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Tasquinimod 增强了顺铂在 OC/DDP 细胞中的抗增殖和促凋亡作用
首先，作者鉴定了 SKOV3/DDP 和 A2780/DDP 细胞。从 Supplementary Fig. 1A 可以看出，SKOV3/DDP 和 A2780/DDP 细胞的 DDP 耐药性得到了显著改善。为了探究 Tasquinimod 对 OC 细胞中 HDAC4 表达的影响，作者测量了 SKOV3/DDP 和 A2780/DDP 细胞中的 HDAC4 水平。结果表明，这些细胞中的 HDAC4 表达与普通 OC 细胞相比显著升高（ Fig. 1A ）。然而，在用 40 μM Tasquinimod 处理时，SKOV3/DDP 和 A2780/DDP 细胞中的 HDAC4 表达被下调，达到低于非耐药 SKOV3 和 A2780 细胞系的水平（ Fig. 1A ），这表明 Tasquinimod 可以抑制 OC/DDP 细胞中的 HDAC4 表达。作者进一步分析了 Tasquinimod 单药治疗对 OC/DDP 细胞活力和凋亡的影响，观察到与 DDP 单药治疗相比，Tasquinimod 单药治疗在抑制细胞活力和促进凋亡方面更有效（ Fig. 1B, C ）。此外，DDP 与 Tasquinimod 联合治疗比单独使用 DDP 进一步降低了 OC/DDP 细胞的活力并增加了凋亡（ Fig. 1B, C ）。 这些发现表明 Tasquinimod 与顺铂具有协同作用，抑制了 HDAC4 表达和顺铂耐药性。
图 1. Tasquinimod 增强了顺铂在 OC/DDP 细胞中的抗增殖和促凋亡作用。
(A) Western blot 分析证实 Tasquinimod 抑制了 SKOV3/DDP 和 A2780/DDP 细胞中的 HDAC4 表达。(B) CCK8 实验用于评估 Tasquinimod 单药治疗对 SKOV3/DDP 和 A2780/DDP 细胞活力的影响。(C) 流式细胞术用于检测 Tasquinimod 单药治疗处理的 SKOV3/DDP 和 A2780/DDP 细胞的凋亡情况。所有实验均独立重复三次。使用 Tukey 检验和单因素方差分析进行统计分析。结果以均值±标准差表示。OC，卵巢癌；HDAC4，组蛋白去乙酰化酶 4；CCK8，细胞计数试剂盒-8。*p < 0.05vs SKOV3 组或 A2780 组，#p < 0.05 vs SKOV3/DDP 组或 A2780/DDP 组，&p < 0.05 vs SKOV3/DDP 细胞组或 A2780/DDP 细胞组，$p < 0.05 vs SKOV3/DDP 细胞+顺铂组或 A2780/DDP 细胞+顺铂组。
Tasquinimod 通过抑制 HDAC4 促进 OC/DDP 细胞的凋亡
研究表明，肿瘤细胞的药物耐药性与细胞增殖和凋亡过程有关[14 ]。为了进一步探索 Tasquinimod 的作用机制，作者在 OC/DDP 细胞中沉默和过表达 HDAC4。Western blot 结果证实了 HDAC4 沉默和 HDAC4 过表达 OC/DDP 细胞系的构建成功，分别表现为 HDAC4 表达减少和增加（ Fig. 2A ）。此外，HDAC4 的过表达导致 OC/DDP 细胞中 HDAC4 表达增加，而 Tasquinimod 则抑制了这一现象（ Fig. 2A ）。
图 2. Tasquinimod 通过抑制 HDAC4 促进 OC/DDP 细胞的凋亡
(A) Western blot 分析 Tasquinimod 对 HDAC4 表达的影响。(B) 使用 CCK8 实验评估 Tasquinimod 对细胞活力的影响。(C) 使用流式细胞术检测 Tasquinimod 处理后的 SKOV3/DDP 和 A2780/DDP 细胞的凋亡情况。(D, E) 使用 qRT-PCR 和 Western blot 分析测量 Tasquinimod 处理后的肿瘤细胞中 Bcl-2 和 cleaved-Caspase-3 的表达水平。所有实验均独立重复三次。使用 Tukey 检验和单因素方差分析进行统计分析。结果以均值±标准差表示。OC，卵巢癌；HDAC4，组蛋白脱乙酰酶 4；CCK8，细胞计数试剂盒-8；NC，阴性对照组。*p < 0.05vs SKOV3/DDP + NC 组或 A2780/DDP + NC 组，#p < 0.05 vs SKOV3/DDP 组或 A2780/DDP 组，&p < 0.05 vs SKOV3/DDP + Tasquinimod 组或 A2780/DDP + Tasquinimod 组。
