GPR137 在人 OC 中高表达，促进 OC 细胞增殖
为了研究 GPR137 在 OC 中的作用，作者首先通过比较 GPR137 在 10 对 OC 组织和邻近非肿瘤组织中的表达来确定其临床意义。在获得的 10 对 OC 组织中，GPR137 mRNA 和蛋白质表达水平均显着上调（图 101A-C），可在 GEPIA 数据库中额外验证，显示 OC 样品中 GPR137 表达增加（T，图 1D）。一致地，GPR137 的 mRNA 和蛋白表达在人 OC 细胞系（包括 SK-OV-3、A2780 和 HO8910）中明显高于人正常卵巢上皮 IOSE80 细胞（图 1E，F）。上述数据表明，GPR137 的异常表达与 OC 相关。
GPR137 在人 OC 组织中高表达，促进 OC 细胞恶性肿瘤。使用 OC 患者的癌组织和邻近正常胃上皮组织的石蜡包埋切片对 GPR137进行 IHC 染色。N = 10;棒，20 μm。GPR137 的 B IHC 评分。N = 10。C GPR137 在 OC 组织和邻近正常卵巢上皮组织中的 mRNA 表达。D GEPIA 数据库揭示了 GPR137 在 OC 组织（T）和对照组（N）中的表达。E GPR137 在人正常卵巢上皮 IOSE80 细胞和人 OC 细胞系（包括 SK-OV-3、A2780 和 HO8910）中的 mRNA 表达。F GPR137 在人正常卵巢上皮 IOSE80 细胞和人 OC 细胞系（包括 SK-OV-3、A2780 和 HO8910）中的蛋白表达。G GPR137 在转染 GPR137 shRNA 或扰乱 shRNA （Con） 的 SK-OV-3 细胞中的蛋白表达。用 GPR137 shRNA 转染的 SK-OV-3 细胞的 H CCK-8 测定（shGPR137）或扰乱 shRNA（shCon）并在指定的时间段内培养。I 用 GPR137 shRNA （shGPR137） 或加扰 shRNA （shCon） 转染并培养指定时间段的 A2780 细胞的 CCK-8 测定。 用 GPR137 表达载体 （GPR137） 或对照空载体 （Control） 转染并培养指定时间段的 HO8910 细胞的 J CCK-8 测定。K 在 48 小时转染 GPR137 shRNA 或加扰 shRNA （shRNA-Con） 的 SK-OV-3 细胞的伤口愈合测定。 l （K）中未占用面积的统计分析。 M 用 GPR137 表达载体 （GPR137） 或对照空载体 （对照） 转染 HO8910 细胞的伤口愈合测定，48 小时。 N （M）空置面积统计分析。O 基质胶侵袭测定用 GPR137 shRNA 或扰乱 shRNA （shRNA-Con） 转染的 SK-OV-3 细胞 24 小时。 P （O）的定量分析。Q 用 GPR137 表达载体 （GPR137） 或对照空载体 （对照） 转染 HO8910 细胞的基质胶侵袭测定，24 小时 。R （Q）的定量分析。 S 感染携带 GPR137 shRNA 或扰乱 shRNA （shRNA-Con） 的慢病毒的 SK-OV-3 细胞的集落形成测定。T （S）中相对菌落数量的定量分析。感染携带 GPR137 shRNA 或扰乱 shRNA （shRNA-Con） 的慢病毒感染的 A2780 细胞的 U 集落形成测定。V （U）中相对菌落数的定量分析。W 感染表达 GPR137 的慢病毒或对照慢病毒 （Con） 感染的 HO8910 细胞的集落形成测定。X （W）中相对菌落数的定量分析。Y 转染 GPR137 shRNA 或扰乱 shRNA （shRNA-Con） 的 SK-OV-3 细胞中 MMP-2 和 MMP-9 的蛋白表达。Z 用表达 GPR137 的载体 （GPR137） 或对照空载体 （Con） 转染的 HO8910 细胞中 MMP-2 和 MMP-9 的蛋白表达。*p < 0.05;**p < 0.01;误差线，标清
