大连医科大学张琳教授团队
于2025年5月22日
在 Acta Pharmaceutica Sinica B（IF=14.6）
发表了一篇名为
《Unveiling the renoprotective mechanisms of self-assembled herbal nanoparticles from Scutellaria barbata and Scleromitrion diffusum in acute kidney injury: A nano-TCM approach》
揭示黄芩和大叶柴胡自组装植物纳米颗粒在急性肾损伤中的肾脏保护机制：一种纳米中药学研究方法
原文链接：
https:///10.1016/j.apsb.2025.05.024
引用格式：
Xia, L., Yang, Q., Fu, K., Yang, Y., Ding, K., Huo, Y., Zhang, L., Li, Y., Zhu, B., Li, P., Huo, Y., Sun, L., Liu, Y., Zhang, H., Liu, T., Shan, W., & Zhang, L. (2025). Unveiling the renoprotective mechanisms of self-assembled herbal nanoparticles from Scutellaria barbata and Scleromitrion diffusum in acute kidney injury: A nano-TCM approach. Acta Pharmaceutica Sinica B.
【研究亮点】：
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自组装草本纳米颗粒（SSNPs）被确定为急性肾损伤（AKI）的核心治疗载体。
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蛋白冠-SSNPs-Nrf2轴揭示肾保护分子机制。
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清除ROS或抑制铁死亡即可逆转AKI表型。
研究背景
急性肾损伤（AKI）是临床常见的高危综合征，以肾功能急剧下降、高死亡率和医疗负担重为特征，其核心病理环节为氧化应激-铁死亡级联反应。
传统中药黄芩-半枝莲（SB-SD）药对虽具抗氧化、抗炎活性，但成分复杂、机制不清，且存在水溶性与生物利用度低、肾靶向效率差等瓶颈，难以满足精准干预需求。尽管抗氧化剂（如Nrf2激动剂）在动物模型中可缓解AKI，但小分子递送效率低、血肾屏障穿透性差，且难以同步调控铁死亡-线粒体自噬多重通路。如何以纳米手段富集SB-SD活性成分、提高肾靶向并系统阻断“ROS-铁死亡-线粒体损伤”轴，是当前AKI治疗的核心挑战。
图形摘要
主要研究结果
1.SSNPs 的自组装机制与理化特性：
采用2∶1的比例提取半枝莲（SB）和白花蛇舌草（SD）。发现二者通过氢键和 π-π 相互作用自组装形成约 82nm 的球形纳米粒。DLS检测显示其水合粒径约 100nm，PDI=0.215，且在 pH2.4 时粒径仅增至 86.6nm，证实 SSNPs 具备良好的分散性与酸稳定性。
另外。还观察了模拟胃液、模拟肠液和血清中的粒径分布，进一步证实了颗粒的稳定性。这些发现表明化学组分在活性组分制备过程中具有潜在的自组装行为，并且颗粒表现出良好的稳定性。
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图 2.SSNP 与蛋白冠的蛋白质组成分析和肾脏靶向。
（A） 示意图，说明了用蛋白冠构建颗粒以改善细胞摄取的体外模拟。
（B） SSNPs-col 和 SSNPs-co-blo 的典型银染色。血液用于 SSNPs-co-blo 对照。
（C） 蛋白质冠组成分析图。
（D） SSNPs 与白蛋白结合的分子对接分析。
（E） TCMK-1 细胞和 （F） RAW264.7 细胞用 FITC 标记的 SSNP、SSNPs-col-blo、SSNPs-hb 和 SSNPs-BSA 处理 2 小时的代表性免疫荧光图像。比例尺：30 μm。
