者尝试使用 RNA 测序来深入探究 Dap1 如何影响细菌运动。 dap1 的表达导致了 166 个基因在指数生长过程中的差异调控。其中， PAO1/ P -dap1 菌株中 52 个基因表达上调， 114 个基因表达下调（变化倍数 >2 ， P < 0.05 ，图 1c ）。
RNA-seq 数据显示生物膜所需要的 siaC 和 siaD 在 PAO1/p-dap1 菌株中显著上调，因此进一步探究 Dap1 是否影响铜绿假单胞菌生物膜的形成。根据 COMSTAT 分析显示，与表达空载体的 PAO1 相比， PAO1/p-dap1 菌株显著增加了生物膜产量 ( 图 1d) 。这些数据表明 Dap1 能够调节细菌的毒力，而细菌的运动和生物膜的形成是由第二信使信号分子环二 gmp (c-di-GMP)30 反向调节的，作者假设 Dap1 通过与二胍酸环化酶 (DGC) 或磷酸二酯酶 (PDE) 的结合来调节细胞内 c-di-GMP 水平，从而控制这两种表型。为了验证这一假设，作者使用细菌腺苷酸环化酶双杂交 (BACTH) 试验来检测 Dap1 的潜在蛋白质结合伴侣。与此同时作者发现 DipA 、 RocR 或 ProE 与 Dap1 联合表达可导致高水平的 β- 半乳糖苷酶活性 ( 图 1e) ，并通过使用共免疫沉淀 (CO-IP) 实验进一步验证了相互作用，发现 Dap1 仅与 DipA (PA5017) 共洗脱 ( 图 1f) ，而不与 RocR (PA3947) 或 ProE (PA5295) 共洗脱，表明由 Dap1 表达引起的细菌行为改变是通过其与 DipA 的相互作用介导的。 dipA 的失活导致细胞 c-di-GMP 水平升高，抑制鞭毛运动转换和游动。与 PAO1 中 dap1 的表达类似，与野生型亲本菌株相比， ΔdipA 突变体的生物膜形成增强，细菌游动和群体运动减弱 ( 图 1c) 。考虑到 Dap1 与 DipA 相互作用，作者推断在铜绿假单胞菌中 Dap1 的表达可能会改变胞内 c-di-GMP 水平。为此，作者利用 p-cdrA-lux 报告基因融合检测了 PAO1/p-dap1 和空载体 PAO1 中 c-di-GMP 的水平，并通过使用液相色谱 – 质谱 (LC-MS) 进一步验证了结果 ( 图 1g) 。正如预期的那样， dap1 的表达没有改变 ΔdipA 菌株胞内 c-di-GMP 水平和细菌行为 ( 图 1b) 。作者构建了铜绿假单胞菌感染的小鼠模型来研究噬菌体 Dap1 蛋白在 PAO1 发病机制中的作用，生存研究表明，感染 PAO1/ pUCP 的小鼠在 2 天内死亡 80% ，而感染 PAO1/pUCP –dap1 的小鼠在第 5 天的存活率为 100%( 图 1h) 。综上所述，这些数据表明噬菌体蛋白 Dap1 的表达抑制了铜绿假单胞菌的致病性。
图1 噬菌体蛋白 Dap1 通过与 c-di-GMP 磷酸二酯酶 相互作用调控铜绿假单胞毒力 之后作者研究了 Dap1 在噬菌体适应性中的潜在作用。首先，作者使用 RT-qPCR 证实 dap1 是一个早期表达基因。紧接着使用 CRISPR-Cas9 系统删除 PaoP5 中的 dap1 基因，并以敲除 orf014 和 orf153 作为对照。作者发现 PaoP5Δdap1 形成了微小的噬菌斑，而 PaoP5Δorf14 和 PaoP5Δorf153 形成了类似野生型 (WT) 噬菌体的大斑块 ( 图 2a) 。此外， PAO1 中 dap1 的表达可以恢复 PaoP5Δdap1 的大斑块，而 PaoP5Δdap1 在 PAO1/p-dap1 中的 EOP 与 PAO1/ EV 中的相似 ( 图 2b) 。这表明 dap1 对噬菌体适应性很重要。作者认为 PaoP5Δdap1 和 WT 噬菌体都能有效地与宿主结合 (P > 0.05 ) ，因此与宿主的结合并不是造成噬菌体差异的原因 ( 图 2c) 。而由于噬菌斑大小与裂解有关，所以作者评估了两种噬菌体的裂解量大小。一步生长曲线实验表明， PaoP5Δdap1 产生的后代比 PaoP5 少 ( 图 2d) 。 