鉴于 GPR137 在 SK-OV-3 和 A2780 OC 细胞中的蛋白质表达相对较高（图1F），作者利用这两种细胞系进行进一步的功能丧失实验，同时在 HO8910 细胞中进行功能获得实验，以研究 GPR137 在 OC 中的生物学功能。通过转染 GPR137-shRNA 敲低 GPR137，使 GPR137 蛋白表达降低近 60%（图 1G）显着抑制 SK-OV-3 和 A2780 OC 细胞增殖（图 1 H，I），抑制 SK-OV-3 细胞迁移和侵袭（图 1K，L，O，P），抑制 SK-OV-3 和 A2780 细胞的集落形成能力（图 1S-V），伴随着 MMP-2 和 MMP-9 的蛋白表达下调（图 1Y），这是与 OC 细胞迁移（迁移和侵袭）和 OC 转移相关的两个关键分子[29， 30]. 相比之下，过表达 GPR137 显著促进 HO8910 OC 细胞增殖（图 1J），增强迁移和侵袭能力（图 1M，N，Q，R），增强集落形成能力（图 1W，X），并增加 MMP-2 和 MMP-9 蛋白表达（图 1Z）。综上所述，这些结果表明 GPR137 在 OC 中起肿瘤刺激作用。
RAB8A 与 GPR137 在人 OC 中的表达呈正相关
作为 Ras 超家族的成员，RAB8 在细胞内膜运输中充当关键调节因子。先前的研究表明，RAB8 在癌细胞迁移、极化和信号转导中起着重要作用[31]。RAB8A 是 RAB8 的一个主要亚型，据报道参与宫颈癌和子宫内膜癌等女性生殖癌发生[32,33]，表明其作为潜在的妇科肿瘤生物标志物的作用。与 GPR137 的表达模式类似，与对照正常卵巢上皮组织相比，10 对 OC 组织样本中 RAB8A 表达显著上调，通过 IHC 染色和 mRNA 水平检查确定（图 2A-C），与 GEPIA 数据库的数据一致（图 2D）。正如预期的那样，RAB8A 的 mRNA 和蛋白表达在所有三种人 OC 细胞系中明显高于人正常卵巢上皮细胞（图 2E，F），表明 RAB8A 的异常上调表达可能与 OC 进展相关。
RAB8A 在人 OC 组织中高表达，促进 OC 细胞恶性肿瘤。使用 OC 患者的癌组织和邻近正常胃上皮组织的石蜡包埋切片对 RAB8A进行 IHC 染色。 棒，20 μm。RAB8A 的 B IHC 评分。N = 10。C OC 组织和邻近正常卵巢上皮组织中 RAB8A 的 mRNA 表达。D GEPIA 数据库揭示了 RAB8A 在 OC 组织（T）和对照组（N）中的表达。E RAB8A 在人正常卵巢上皮 IOSE80 细胞和人 OC 细胞系（包括 SK-OV-3，A2780 和 HO8910）中的 mRNA 表达。F RAB8A 在人正常卵巢上皮 IOSE80 细胞和人 OC 细胞系（包括 SK-OV-3、A2780 和 HO8910）中的蛋白表达。G RAB8A shRNA 或加扰 shRNA （Con） 转染的 SK-OV-3 细胞中 RAB8A 的蛋白表达。用 RAB8A shRNA 转染的 SK-OV-3 细胞（shRAB8A）或扰乱 shRNA（shCon）并培养指定时间段的 H CCK-8 测定。I 转染 RAB8A shRNA （shRAB8A）或扰乱 shRNA （shCon）的 A2780 细胞的 CCK-8 测定，并在指定的时间段内培养。 用表达 RAB8A 的载体（RAB8A）或对照空载体（对照）转染的 HO8910 细胞的 J CCK-8 测定，并在指定的时间段内培养。