细胞活力和凋亡检测表明，OC/DDP 细胞的总体活力随时间逐渐增加。Tasquinimod 和 si-HDAC4 处理抑制了 OC/DDP 细胞的活力并促进了其凋亡。此外，HDAC4 的过表达增加了细胞活力并抑制了凋亡，但这些效应被 Tasquinimod 处理所逆转（Fig. 2B, C ， Supplementary Fig. 1B ）。这些结果表明，Tasquinimod 通过 HDAC4 抑制细胞活力并促进 SKOV3/DDP 和 A2780/DDP 细胞的凋亡。
Bcl-2 的表达水平在 Tasquinimod 处理后显著下调，而 cleaved-Caspase-3 的表达水平在 SKOV3/DDP 和 A2780/DDP 细胞中显著上调（Fig. 2D, E ）。HDAC4 的过表达促进了 OC/DDP 细胞中 Bcl-2 的表达并抑制了 cleaved-Caspase-3 的表达，而 Tasquinimod 逆转了这些效应（ Fig. 2D, E ）。这些发现表明 Tasquinimod 通过抑制 HDAC4 促进 OC/DDP 细胞的凋亡。
Tasquinimod 影响了顺铂耐药的 OC/DDP 细胞的细胞周期
使用流式细胞仪分析了 Tasquinimod 处理后 OC/DDP 细胞的细胞周期。数据显示与对照组相比，SKOV3/DDP 和 A2780/DDP 细胞的 G1 期显著增加（Fig. 3A ），表明 Tasquinimod 可以调节 OC/DDP 细胞的细胞周期。qRT-PCR 和 Western blot 分析显示，在 Tasquinimod 处理的 SKOV3/DDP 和 A2780/DDP 细胞中 p21 表达显著增加（ Fig. 3B , C）。由于 p21 在细胞周期调控中起关键作用，这些结果表明 Tasquinimod 可以调节 OC/DDP 细胞中的 p21 表达，从而影响其细胞周期。
图 3. Tasquinimod 影响了顺铂耐药的 OC/DDP 细胞的细胞周期。
(A) Tasquinimod 处理后的 SKOV3/DDP 和 A2780/DDP 细胞的细胞周期流式细胞术分析。(B, C) Tasquinimod 处理后 SKOV3/DDP 和 A2780/DDP 细胞的 p21 表达水平 qRT-PCR 和 Western blot 分析。所有实验独立重复三次。使用 Tukey 检验和单因素方差分析进行统计分析。结果以均值±标准差表示。OC，卵巢癌；HDAC4，组蛋白脱乙酰酶 4；NC，阴性对照。*p < 0.05vs SKOV3/DDP + NC 组或 A2780/DDP + NC 组，#p < 0.05 vs SKOV3/DDP 组或 A2780/DDP 组。
Tasquinimod 调节 OC/DDP 细胞中细胞周期相关基因的表达
鉴于 Tasquinimod 能够调节 p21 并影响细胞周期，作者研究了 Tasquinimod 是否也影响其他细胞周期相关基因。qRT-PCR 分析显示，与 OC/DDP 相比，OC/DDP + Tas 组中 p21 表达上调，而 cyclin D1 和 CDK4 的表达下调。这种变化被 si-p21 或 UC2288（一种 p21 抑制剂）处理所逆转 ( Fig. 4A, B )。免疫荧光结果与 qRT-PCR 结果一致 ( Fig. 4C, D )。此外，沉默或抑制 p21 部分恢复了 Tasquinimod 对 OV 细胞活力的抑制作用 ( Fig. 4E )。此外，与 OV/DPP + Tasquinimod 组相比，在 OV/DPP + Tasquinimod + si-p21 或 UC2288 组中，G1 期细胞数量减少，而 G2 期细胞数量增加 ( Fig. 4F )。这些结果表明，Tasquinimod 影响细胞周期相关基因的表达，从而影响细胞周期进程。
图 4. Tasquinimod 调节 OC/DDP 细胞的细胞周期相关基因表达。
