写在前面
事实上，我们从来没想过要做细胞器基因组，更没有想到和唐总（在广州时团队的小伙伴）一起折腾了HiMT。显然，HiMT应该是从一定程度上缓解了“细胞器基因组组装焦虑”。我们主要解决了两个小问题：
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计算资源和计算速度； -
更直观的组装质量评估；
前者不言而喻，用了HiMT的朋友应是都清楚。如果还没用过也不担心，有必要时我们也可以写一个简单的HiMT上手教程，尽管绝大多数情况下，你只是需要用 TBtools 的 HiMT 插件或者一行命令。
但问题也来了，不少人组装好了细胞器基因组，比如叶绿体或者线粒体基因组之后，下一步呢？这个能告诉我们啥？当然序列分析是一方面，一般还拿来做啥，对于主业并不在演化上的，或许也能拿来构建进化树，粗略判断材料间的演化关系。
如何做？
以叶绿体基因组为例（逻辑上线粒体基因组类似）：
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明确输出文件的含义，尤其是找到对应的 .fasta 序列文件； -
使用 1. 得到的 fasta 序列文件，进行基因组的注释，有许多工具，比如GeSeq可以选，也可以直接在线注释； -
使用 1. 得到的 fasta 序列文件，直接比对到 NCBI 筛选到近源可用的细胞器基因组，选择并下载多个物种细胞器基因组； -
（可选的外类群）使用 1. 得到的 fasta 序列文件，直接比对到 NCBI ，注意排除过渡近源细胞器基因组（比如同个属的），随后，作为外类群
简要图文教程如下：
一般组装完成后，我们最好是直接本地打开质量评估报告，看看其中保守基因的概况，最直接的指标就是看看是否全面，相似度是否高。自然有经验的会有更好的判断，但一般全面和相似度都高，那么就基本说明问题了（兴许这类我们也可以后续写一个教程）。
对应的叶绿体一般有两种基因组的“异构体”，无需在意这个中文描述，我们的命名上是参考GetOrganelle的。此处我们直接使用chloroplast_path1.fa即可。
进行叶绿体基因组注释
具体可以参考之前推送过的教程，简要如下：打开网页， http://47.96.249.172:16019/analyzer/home
选择菜单栏的「AnnoGenome」，点击后，按照要求填写内容即可，逻辑上因为叶绿体基因组还是非常保守的，可以考虑只使用 43 个参考物种注释，有必要也可选择其他。如果偷懒就直接上传文件，点击 Submit 即可。我个人是建议放一个邮箱，避免网络问题，找不到注释结果。
Submit之后会报错
这个是应该是网站值得优化的地方，回头提交给作者团队。看报错，我们修改一下后缀即可。
重新上传注释
等20min之内的邮箱邮件即可，事实上，我认为这个应该是速度非常快的，估计是网站业务量大，导致速度有限。但不影响，现在是 12:06，我回家吃个饭回来看结果刚好。
我发现似乎没有收到邮件，没关系，一般这个几分钟就完成了，直接黏贴我们上面得到的任务编号「175713148432005」，点击「Submit」即可。
结果如下
实际上，我们只需要这个「GenBank」文件，即可用于后续进化树构建，当然，最好是替换一下物种名
确定近源物种和可选的外类群
直接将前述选取的 .fasta 文件比对到NCBI就可以了
这样比对，大概率就可以得到足够近源的系列物种细胞器
勾选一些你觉得合适的物种，下载他们的GenBank文件就可以。顺便我们找个外类群。
方法简单，直接重新BLAST
选第一个就可以了，同样下载GenBank文件
构建进化树
将上述2个或者3个GenBank文件放置到一个目录，随后 TBtools 一键构建进化树
随后直接将三个文件所在目录，整个目录设置到功能界面即可
蛋白也可以，CDS也可以，后者分辨率会高一些，运行起来会慢一些。整个逻辑非常简单：
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检索目录下所有GenBank文件，其中的叶绿体基因组中的CDS和蛋白注释； -
细胞器基因组一般没什么WGD或者基因复制事件，总的来说，就是有比较多的单拷贝的基因，这些单拷贝的基因可以认为就是同源的； -
提取所有单拷贝基因的CDS或者蛋白； -
逐个对单拷贝基因进行多序列比对，和修剪； -
串联所有比对结果，这样每个物种就是一个很长的序列，也就是位点就足够多了； -
调用IQtree构建ML树
得到结果
进入其中，找到 .treefile 文件即可，使用 TBtools Simple Tree View 快速可视化
一般要手动以outgroup定根，但我为了方便，直接 MADPoint 定根，试过了，没遇到过错误的时候。结果如下
很明显，外类群是根，其他的咱们就不说了。挺好的结果。
写在最后
没啥，就是不想干活，所以写了教程。当然，如果你是线粒体基因组，一样的。