K 在 48 小时转染 RAB8A shRNA 或扰乱 shRNA （shRNA-Con） 的 SK-OV-3 细胞的伤口愈合测定。 l （K）中未占用面积的统计分析。 M 用表达 RAB8A 的载体（RAB8A）或对照空载体（对照）转染的 HO8910 细胞在 48 小时的伤口愈合测定。 N （M）空置面积统计分析。O 基质胶侵袭测定转染 RAB8A shRNA 或扰乱 shRNA （shRNA-Con）的 SK-OV-3 细胞 24 小时。 P （O）的定量分析。Q 用表达 RAB8A 的载体 （RAB8A） 或对照空载体 （Control） 转染的 HO8910 细胞的基质胶侵袭测定，在 24 小时 Bar，100 μm。R （Q）的定量分析。S 感染携带 RAB8A shRNA 或扰乱 shRNA （shRNA-Con） 的慢病毒感染的 SK-OV-3 细胞的集落形成测定。T （S）中相对菌落数量的定量分析。感染携带 RAB8A shRNA 或扰乱 shRNA 的慢病毒（shRNA-Con）的 A2780 细胞的 U 集落形成测定。V （U）中相对菌落数的定量分析。W 感染表达 RAB8A 的慢病毒或对照慢病毒 （Con） 感染的 HO8910 细胞的集落形成测定。X （W）中相对菌落数的定量分析。Y 用 RAB8A shRNA 或扰乱 shRNA （shRNA-Con） 转染的 SK-OV-3 细胞中 MMP-2 和 MMP-9 的蛋白表达。Z GEPIA 数据库显示 GPR137 与 RAB8A 之间的相关性。*p < 0.05;**p < 0.01;误差线，标清
给定三种不同 OC 细胞系中内源性 RAB8A 的 mRNA 和蛋白质量（图。 阿拉伯数字 E，F），随后作者通过沉默 SK-OV-3 和 A2780 细胞中的 RAB8A，同时在 HO8910 细胞中过表达 RAB8A，进行了 RAB8A 的生物学功能实验。RAB8A-shRNA 抑制 RAB8A 表达显著降低 SK-OV-3 和 A2780 OC 细胞增殖（图 2G-I），抑制 SK-OV-3 细胞的迁移和侵袭（图 2K，L，O，P），SK-OV-3 和 A2780 细胞的集落数量减少（图 2S-V），降低 MMP-2 和 MMP-9 的蛋白表达（图 2Y）。相反，RAB8A 的过表达显着诱导 HO8910 细胞增殖（图 2J），促进迁移和侵袭能力（图 2M，N，Q，R），并增加集落数量（图 2W，X）。综上所述，上述结果表明 RAB8A 在 OC 中起着重要作用。鉴于 RAB8A 和 GPR137 对 OC 细胞生物学功能的影响相似，作者因此询问了这两种蛋白质在 OC 组织中是否存在相关性。事实上，作者使用 GEPIA 数据库发现 GPR137 和 RAB8A 的表达之间存在正相关关系（图 2Z），并通过对采集的临床 OC 组织中 GPR137 和 RAB8A 的 IHC 染色进行评分和分析来验证这一点（图 3A），强化了 GPR137 和 RAB8A 参与 OC 进展的观点。
GPR137 增强RAB8A mRNA 稳定性。OC 组织中 GPR137 和 RAB8A 的 IHC 评分。B 转染 GPR137 shRNA 或扰乱 shRNA 的 SK-OV-3 细胞中 RAB8A 的蛋白表达（Con）。C 用 GPR137 shRNA 或扰乱 shRNA （Con） 转染的 A2780 细胞中 RAB8A 的蛋白表达。D SK-OV-3 细胞中内源性 GPR137 和 RAB8A 的免疫共沉淀。IP：RAB8A;白平衡：探地雷达 137。IgG 用作阴性对照。E 从 SK-OV-3 细胞分离的膜组分中内源性 GPR137 和 RAB8A 的免疫共沉淀。