微精选

常规处理、福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织样本适合用于免疫组化及分子检测。

标本类型:手术切除标本和肠镜活检标本

活检标本建议取6-8块，多点活检能提高检测的准确性

规范的标本固定是病理质量的保障。根据CAP PPMPT提供的关于样本固定标准的建议:

• 标本离体后30-60min内进行标记、切开、固定等初步处理

• 组织应完全浸没在固定液中，确保固定液体积与组织质量之比不小于4:1，最佳比例为10:1

• 组织应在10%中性磷酸盐缓冲福尔马林(pH 7.0)中固定至少6h，不超过24-36h，如果组织脂肪含量高，固定可能需要长达48h

▶结直肠癌预后预测组织学风险因素

粘液细胞癌、粘液腺癌、印戒细胞癌、髓样癌、脉管侵犯、肿瘤的癌结节、肿瘤的包膜、肿瘤出芽

▶结直肠癌的组织学类型

1、腺癌：占绝大多数。国内又细分为管状腺癌及乳头状腺癌两种，后者恶性程度较低。

2、特殊类型的腺癌：黏液腺癌、印戒细胞癌一般都是愈后相对比较差一点，髓样癌预后相对好一点。比较少见的是锯齿状腺癌、乳头状腺癌、腺瘤腺癌、腺瘤癌或是伴有肉瘤样成分癌等。

3、其他：神经内分泌癌、混合性神经内分泌癌、非神经内分泌癌等。需要注意的是，混合性的神经内分泌癌需要多点取材，只有当每种成分的比例大于30%才能被定义为混合性的神经内分泌癌。

▶结直肠癌的组织学分级

根据肿瘤腺样结构形成的比例区分

• 1级–高分化腺癌:>95%

• 2级–中等分化腺癌:50-95%

• 3级低分化腺癌:5-50%(包括粘液腺癌及印戒细胞癌)

• 4级—未分化癌:<5%

▶浸润深度(T分期)

腺癌定义:肿瘤浸润黏膜肌层进入黏膜下层

高级别上皮内瘤变:具有腺癌形态学特点的病变局限于黏膜层内。

切除后无转移风险，避免过度治疗。

T1：肿瘤侵犯粘膜肌层，到达黏膜下层

T2：肿瘤侵犯固有肌层，包括浅肌层和深肌层

T3：肿瘤浸润至固有肌层外的纤维脂肪组织，但还没有到达浆膜层

T4：肿瘤浸润至浆膜外纤维脂肪组织

浆膜侵犯与CMR评估：

（1）浆膜侵犯的病理形态学诊断依据

• 肿瘤细胞直接位于浆膜表面(T4a)

• 穿孔部位，肿瘤细胞与浆膜之间延续性炎症(T4a)

• 浆膜表面无肿瘤细胞伴有浆膜面糜烂或者溃疡，间皮细胞增生和/或炎症反应(T4a)

（2）环状切缘(CRM)评估

• 升结肠、降结肠、上段直肠（仅部分有腹膜覆盖）：建议手术者注明

• 中、下段直肠：整个切除标本表面均为CRM

• 直肠癌全系膜切除环状切缘CRM阴性的定义:切缘距离肿瘤>1mm

1.淋巴结转移强调肿瘤沉积，即癌结节。癌结节是指无区域淋巴结转移，但浆膜下、肠系膜内或无腹膜覆盖的直肠、结肠周围的脂肪组织内有肿瘤结节，且癌结节与癌症不连续，周围无残存的淋巴组织。
2.对于已有淋巴结转移的结直肠癌患者，癌结节视为独立的预后不良因素。

3.当淋巴结阳性时，癌结节不计入淋巴结计数，需要单独列出。
4.在评估淋巴结时，建议取材数不少于12枚以确保准确性。

▶其他预后影响因素

（1）脉管侵犯

（3）肿瘤出芽（Tumor Budding）

肿瘤出芽是指在浸润性癌的浸润侧前沿，间质内散在的单个肿瘤细胞或 ≤ 4个肿瘤细胞的低分化癌细胞簇。

计数（单个）热点区（20x objective）的出芽数目，按数目勾选：

Bd1（0-4buds）；Bd2（5-9buds）；Bd3（≥10buds）

肿瘤出芽的临床意义：

· TB分级与CRC临床病理学因素密切相关，如TNM分期、脉管侵犯、淋巴结和远处转移、疾病复发、患者存活率以及患者对抗EGFR靶向药物的敏感性

· 高TB的I期CRC患者存活时间较短。在pT1结直肠癌（包括恶性息肉）中，高级别TB与淋巴结转移风险增高有关

· TB是II期结肠癌的独立预后因素。ASCO指南将TB指定为 II期结肠癌的不良（高风险）因素。切除或活检大肠癌标本内TB密度也可以帮助评估II期CRC患者能否从辅助治疗中获益。

