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2025年11月15日，马里奥·内格里药理学研究所IRCCS Caterina Bendotti研究团队在《Journal of Neuroinflammation》期刊发表：Loss of C9orf72 impacts the peripheral neuromuscular system via immune dysregulation and accelerates the progression of amyotrophic lateral sclerosis in SOD-1 mutant mice，揭示了C9orf72缺失通过免疫失调影响外周神经肌肉系统并加速SOD1突变小鼠的肌萎缩侧索硬化症进展。

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种进行性神经退行性疾病，其中神经肌肉系统的完整性对疾病进程至关重要。C9orf72基因突变是ALS最常见的遗传病因也可导致额颞叶痴呆（FTD），但其在外周神经系统（PNS）中的作用尚不清楚。本研究发现，C9orf72在坐骨神经的运动神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞和施万细胞中表达，但不在星形胶质细胞中表达。C9orf72缺失小鼠虽未出现脊髓运动神经元丢失却表现出坐骨神经髓鞘形成不足、轴突分选缺陷及神经肌肉接头（NMJ）去神经支配加重，后者伴随乙酰胆碱受体γ亚基（AChRγ）表达升高。此外，C9orf72缺失引发外周免疫失调，包括CD8⁺ T细胞相关基因上调和施万细胞中MHCI表达增加。当C9orf72缺失与SOD1ᴳ⁹³ᴬ突变共存时，小鼠疾病进展更快、表型更严重，但脊髓运动神经元丢失程度并未加剧，提示C9orf72在外周通过影响髓鞘、轴突稳定性和免疫微环境加速ALS病理，而非直接导致中枢运动神经元死亡。 

图一 C9orf72在神经肌肉系统中的表达与细胞分布

首先将C9⁻/⁻小鼠与同龄野生型（C9⁺/⁺）小鼠在22周龄前进行了体重比较。

结果：

C9⁻/⁻小鼠在18至22周龄期间体重显著高于C9⁺/⁺小鼠。然而，在倒置网格上的前肢和后肢抓握耐力以及转棒实验表现方面未观察到差异，表明不存在功能性神经肌肉缺陷。与既往研究一致，C9⁻/⁻小鼠在22周龄出现脾肿大。使用C9orf72抗体（GTX634482）发现：C9orf72在运动神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞和施万细胞中表达，但不在星形胶质细胞中；在坐骨神经中主要定位于施万细胞，在神经肌肉接头处部分与BTX重叠，提示存在于终末施万细胞。尽管C9⁻/⁻小鼠在mRNA和蛋白水平确认缺失C9orf72，其肌纤维仍显示免疫染色信号。免疫印迹显示，脊髓和坐骨神经中仅见55 kDa条带（敲除后消失），而骨骼肌中存在55 kDa和更丰富的25 kDa两种亚型，提示组织特异性剪接或翻译后修饰。

图二 C9orf72缺失导致骨骼肌去神经支配，但不引起运动神经元丢失

C9orf72缺失不影响腰段脊髓中运动神经元的数量，也不改变星形胶质细胞和小胶质细胞的反应性，然而，与野生型小鼠相比，C9⁻/⁻小鼠的骨骼肌中神经支配的神经肌肉接头（NMJ）数量出现部分但显著的减少，这与胫骨前肌和腓肠肌中乙酰胆碱受体γ亚基（AChRγ）mRNA水平升高一致，该分子是NMJ去神经支配的标志物。鉴于22周龄C9⁻/⁻小鼠在无运动神经元丢失的情况下已出现明显的NMJ去神经支配，作者进一步检测了其坐骨神经的形态学和生化特征，并与野生型对照小鼠进行比较。对成年C9⁻/⁻小鼠坐骨神经半薄切片的分析未发现明显病理改变，包括有髓神经纤维密度、轴突变性或髓鞘损伤（如脱髓鞘或慢性再髓鞘化）。然而，电子显微镜观察显示，与对照组相比，C9⁻/⁻小鼠存在大量髓鞘较薄的神经纤维，提示髓鞘形成不足。G比值分析进一步证实了C9⁻/⁻小鼠存在髓鞘发育不良：其G比值显著高于对照组，表明髓鞘厚度相对不足。