IP：RAB8A;白平衡：探地雷达 137。IgG 作为膜蛋白的阴性对照，EZRIN 作为上样对照。F A2780 细胞中内源性 GPR137 和 RAB8A 的免疫共沉淀。IP：RAB8A;白平衡：探地雷达 137。IgG 用作阴性对照。G 从 A2780 细胞分离的膜组分中内源性 GPR137 和 RAB8A 的共免疫沉淀。IP：RAB8A;白平衡：探地雷达 137。IgG 作为膜蛋白的阴性对照，EZRIN 作为上样对照。H SK-OV-3 细胞中内源性 GPR137 和 RAB8A 的免疫共沉淀。IP：GPR137;WB：RAB8A。IgG 用作阴性对照。I 用 GPR137 shRNA 或扰乱 shRNA （shRNA-Con） 转染的 SK-OV-3 和 A2780 细胞中 RAB8A 的 mRNA 表达。J 用 GPR137 shRNA 或扰乱 shRNA （shRNA-Con） 转染的 SK-OV-3 和 A2780 细胞中的 RAB8A 启动子荧光素酶 （RAB8A-Luc）活性。K 用 GPR137 shRNA （shGPR137） 或加扰 shRNA （shCon） 转染并用放线菌素 D （AcD） 培养的 SK-OV-3 细胞中 RAB8A 的 mRNA 水平指定时间段。 L 转染 GPR137 shRNA（shGPR137）或扰乱 shRNA（shCon）并用放线菌素 D（AcD）培养的 A2780 细胞中 RAB8A 的 mRNA 水平。在 SK-OV-3 细胞的 RIP 测定中，GPR137 抗体对共沉淀的 RAB8A mRNA 进行 M qRT-PCR 分析。IgG 用作阴性对照。还确定了蛋白质负载（输入）。*p < 0.05;**p < 0.01;误差线，标清
GPR137 通过促进 RAB8A mRNA 稳定性来增加 RAB8A 的表达
鉴于 OC 中相似的蛋白质表达模式（图。3、A），作者假设 RAB8A 和 GPR137 之间可能存在调节。正如预期的那样，敲低 GPR137 抑制了 SK-OV-3 和 A2780 细胞中 RAB8A 蛋白的表达（图 3B，C），尽管 SK-OV-3 细胞中的 RAB8A-shRNA 或 HO8910 细胞中 RAB8A 表达载体对 GPR137 表达的改变没有显示出明显的影响（图 S1A，B）。而 GPR137 和 RAB8A 分布在细胞质和细胞膜中[34,35]。GPR137 未能在细胞质或分离的 OC 细胞膜中与 RAB8A 相互作用，这是通过膜-细胞质分离测定和相互 co-IP 测定确定的（图 3D-H）。有趣的是，GPR137 的沉默导致 RAB8A mRNA 的显着减少（图 3I），而出乎意料的是，RAB8A 启动子-荧光素酶报告基因测定（RAB8A-Luc）没有显着变化（图 3J），表明 GPR137 不参与调节 RAB8A 转录。
为了深入了解 GPR137 调节RAB8A mRNA 水平的机制，作者接下来进行了 RNA 稳定性测定，并使用放线菌素 D （AcD） 检查了 GPR137 对 RAB8A mRNA 的影响。结果，在 AcD 处理 4 h 和 8 h 后，表达 GPR137-shRNA（shGPR137）的 SK-OV-3 和 A2780 细胞中观察到 RAB8A mRNA 显着减少（图 3K，L），分别减少近 55%（SK-OV-3,8 h）和 75%（A2780,8 h），尽管内源性 RAB8A 转录本与 GPR137 蛋白无关（图 3 总之，这些数据表明 GPR137 通过增加 RAB8A mRNA 稳定性来提高 RAB8A 表达。
将 HH 信号传导鉴定为 GPR137-RAB8A 轴的下游