（G）用FITC标记SSNP后，通过免疫荧光和生物发光观察C57BL/6小鼠肠道中纳米颗粒的保留和摄取情况。比例尺：向上，200 μm;向下，50 μm。
（H）不同时间用FITC标记的SSNP处理的C57BL/6小鼠主要器官的代表性生物发光图像。
2.纳米颗粒与生物系统相互作用的机制：
研究通过体外肠黏膜渗透模型与血液孵育实验，结合 SDS-PAGE 与蛋白质组学分析，发现SSNPs表面可吸附白蛋白与血红蛋白形成蛋白冠。分子对接技术证实 SSNPs 糖苷基团与白蛋白 GLN143 等位点形成氢键，流式细胞术显示蛋白冠使巨噬细胞摄取率降低，而肾小管上皮细胞摄取增加。活体荧光成像结合免疫荧光技术，证实 SSNPs 口服后通过蛋白冠介导肾脏靶向蓄积。
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图1.深部组织支配图1.SB-SD在提取分离过程中形成自组装的SSNPs。
（A）SB-SD提取和分离活性成分的流程图，SSNPs形成。
（B）透射电镜（TEM）下SSNPs的形态。
（C）透射电镜（TEM）下SSNPs在中性（pH 7.4）和酸性（pH 2.4）条件下的尺寸分布和酸性条件下的形貌。
（D）SSNPs活性部分中代表性化合物STR和GPA自组装形成SGNPs的示意图。
（E）SGNPs的融合示意图。
（F）SGNPs在水溶液中聚集融合的原位透射电镜（TEM）。比例尺：5 nm。
（G）STR和GPA在0至100 ns范围内自组装的分子动力学模拟。（GPA和STR中的疏水部分显示为绿色，糖基显示为红色）。
（H，I）GPA和STR的3D和2D力结构图（绿色虚线表示疏水相互作用。棕色虚线表示π-π堆叠）。
（J）类黄酮和萜类自组装的示意图。胃反射。
3.SSNP具有效抗炎作用：
在顺铂（DDP）与叶酸诱导的 AKI 小鼠模型中，研究通过血清生化检测（BUN、SCr）、H&E/PAS 染色及免疫组化（KIM-1、NGAL）技术，发现 SSNPs 可改善肾脏病理损伤，减轻肾小管扩张与水肿。TUNEL 染色与流式细胞术显示SSNP能降低肾组织凋亡率，且肝肾功能指标（ALT、AST）检测证实 SSNPs 无明显毒性。通过多组学技术验证其对不同病因 AKI 的保护作用。
此外，我们的研究探索了BMDM的体外极化方面，发现SSNPs增强了M2极化并减少了M1极化。这表明 SSNP 可以扩增抗炎巨噬细胞并减少促炎巨噬细胞，从而产生有效的抗炎作用。
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图7 下肢ST36穴位的高强度EA增强健康受试者和运动障碍样FD患者的胃动力
（A） 健康受试者试验流程。
（B） 健康受试者的同步 （Sync） 胃电图 （EGG） 的 EA 干预和胃动力监测示意图。
（C）在ST36处由EA诱导的健康受试者的代表性窦波形，在假EA组和深部EA组中同步记录。
（D 和 E）ST36 EA 在不同组的健康参与者中诱导的窦振幅 （D） 和频率 （E） 的相对变化。
（F）相对窦振幅变化与C-MASS量化的EA感觉之间的相关性。
（G） FD 患者试点试验流程。
（H） FD 患者 8 次 EA 后消化不良症状（普通话利兹消化不良问卷，M-LDQ）、生活质量（Nepean 消化不良指数，NDI）和胃动力评估示意图。
（I） 假 EA 组和深部 EA 组 8 次 ST36 EA 后 FD 患者的代表性窦波形。
（J 和 K）ST36 EA诱导的FD患者胃窦活动幅度（J）和频率（K）的相对变化，比较假EA组和深部EA组。
（L 和 M）8 次 EA 治疗后 NDI 评分 （L） 和 M-LDQ （M） 评分的变化。
数据显示为（D）、（K）和（L）中的I.Q.R±中位数，（E）、（J）和（M）中的平均数±SEM。
4.SSNPs在体外的强效抗氧化作用：
用不同剂量的DDP和SSNP处理HK-2细胞，以确定抑制和促进细胞生长的最佳浓度。 HK-2 细胞实验中，研究采用 CCK-8 法检测细胞活力，结合免疫荧光与 Western blot 技术，发现 SSNPs 可促进 Nrf2 核转位，上调 HO-1、NQO1 等抗氧化蛋白表达。H2DCFDA 染色结合流式细胞术显示其能减少胞内 ROS 生成，Annexin V-PE/7-AAD 染色证实凋亡率降低，且 Nrf2 抑制剂 ML385 可通过阻断 Nrf2 通路逆转上述效应。