PaoP5 和 PaoP5Δdap1 的裂解量大小分别为 ~104.95±17.14 pfu/ 细胞和 14.52±3.62 pfu/ 细胞 ( 图 2e) 。因此， PaoP5Δdap1 产生的后代数量仅为野生型噬菌体 PaoP5 产生后代数量的 ~13.83% 。 由于 Dap1 抑制 DipA ，因此作者推断 DipA 可能限制 PaoP5Δdap1 的复制。然而， PaoP5Δdap1 的小斑块形成表型在感染 ΔdipA 时不能被挽救，这表明尽管 Dap1 抑制 DipA ，但 Dap1 赋予的噬菌体适应性与 DipA 无关。 图2 PaoP5Δdap1 形成小噬菌斑，产生较少的后代
由于 dap1 是一个促进噬菌体生产力的早期表达基因，作者假设 PAO1 中未知的噬菌体防御系统可能抑制噬菌体生产力，而 dap1 可以克服这种噬菌体防御系统。因此，作者使用蛋白质组学方法来表征 Dap1 对噬菌体蛋白 ( 图 3a) 和宿主蛋白的影响。 PaoP5Δdap1 -infected PAO1 中下调了两种噬菌体蛋白 (Orf049, Orf050) 。 Orf050 在 PaoP5Δdap1 -infected 中的丰度降低到约为 PaoP5 感染 PAO1 蛋白水平的十分之一 ( 图 3a) 。 Orf50 为 HNH 内切酶，它是噬菌体 DNA 包装的重要组成部分。 PaoP5Δdap1 能够形成大斑块 ( 图 3b) ，这表明 HNH 水平的降低对 PaoP5Δdap1 包装的减少有影响。而阴性染色的噬菌体裂解物的电子显微镜显示，由于噬菌体 PaoP5Δdap1 裂解物缺乏 DNA 包装，导致大量的噬菌体颗粒不含 DNA ，并且在 PAO1 中表达 dap1 或 hnh 完全恢复了 DNA 包装效率至野生型噬菌体水平 ( 图 3c,d) 。这些数据表明，当 PaoP5Δdap1 感染 PAO1 时，噬菌体 HNH 内切酶显著降解，产生的后代也更少。
图3 PaoP5Δdap1 在基因组包装中效率较低
五、 Lon 蛋白酶保护 PAO1 抵抗 PaoP5Δdap1 以上数据都表明 Dap1 可能保护 HNH 内切酶免受快速降解。作者推断铜绿假单胞菌的蛋白酶 Lon 可能参与了 HNH 内切酶的降解。有研究表明 Lon 可切割大肠杆菌的原噬菌体蛋白。为了验证这一假设，作者使用 PaoP5Δdap1 感染野生型 PAO1 或 Δlon ，而数据表明 PaoP5Δdap1 在 Δlon 中形成的斑块比在 PAO1 中形成的斑块更大 ( 图 4a) 。此外，电子显微照片显示， PaoP5Δdap1 的大多数后代都被 DNA 包裹在 Δlon 中 ( 图 4b,c) 。然后，作者通过 4D 无标记高通量蛋白质组学分析 PaoP5Δdap1 -infected 或 Δlon ，发现 Lon 对宿主蛋白有显著影响，鉴定出 697 个宿主蛋白为差异表达蛋白。在噬菌体蛋白中， PaoP5Δdap1 -infectedlon 中的 HNH 内切酶 (Orf050) 丰度明显高于 PaoP5Δdap1 -infected PAO1( 图 4D) ，这说明没有 Lon ，噬菌体 HNH 内切酶无明显降解。 上述结果暗示了铜绿假单胞菌 Lon 蛋白酶可能作为宿主编码噬菌体限制性蛋白的功能作用。作者发现 Lon 可以抑制铜绿假单胞菌噬菌体 PaP_Se ，因为在没有 Lon 的情况下，噬菌体滴度增加了约 100 倍 ( 图 4e) 。然而，过表达 dap1 并不能提高 PAO1 中噬菌体 PaP_Se 的生产力，这表明 Lon 可能通过其他机制保护 PAO1 免受 PaP_Se 的侵害，而这些机制是噬菌体 dap1 无法克服的。总的来说，这些数据揭示了 Lon 蛋白酶作为噬菌体防御蛋白和抑制 PaoP5Δdap1 和环境分离 噬菌体 PAP_se 的作用。