接下来，作者渴望阐明 RAB8A 在 OC 中功能背后的分子机制。为此，使用用表达 RAB8A 的载体（Flag-RAB8A）或对照空载体转染的 HO8910 细胞进行 RNA 测序（RNA-Seq）测定，并通过蛋白质印迹确定转染效率（图。4、总共有 1161 个 log2（倍数变化）> 1 或< -1 的转录本发生显著变化 RAB8A-overexpression，其中分别上调 651 个和下调 510 个（图 4B，C），表明 RAB8A 表达的变异显著改变了转录组。GO 和 KEGG 分析的生物信息学结果表明，RAB8A 的外源表达对细胞生物学和环境加工中的许多重要过程产生影响，如细胞生长和细胞运动、信号转导、信号分子和相互作用，以及癌症等人类疾病（图 4D，E）。一致地，对 KEGG 前 20 条通路的富集分析也表明，RAB8A 与癌症中的多个通路相关，包括 Hedgehog（HH）信号通路（图 4E），基于该通路，并结合显示 HH 信号传导靶点 GLI1 表达显着增加的热图数据（图 S2A），作者最终选择了 HH 信号传导作为潜在候选者。
鉴定 HH 信号传导作为 RAB8A 的下游。A Western blot 法检测 Flag 标记 RAB8A（Flag-RAB8A，+）或空载体（Flag-RAB8A，-）转染 24 h 的 RAB8A 细胞中外源 RAB8A（Flag）蛋白水平。B 表中总结了表达改变Flag-RAB8A-expression的基因数量。C （B）中基因的火山散点图。D GO 分析比较 RAB8A 组与对照组的基因表达。E KEGG 通路富集分析，比较 RAB8A 组与对照组的基因表达量。F 用 RAB8A （Flag-RAB8A， +） 或空载体 （Flag-RAB8A， -） 转染的 HO8910 细胞中 GLI1 和 PTCH1 的蛋白表达。用 RAB8A 或空载体（Con）转染的 HO8910 细胞中的 G GLI 荧光素酶（GLI-Luc）活性。H 裸鼠，具有源自 HO8910 细胞的异种移植物，稳定表达 RAB8A 或对照病毒。I 图像显示了来自两组的代表性肿瘤异种移植物的大小。J 源自 HO8910 细胞的异种移植物在接种后 21 天稳定表达 RAB8A 或对照病毒的重量。K 稳定表达 RAB8A 或对照病毒的 HO8910 细胞肿瘤中 GLI1 和 RAB8A 的蛋白水平。L 转染 RAB8A shRNA（shRAB8A，+）或扰乱 shRNA（shRAB8A，-）的 SK-OV-3 细胞中 PTCH1、GLI1、GLI2、GLI3 全长（GLI3F）、GLI3 阻遏物（GLI3R）、IFT88、KIF3A 和 SuFu 蛋白表达。M 用 RAB8A shRNA （shRAB8A， +） 或加扰 shRNA （shRAB8A， -） 转染的 A2780 细胞中 GLI1 和 PTCH1 的蛋白表达。 用 RAB8A shRNA （shRNA RAB8A） 或加扰 shRNA （shRNA Con） 转染的 SK-OV-3 细胞中的 N GLI 荧光素酶 （GLI-Luc） 活性。O 转染 RAB8A shRNA （shRNA RAB8A） 或加扰 shRNA （shRNA Con） 的 A2780 细胞中的 GLI 荧光素酶 （GLI-Luc） 活性。P 转染 RAB8A shRNA（shRNA-RAB8A）或扰乱 shRNA（shRNA-Con）的 SK-OV-3 细胞中 GLI1 和 PTCH1 的 mRNA 水平。Q 转染 RAB8A shRNA（shRNA-RAB8A）或扰乱 shRNA（shRNA-Con）的 A2780 细胞中 GLI1 和 PTCH1 的 mRNA 水平。