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图 4.SSNP 减轻了 HK-2 细胞中 DDP 诱导的氧化应激。
采用CCK8法测定不同浓度的（A）DDP和（B）SSNPs处理24 h的HK-2细胞增殖情况。
（C）用不同浓度的SSNPs预处理4 h，然后用或不用DDP（20 μmol/L）处理24 h的HK-2细胞增殖，用CCK8法测定。
（D）HK-2细胞中细胞质-/核-Nrf2的免疫印迹和（E）胞质-Nrf2和（F）核-Nrf2的定量分析。
（G）HK-2细胞中总Nrf2、HO-1和NQO1的免疫印迹，以及（H）总Nrf2、（I）HO-1和（J）NQO1的定量分析。
（K）显示 Nrf2 在 HK-2 细胞中表达的代表性荧光图像。比例尺：20 μm。用DDP（20μmol / L），SSNPs（200μg/ mL）处理的HK-2细胞中ROS水平的流式细胞术直方图（L）和定量（M）。用处理过的SSNP（200μg/mL）预处理4小时，然后用DDP（40μmol / L）处理24小时的TCMK-1细胞中具有代表性的流式细胞术斑马图（N）和凋亡细胞的定量（O）。
每个点代表 SEM ±平均值 （n = 3）。∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，∗∗∗P < 0.005，∗∗∗∗P < 0.0001。ns，没有意义。
5.SSNPs保护肾小管上皮细胞免受DDP诱导的铁死亡：
通过铁离子检测试剂盒、C11-BODIPY 染色及流式细胞术，研究发现 SSNPs 可减少肾细胞内 Fe²⁺蓄积与脂质过氧化。Western blot 检测显示其能上调 GPX4、xCT 等铁死亡抑制蛋白，透射电镜观察到 SSNPs 可改善 DDP 诱导的线粒体皱缩和变形，SSNP 治疗改善了线粒体形态，线粒体嵴更清晰。铁死亡抑制剂 Fer-1 阻断实验证实，SSNPs可以减轻DDP诱导的肾小管上皮细胞铁死亡。
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图 5.SSNPs对缓解DDP诱导的铁死亡的影响。
（A）Fe的水平2+在用不同浓度的DDP处理24小时的HK-2细胞中。
（B）Fe2+在HK-2细胞中，用不同浓度的SSNPs预处理4 h，然后用DDP（100 μmol/L）处理24 h。
（C）用不同浓度的SSNPs预处理4 h，然后用DDP（20 μmol/L）处理24 h的HK-2细胞中MDA生成水平和（D）GSH耗竭水平。
（E）Western blotting分析HK-2细胞中GPX4和xCT的蛋白水平。
（F）代表性的荧光图像显示DDP诱导的AKI小鼠肾组织中4-HNE水平。比例尺：20 μm。
（G）代表性荧光图像显示TCMK-1细胞中铁死亡的诱导，预处理SSNP（200μg/mL）4小时或Fer-1（5μmol/L）1小时，然后用DDP（40μmol/L）处理24小时。用C11-BODIPY对细胞进行染色581/591.比例尺：10 μm。
TCMK-1细胞中脂质ROS水平的代表性流式细胞术直方图（H）和定量（I）。
（J）TCMK-1细胞的透射电镜图像。红色箭头（线粒体受损），蓝色箭头（线粒体恢复）。比例尺：向上，1 μm;向下，200 nm。每个点代表 SEM ±平均值 （n = 3）。
∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，∗∗∗P < 0.005，∗∗∗∗P < 0.0001。ns，没有意义。
6.SSNPs在体外和体内减弱线粒体损伤并促进线粒体自噬：
MitoSOX 荧光探针与流式细胞术检测显示SSNPs 可降低线粒体 ROS 水平，JC-10 染色结合流式细胞术证实其能维持线粒体膜电位。通过MitoTracker Green 染色，提示线粒体数量增加，Western blot 检测到 PINK1、Parkin 及 LC3-II 表达上调，透射电镜观察到自噬体包裹受损线粒体，证实 SSNPs 通过 Nrf2 通路调控线粒体自噬。