图三 C9orf72缺失损害施万细胞的髓鞘形成并在坐骨神经中诱导非髓鞘型施万细胞活化

接下来，作者通过坐骨神经裂解物的Western blot分析，探究C9⁻/⁻成年小鼠中观察到的髓鞘形成不足是否伴随分子水平的变化。

结果：

与野生型小鼠相比，C9⁻/⁻小鼠坐骨神经中髓鞘碱性蛋白（MBP）和由施万细胞产生的髓鞘相关酶CNPase的蛋白水平显著降低。与此同时，非髓鞘型施万细胞标志物GFAP的表达在C9⁻/⁻小鼠坐骨神经中显著升高。这一结果进一步得到了免疫组织化学的支持：C9⁻/⁻小鼠坐骨神经中GFAP阳性细胞数量明显增多，提示非髓鞘型施万细胞被激活。有趣的是，GFAP在坐骨神经中与GAP-43部分共定位。尽管GAP-43也表达于再生中的轴突，但在此背景下，其表达可能同时反映轴突变化以及施万细胞前体或非髓鞘型施万细胞的存在。因此，虽然将这种共定位视为非髓鞘型施万细胞激活的佐证，但也承认不能排除损伤或重塑引起的轴突GAP-43表达。值得注意的是，轴突标志物NF200的水平未发生变化，表明外周轴突并非主要受损部位。综上所述，这些发现不仅支持了作者此前通过电镜观察到的形态学结果，还从分子层面提供了施万细胞群体发生改变的证据。

图四 C9orf72缺失加剧了SOD1G93A小鼠的神经肌肉功能障碍和神经肌肉接头去神经支配

尽管外周神经系统（PNS）中髓鞘形成过程的改变并未在C9⁻/⁻小鼠中引发运动神经元疾病表型，作者进一步探究了C9orf72缺失是否会影响SOD1G93A小鼠的疾病进展和病理特征。将雄性半合子SOD1G93A小鼠与雌性C9⁻/⁻小鼠杂交，获得SOD1G93A/C9⁻/⁻雌性后代。尽管SOD1G93AC9⁺/⁺与SOD1G93AC9⁻/⁻两组小鼠体重下降程度相似，但SOD1G93AC9⁻/⁻小鼠表现出更早的症状起始和更快的功能衰退，在转棒实验和PaGE测试中均明显劣于SOD1G93AC9⁺/⁺小鼠。

结果：

SMI31免疫染色显示，SOD1ᴳ⁹³ᴬC9⁻/⁻小鼠腰段脊髓腹角中积聚磷酸化神经丝的空泡化运动神经元和营养不良轴突呈增多趋势；Western blot进一步证实磷酸化神经丝/总神经丝比值升高，提示残余运动神经元轴突运输受损。胫骨前肌中，SOD1ᴳ⁹³ᴬC9⁻/⁻小鼠的去神经支配NMJ比例更高，伴随AChR-γ表达进一步上升。坐骨神经中，轴突应激标志物NF200和β-importin水平升高，而髓鞘蛋白MBP和CNPase不变；GFAP上调反而减弱。电镜显示C9缺失加剧了轴突空泡化和线粒体异常，表明C9orf72缺失加重SOD1突变所致的神经肌肉结构损伤。在脊髓中，SOD1ᴳ⁹³ᴬC9⁻/⁻小鼠表现出更强的胶质反应（GFAP、IBA1、CD68升高）及T细胞浸润（CD4⁺/CD8⁺相关转录本增加）。但促炎因子（TNFα、IL-1β、CCL2）未进一步升高，反而抗炎因子IL-10和修复相关基因YM1显著上调，提示免疫微环境向调节/修复表型偏移。

综上所述，本研究揭示C9orf72在外周神经肌肉系统中具有关键保护作用：其缺失虽不直接杀死运动神经元，却通过损害施万细胞、加剧轴突损伤和NMJ去神经支配并改变免疫微环境，显著加速ALS进展。结果强调ALS是多系统疾病，靶向外周和免疫调控或为C9orf72相关ALS提供新治疗策略。