（4）TRG

Tumor Regression Grade(新辅助治疗后)肿瘤退缩分级

TRG评分: 最常用的疗效评估标准

TRG=0（完全退缩）：无镜下可见的肿瘤细胞

TRG=1（中等退缩）：仅见单个/小灶肿瘤细胞

TRG=2（轻微退缩）：肿瘤残留但少于纤维化间质

TRG=3 （无退缩）：无/少量肿瘤细胞坏死，广泛肿瘤残留

预后分层：
与MSS患者相比，MSI-H患者死亡风险降低35%

dMMR/MSI-H型Ⅱ期结直肠癌患者预后较好

指导治疗：

dMMR/MSI-H II 期结直肠癌患者易对5-FU产生耐药

dMMR/MSI-H II 期结直肠癌术后可不用化疗

dMMR/MSI-H 实体瘤对免疫检查点抑制剂治疗敏感

MSI基因检测

①PCR荧光毛细管电泳法

PCR荧光毛细管电泳法仍是目前检测MSI的金标准。

PCR检 测 方 法 检 测 位 点 ：5个 位 点 （ BAT-25、 BAT-26、

D2S123、D5S346和D17S250）。

MSI-H：有2个或2个以上有不稳定性，就定义为MSI-H。

MSL-L：1个位点不稳定定义为MSL-L。

MSS：没有位点改变就定义为微卫星稳定(MSS)。

缺点：

· 测序仪价格高，普及度低

· 毛细管需要专业人员安装和更换

· 仪器对环境、温湿度，搬运要求严格

· 产物污染持续存在

②NGS检测

2018年 ESMO年 会 上 ,ESMO精 准 医 学 工 作 组 (ESMO Precision Medicine Working Group)推 荐 将 NGS作 为 MSI的二线检测方法(Second line testing)

· 2019年NCCN结直肠癌临床实践指南亦指出，MSI检测可通过经验证的NGS panel进行，尤其是对于那些需要同时检测RAS/BRAF突变状态的转移性CRC患者。

MSI与MMR不一致可能的原因

①dMMR VS MSS

约5%-10%的dMMR并未导致MSI的出现

· 某些蛋白功能缺失(如MSH6)被功能代偿

· MLH1的启动子区甲基化导致的肿瘤异质性

②PMMR VS MSI-H

约5%-10%的MSI发生并没有伴随dMMR

· 某些MMR蛋白错义突变，损害MMR功能，但能被抗体检测识别

· 由四种基因以外的其他基因引起的MSI

(1) 标本的选择——原发灶及转移灶?

转移灶与原发灶的一致性:结直肠癌常用分子生物标志物在原发灶和转移灶中的表达整体一致率>90%

· 转移或复发灶的标本是首选。

· 基于临床研究的数据，在无法获取转移或复发灶标本时，原发灶标本是可选的标本来源。

(2) RAS和BRAF检测

检测位点：

· RAS基因突变分析应包括KRAS和NRAS中第2号外显子的第12、13位密码子，第3号外显子的第59、61位密码子，以及第4号外显子的第117和146位密码子。

· BRAF基因突变分析应包含V600E。

检测方法：

· RAS和BRAF点突变可以采用的检测方法包括：Sanger测序法、PCR及NGS等。

· BRAF V600E也可用IHC检测，报道显示其与分子检测方法一致性大于99%。

（3）结直肠癌HER2检测

· 检测方法有IHC, FISH, NGS

· IHC 检测HER2 阳性定义为：大于50%的肿瘤细胞呈现3 阳性着色，即细胞膜的基底和侧边或侧边或整个胞膜呈强阳性着色。HER2 评分2 的患者应通过FISH 检测进一步明确Her2 基因状态。

HER2基因扩增的阳性定义：为>50%的肿瘤细胞HER2/CEP 17 比值≥2，NGS 是检测HER2 扩增的另一种可选方法

· 抗HER2治疗仅适用于HER2扩增且RAS和BRAF 野生型的肿瘤

（4）NTRK融合基因的检测方法

· NTRK基因融合在结直肠癌中非常罕见，发生率约为0.35％

· 仅限于RAS和BRAF野生型的结直肠癌，且绝大多数为dMMR/MSI-H的结直肠癌

获批试剂盒：

· IHC:VENTANA pan-TRK(EPR17341)Assay(已获FDA和NMPA批准)

Pan-TRK IHC 可以检测3种融合蛋白–TRKA,TRKB,TRKC，以及野生型TRK蛋白。

目前免疫组化方法检测Pan-TRK已有获批试剂盒，免疫组化可提供一种经济的方法用来检测TRK蛋白的过表达，但检测结果仍需用NGS等方法验证，来确定该过表达是源于NTRK基因发生融合。