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图6.SSNP 减轻了 DDP 诱导的线粒体损伤并增强了线粒体自噬作用。
（A、B）使用荧光探针MitoSOX通过流式细胞术检测TCMK-1细胞中线粒体ROS的水平。
（C、D）使用荧光探针 MitoTracker Green 通过流式细胞术测定 TCMK-1 细胞中的线粒体损伤水平。
（E， F） 使用荧光探针 JC-10 通过流式细胞术检测 TCMK-1 细胞中的线粒体膜电位水平。
（G）免疫荧光测定用MitoTracker Green和MitoSOX评估线粒体ROS在受损线粒体中的积累。比例尺：20 μm。
（H，I）Western blotting检测TCMK-1细胞中PINK1、Parkin和LC3蛋白水平。
（J）小鼠肾组织肾小管上皮细胞的透射电镜图像。红色箭头（线粒体受损）、蓝色箭头（线粒体恢复）、绿色箭头（线粒体自噬）。
比例尺：向上，1 μm;向下，400 海里。每个点代表 SEM ±平均值 （n = 3）。∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，∗∗∗P < 0.005，∗∗∗∗P < 0.0001。ns，没有意义。
7.Nrf2 通路为 SSNPs 肾保护的核心机制：
在 Nrf2⁻/⁻小鼠模型中，通过血清生化、肾脏病理染色及 Western blot 技术，发现 SSNPs 对 AKI 的保护作用显著减弱，NQO1、HO-1 及 GPX4 表达降低。细胞实验中 ML385 抑制 Nrf2 核转位，阻断 SSNPs 诱导的抗氧化与铁死亡抑制蛋白表达，结合转录组学分析，确证 Nrf2 通路为 SSNPs 肾保护的核心机制。
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图7.SSNP 通过 Nrf2 途径减弱 DDP 诱导的氧化应激、铁死亡和线粒体损伤。
用或不用Nrf2抑制剂ML385（5 μmol/L）预处理TCMK-1细胞1 h，SSNP（200 μg/mL）预处理4 h，然后用DDP（40 μmol/L）处理24 h（DDP + SSNPs + M：40 μmol/L DDP、200 μg/mL SSNPs和5 μmol/L ML385）。
（A）使用荧光探针MitoSOX通过流式细胞术检测TCMK-1细胞中线粒体ROS的水平。
（B）TCMK-1细胞中的线粒体损伤水平是通过流式细胞术和荧光探针MitoTracker Red测定的。
（C）荧光探针H2DCFDA流式细胞术检测TCMK-1细胞的ROS水平。
（D）荧光探针C11-BODIPY流式细胞术检测TCMK-1细胞的脂质ROS水平581/591.
（E）Western blotting法检测TCMK-1细胞中Nrf2、NQO1、HO-1和GPX4的蛋白水平，并对（F）Nrf2、（G）HO-1、（H）NQO1和（I）GPX4进行定量分析。
（J） 使用不同浓度的 SSNP 对 Nrf2 进行 20 mg/kg DDP 攻击的治疗策略示意图−/−小 鼠。（K）Nrf2肾小管上皮细胞透射电镜图像−/−小鼠肾组织。红色箭头（线粒体受损），绿色箭头（线粒体自噬）。
比例尺：向上，1 μm。（L）Western blotting法检测小鼠肾组织中Nrf2、NQO1、HO-1和GPX4的蛋白水平。每个点代表 SEM ±平均值 （n = 3）。∗P < 0.05，∗∗P < 0.01，∗∗∗P < 0.005，∗∗∗∗P < 0.0001。ns，没有意义。
总结
本研究提出了一种通过形成自组装草药纳米颗粒（SSNPs）在中医（TCM）领域的开创性方法。SSNPs含有类黄酮和萜类化合物，具有优异的水溶性和分散性，是治疗AKI的理想选择。
研究结果揭示了这些纳米颗粒可以通过氢键和π -π相互作用等超分子力实现自组装，从而形成稳定的纳米结构。
本研究不仅阐明了半枝莲和白花蛇舌草的肾脏保护作用及其机制，也为中药和纳米中药的研发提供了新的思路和方法。
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