R SK-OV-3 细胞中 RAB8A shRNA （shRAB8A）存在下内源性 SuFu 和 GLI1 的免疫共沉淀。IP：SuFu;WB：GLI1。IgG 用作阴性对照。HO8910 细胞中异位 Flag-RAB8A 存在下内源性 SuFu 和 GLI1 的 S 共免疫沉淀。IP：SuFu;WB：GLI1。IgG 用作阴性对照。在转染 Flag-RAB8A 或空载体（Flag-RAB8A，-）的 HO8910 细胞中进行 T 核质-细胞质分离测定，并通过蛋白质印迹检测 GLI1 的蛋白水平。U GEPIA 数据库显示了 RAB8A 与 PTCH1 的相关性。*p < 0.05;**p < 0.01;误差线，标清
正如预期的那样，RAB8A 的过表达显着诱导了 HH 信号活性，包括 HH 靶标 GLI1 和 PTCH1 的蛋白表达上调以及 GLI-Luc 活性（图。4、F，G）。一致地，与感染对照病毒的 HO8910 细胞相比，RAB8A-overexpressing 慢病毒感染的 HO8910 细胞导致裸鼠异种移植物的肿瘤重量和肿瘤体积显着增加（图 4H-J），并且在异位表达 RAB8A 的相应肿瘤组织中显着诱导 GLI1 的蛋白表达（图 4 相反，抑制 RAB8A 使 SK-OV-3 和 A2780 细胞中的 HH 活性失活，显示 GLI1 和 PTCH1 的 mRNA 和蛋白表达降低，GLI-Luc 活性降低（图 4 L-Q）。鉴于 RAB8A 的敲低也会影响 HH 通路中关键成分的表达模式，如 GLI2、GLI3F/R、KIF3A 和 IFT88[18]（图 4L），作者假设 RAB8A 可能通过 SuFu 介导 HH 失活，SuFu 是 HH 通路中的主要阻遏因子，可以束缚 GLI1，从而阻碍 GLI1 核易位[17]。事实上，在 SK-OV-3 细胞中沉默 RAB8A 有效地增加了 SuFu 与 GLI1 的结合（图 4R），而 RAB8A 的过表达明显诱导 SuFu 与 GLI1 的结合解离（图 4S），导致 GLI1 从细胞质易位到细胞核（图 4T）。此外，在 GEPIA 数据库中发现 RAB8A 的表达与 HH 靶标 PTCH1 之间存在正相关关系（图。 4U）、还提供了 RAB8A 通过激活 HH 信号传导促进 OC 进展的证据。
GPR137-RAB8A 通过激活 HH 信号传导促进 OC 进展
特异性 GLI1 拮抗剂 GANT61[36]抑制 HH 信号传导可显著降低 OC 细胞增殖（图 5A，B），特别是在 24 h 和 48 h 时，GLI1 表达的上调始终与 OC 患者较低的无病生存期（DFS）显著相关（图 5 C），表明 HH 信号的异常激活与 OC 的不良预后密切相关。与 RAB8A 类似， 敲低 SK-OV-3 和 A2780 细胞中 GPR137 显著降低 GLI-Luc 活性（图 5D，E）并抑制 GLI1 和 PTCH1 的蛋白表达（图 5F，G），而 RAB8A 的过表达增加了 HO8910 细胞中 GLI1 和 PTCH1 的蛋白表达（图 S3A）。GEPIA 数据库一致显示，GPR137 的表达与 HH 靶标 PTCH1 的表达呈正相关（图 5H），表明 GPR137 对 HH 信号转导的积极作用。