(A, B) Tasquinimod 处理后的 SKOV3/DDP 细胞和 A2780/DDP 细胞中 p21、细胞周期蛋白 D1 和 CDK4 表达水平的 qRT-PCR 分析。(C, D) Tasquinimod 处理后 SKOV3/DDP 细胞和 A2780/DDP 细胞中 p21、细胞周期蛋白 D1 和 CDK4 表达水平的免疫荧光分析。标尺代表 25 μm。(E) CCK8 实验验证 Tasquinimod 处理后 SKOV3/DDP 细胞和 A2780/DDP 细胞的细胞活力。(F) Tasquinimod 处理后 SKOV3/DDP 细胞和 A2780/DDP 细胞周期的流式细胞术检测。所有实验均独立重复六次，使用 Turkey 检验和单因素方差分析进行统计显著性分析。数据以均值±标准差表示。OC，卵巢癌；CCK8，细胞计数试剂盒-8；NC，阴性对照；IOD，积分光密度。*p < 0.05vs SKOV3/DDP 组或 A2780/DDP 组，#p < 0.05 vs SKOV3/DDP + Tas + NC 组或 A2780/DDP + Tas + NC 组，&p < 0.05 vs SKOV3/DDP + Tas 组或 A2780/DDP + Tas 组。
Tasquinimod 促进顺铂在 OC/DDP 细胞异种移植小鼠中的抗肿瘤作用
目前，尚未有研究报道 Tasquinimod 对动物模型中顺铂耐药性的影响。为探究 Tasquinimod 是否能在动物模型中发挥作用，作者对小鼠进行了肿瘤细胞注射检测。作者的研究发现，与注射 SKOV3 或 A2780 细胞的小鼠相比，注射 OC/DDP 细胞的小鼠在顺铂治疗后肿瘤的大小和重量显著增加。然而，当在顺铂治疗的基础上添加 Tasquinimod 时，注射 OC/DDP 细胞的小鼠肿瘤的大小和重量显著减小，甚至比注射 SKOV3 和 A2780 细胞的小鼠更小更轻（ Fig. 5A–C ），显示出良好的治疗效果。这些结果表明，Tasquinimod 能够增强顺铂在小鼠体内注射 SKOV3/DDP 和 A2780/DDP 细胞时的抗癌效果。
图 5. Tasquinimod 增强了顺铂对小鼠 OC/DDP 细胞异种移植肿瘤的抗肿瘤作用。
(A–C) 测量并比较了小鼠在接受 Tasquinimod 联合顺铂治疗后肿瘤体积和重量。(D) 检测小鼠肿瘤细胞中 HDAC4 的表达水平的免疫荧光分析。(E) 检测小鼠肿瘤组织中 HDAC4、p21、细胞周期蛋白 D1 和 CDK4 表达水平的蛋白质印迹分析。(F) 检测小鼠肿瘤组织中细胞凋亡的流式细胞术分析。所有实验均独立重复三次。使用 Tukey 检验和单因素方差分析进行统计分析。数据以均值±标准差表示。OC，卵巢癌；HDAC4，组蛋白去乙酰化酶 4；IOD，积分光密度。*p<0.05vs. SKOV3 或 A2780 组，#p<0.05vs. SKOV3/DDP 或 A2780/DDP 组。
由于 Tasquinimod 在小鼠肿瘤细胞中的作用机制尚不明确，作者进一步检测了肿瘤细胞中相关基因的表达水平。作者的免疫荧光结果显示，OC/DDP 细胞异种移植中 HDAC4 的表达水平与肿瘤大小和重量一致（ Fig. 5D ， Supplementary Fig. 1C ）。Western blot 分析显示，在 Tasquinimod 处理后，HDAC4、p21、细胞周期蛋白 D1 和 CDK4 的表达发生了显著变化，与体外细胞实验的结果一致（ Fig. 5E ）。此外，流式细胞术结果提示，在 Tasquinimod 处理的小鼠中，肿瘤细胞凋亡增加（ Fig. 5F ）。这些结果表明，Tasquinimod 可能通过调节凋亡和细胞周期相关基因发挥其功能，影响细胞过程，从而逆转顺铂耐药性。
总结
卵巢癌（OC）的发生和发展是一个多阶段的过程，涉及增殖、凋亡、血管生成、迁移、侵袭和转移。凋亡过程与癌症发展密切相关。凋亡相关基因，如 Bcl-2 和 Caspase-3，在癌细胞中发挥调控作用[43 , 44 ]。关于卵巢癌化疗耐药性的数据显示，肿瘤对凋亡的敏感性降低与药物耐药性密切相关[ 45 ]。Bcl-2 的上调和 Bax 的下调与化疗耐药性的增加显著相关[ 46 , 47 ]。因此，提高肿瘤对凋亡的敏感性是克服卵巢癌药物耐药性的潜在策略。在后续实验中，通过流式细胞术和 CCK8 试验检测了卵巢癌/DDP 细胞的凋亡水平和细胞活力。研究发现，与未处理的卵巢癌/DDP 细胞相比，接受 Tasquinimod 处理的卵巢癌/DDP 细胞的凋亡程度显著更高。可以合理假设，Tasquinimod 通过抑制卵巢癌/DDP 细胞中 HDAC4 的表达可能与其凋亡过程有关，尽管其机制仍有待探索。 鉴于所有细胞均为顺铂耐药的卵巢癌/顺铂耐药细胞，作者假设 Tasquinimod 可能影响卵巢癌/顺铂耐药细胞的耐药性，而这种效应可能与凋亡过程有关。然而，它们之间的调控关系仍不明确。
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