图 4 蛋白酶降低了 HNH 内切酶的丰度，抑制了 PaoP5Δdap1 噬菌体基因组的包装 六、 Dap1 与 HNH 结合，阻止长链介导的 HNH 降解 由于 Lon 蛋白酶降低了 HNH 内切酶的丰度，作者进行了体外实验，发现在 Lon 蛋白酶和激酶存在的情况下 HNH 内切酶被降解 ( 图 5a) 。通过细菌双杂交 ( 图 5b) 和 Co-IP 分析 ( 图 5c) 均未发现 Dap1 和 Lon 之间的直接相互作用。由于 Lon 是一种重要的蛋白酶，如果 Dap1 直接与 Lon 结合并干扰其功能，作者预计过表达 Dap1 的 PAO1 会出现生长缺陷，但事实并非如此。因此，作者的数据表明 Dap1 不会与 Lon 结合以抑制其蛋白酶活性。随后作者提出 Dap1 可能与 HNH 内切酶结合以阻止长链介导的 HNH 降解。正如预期的那样， BACTH( 图 5b) 和 pull-down 实验 ( 图 5d) 都检测到了 Dap1 与 HNH 的结合，体外蛋白降解实验显示 Lon 降解了 Dap1 。然而，当 Dap1 与 HNH 预混时， Dap1-HNH 混合物的降解减少 ( 图 5e) 。总的来说， Dap1 与 HNH 结合，保护其免受长链介导的降解。 图 5 Dap1 结合 HNH 内切酶阻止长链介导的 HNH 降解 为了进一步表征 dap1 对噬菌体适应性的影响，作者进行了竞争实验，发现 PaoP5 和 PaoP5Δdap1 的相对丰度分别为 94.67%±2.62% 和 3.33%±2.62%( 图 6a) 。此外， PaoP5Δdap1 被另外两种环境分离的噬菌体打败 ( 图 6a) 。总之，这一结果表明 PaoP5Δdap1 在与感染同一宿主的其他噬菌体竞争时处于明显的劣势，这表明 dap1 对 Paop5 类噬菌体在自然环境中的生存至关重要。作者随后利用小鼠模型进一步测试了 Dap1 对噬菌体治疗的影响。单剂量的 PaoP5 噬菌体在感染复数 (MOI) 为 10 时，可抑制 100% 的铜绿假单胞菌腹腔感染小鼠 ( 图 6b) 。然而，当 P. aeruginosa 腹腔感染小鼠用单剂量噬菌体 PaoP5Δdap1 处理时，所有小鼠在 7 天内死亡，尽管小鼠表现出延迟死亡时间 ( 图 6b) 。。为了评估噬菌体耐药性是否是 PaoP5Δdap1 治疗失败的原因，从死亡小鼠中分离的 200 个菌落进行了噬菌体耐药性评估。总体而言，这些菌株中 41% 是噬菌体敏感的铜绿假单胞菌， 39% 是耐噬菌体的铜绿假单胞菌，而其他耐噬菌体菌株是肠道共生菌，它们可能在全身性细菌共感染后转移到肝脏。因此，在 PaoP5Δdap1 -treated 小鼠中观察到噬菌体抗性突变，这也可能是导致小鼠死亡的原因。这些数据表明， dap1 对噬菌体治疗的有效性至关重要，而自我复制以产生足够的后代来快速感染和清除细菌是噬菌体治疗成功的关键。接下来，作者检索了 NCBI 的同源基因，调查了 dap1 和 hnh 基因在铜绿假单胞菌噬菌体中的流行程度。截至 2023 年 10 月， 785 个测序的假单胞菌噬菌体中，有 50 个携带 dap1 同源基因，根据系统发育关系， 48 个同源性最低为 90% 的 dap1 样噬菌体基因聚为 3 支 ( 图 6c) 。具体来说， dap1 在 pak_p1 样噬菌体中相对保守，对于 hnh 基因， BLAST 预测了 99 个 hnh 内切酶，与 ORF050 的同源性最低为 30% ，聚类为 7 个分支 ( 图 6d) 。这些生物信息学分析表明， dap1 样基因在铜绿假单胞菌噬菌体的一个亚群中是保守的。 图 6 Dap1 对噬菌体的适应性和噬菌体治疗的有效 性至关重要
该项研究深入揭示了噬菌体蛋白 Dap1 的双重功能：它不仅能够调控细菌的行为，而且还能帮助噬菌体逃避由细菌 Lon 蛋白酶所介导的噬菌体防御机制，显著提升了噬菌体的适应性和生存能力。这些发现不仅为我们理解噬菌体如何通过进化策略来增强其在宿主环境中的适应性提供了新视角，也为噬菌体疗法的开发和应用提供了潜在的新思路。
原名： Bacteriophage protein Dap1 regulates evasion ofPseudomonas aeruginosa virulence impacting phage 译名： 噬菌体蛋白Dap1调节抗噬菌体免疫逃避和铜绿假单胞菌的毒力，影响小鼠中的噬菌体治疗 DOI ： https:///10.1038/s41564-024-0171 9-5