GPR137-RAB8A 通过 HH 信号传导促进 OC 进展。用 GANT61 或载体处理并培养指定时间段的 SK-OV-3 细胞的 CCK-8 测定。用 GANT61 或载体处理的 A2780 细胞的 B CCK-8 测定，并在指定的时间段内培养。C Kaplan-Meier 对 GLI1 表达改变的 OC 患者无病生存期的分析。转染 GPR137 shRNA （shRNA GPR137） 或扰乱 shRNA （shRNA Con） 的 SK-OV-3 细胞中的 D GLI 荧光素酶 （GLI-Luc） 活性。E GLI 荧光素酶 （GLI-Luc） 活性在转染 GPR137 shRNA （shRNA GPR137） 或扰乱 shRNA （shRNA Con） 的 A2780 细胞中。F 转染 GPR137 shRNA（shGPR137，+）或扰乱 shRNA（shGPR137，-）的 SK-OV-3 细胞中 GLI1 和 PTCH1 的蛋白表达。G 转染 GPR137 shRNA （shGPR137， +） 或加扰 shRNA （shGPR137， -） 的 A2780 细胞中 GLI1 和 PTCH1 的蛋白表达。H GEPIA 数据库显示 GPR137 与 PTCH1 的相关性。I 转染 GPR137 shRNA （shRNA-GPR137） 或扰乱 shRNA （shRNA-Con） 联合表达 RAB8A 载体 （RAB8A） 的 SK-OV-3 细胞中 GLI1 和 PTCH1 的 mRNA 水平。J 转染 GPR137 shRNA（shRNA-GPR137）或扰乱 shRNA（shRNA-Con）联合表达 RAB8A 载体（RAB8A）的 A2780 细胞中 GLI1 和 PTCH1 的 mRNA 水平。K 用 GPR137 shRNA（shGPR137，+）或扰乱的 shRNA（shGPR137，-）与表达 RAB8A 的载体（RAB8A，—或 +）联合转染的 SK-OV-3 细胞中 GLI1 的蛋白水平。 转染 GPR137 shRNA（shGPR137，+）或扰乱 shRNA（shGPR137，-）与表达 RAB8A 的载体（RAB8A，—或 +）联合转染的 SK-OV-3 细胞中的 L GLI 荧光素酶 （GLI-Luc） 活性。转染 GPR137 shRNA（shGPR137，+）或扰乱 shRNA（shGPR137，-）与表达 RAB8A 的载体（RAB8A，—或 +）联合转染的 A2780 细胞中的 M GLI 荧光素酶 （GLI-Luc） 活性。N 用 GPR137 shRNA（shGPR137）或加扰 shRNA（对照）与表达 RAB8A 的载体（RAB8A，—或 +）联合转染的 SK-OV-3 细胞的伤口愈合测定，48 小时。 O （N）中未占用面积的统计分析。
用 GPR137 shRNA（shGPR137）或扰乱 shRNA（shCon）转染与 RAB8A 表达载体（RAB8A，—或+）联合转染并培养指定时间段的 SK-OV-3 细胞的 P CCK-8 测定。Q 用 GPR137 shRNA（shGPR137）或扰乱 shRNA（shCon）与表达 RAB8A 的载体（RAB8A 或 +）联合转染的 A2780 细胞的 CCK-8 测定，并在指定的时间段内培养。用 GPR137 shRNA（shGPR137）或扰乱的 shRNA（对照）与 RAB8A 表达载体（RAB8A，—或+）联合转染的 SK-OV-3（上）和 A2780（下）细胞的 R 基质胶侵袭测定 24 小时。 S 定量分析（R，上：SK-OV-3）。T 定量分析（R，下：A2780）。携带 GPR137 shRNA 或扰乱 shRNA （shRNA-Con） 的慢病毒感染的 SK-OV-3 细胞与表达 RAB8A 的慢病毒或对照慢病毒（RAB8A，—或 +）联合感染的 SK-OV-3 细胞的 U 集落形成测定。 V 感染携带 GPR137 shRNA 或扰乱 shRNA （shRNA-Con） 的慢病毒与表达 RAB8A 的慢病毒或对照慢病毒（RAB8A，—或 +）联合感染的 A2780 细胞的集落形成测定。W （U）中相对菌落数量的定量分析。X （V）中相对菌落数量的定量分析。用 GPR137 shRNA （shGPR137） 或加扰 shRNA （shCon） 转染 SAG 处理或载体并培养指定时间段的 SK-OV-3 细胞的 Y CCK-8 测定。用 GPR137 shRNA（shGPR137）或加扰 shRNA（shCon）与 SAG 处理或载体相结合转染的 A2780 细胞的 Z CCK-8 测定，并在指定时间段内培养。*， #p < 0.05;**， ##p < 0.01;误差线，标清
为了探索 GPR137 是否通过 RAB8A 调节 HH 信号传导，作者接下来通过抑制 GPR137 表达并同时上调 OC 细胞中 RAB8A 表达进行了实验。RAB8A 的过表达有效地恢复了 GPR137 沉默衍生的对 GLI1 和 PTCH1 表达的负面影响（图。5、I-K），SK-OV-3 和 A2780 OC 细胞中的 GLI-Luc 活性（图 5L，M），以及 SK-OV-3 细胞迁移能力（图 5N，O），SK-OV-3 和 A2780 OC 细胞中的增殖，侵袭和集落数量（图 5 P-X）。同样，SAG（一种针对受体平滑化（SMO）的特异性激动剂[17]激活 HH 信号传导，显著减弱了 SK-OV-3 和 A2780 OC 细胞中 GPR137 shRNA 抑制的增殖、侵袭和集落形成能力（图 5Y，Z，图 S4A-G）。
始终如一地，GDC-0449 的施用几乎完全减少了 GPR137 触发的增殖，侵袭和 HO89010 细胞中的集落形成（图 S4H-L）。同样，沉默 RAB8A 不仅有效恢复了 GPR137 诱导的 HH 活性，包括 GLI-Luc 活性增加和GLI1 和 PTCH1 的 RNA 表达上调（图 S4M，N），而且明显削弱了 GPR137 过表达促进的增殖、侵袭和集落形成在 HO89010 细胞中（图 S4O-S），表明 GPR137-RAB8A 信号通过激活 HH 信号传导参与 OC 传播。
为了研究 HH 对 GPR137 和/或 RAB8A 的可能调控，作者接下来用人 N-SHH 重组蛋白（N-SHH-rp）或 HH 信号拮抗剂 GDC-0449 处理 OC 细胞[17]，并检测 GPR137 和 RAB8A 的表达。虽然 N-SHH-rp 给药诱导 GLI1 蛋白表达，但 GDC-0449 显着失活 HH 信号传导，SK-OV-3 和 A2780 OC 细胞中的 GLI-Luc 活性降低，但 N-SHH-rp 和 GDC-0449 都没有意外地影响 GPR137 和 RAB8A 的 RNA 表达或蛋白表达（图 6 A-D）。然而，通过膜-细胞质分离测定和 IF 染色在 SK-OV-3 细胞和 A2780 细胞中确定，N-SHH-rp 显着增加了 GPR137 和 RAB8A 蛋白的膜分布（图 6E-H），表明 HH 激活正向改变了 GPR137 和 RAB8A 的活性，这形成了 GPR137-RAB8A-HH 轴调控在 OC 致癌中的正反馈回路。
HH 信号传导激活 GPR137 和 RAB8A。A 用人 SHH 重组蛋白（N-SHH-rp）的 N 末端处理并培养 24 小时的 SK-OV-3 和 A2780 细胞中 GPR137 的 mRNA 水平。 用 GDC-0449 或载体处理并培养 24 小时的 SK-OV-3 和 A2780 细胞中 GLI 荧光素酶（GLI-Luc）活性。C 用 GDC-0449 或载体处理并培养 24 小时的 SK-OV-3 和 A2780 细胞中 GPR137 的 mRNA 水平。 用 N-SHH-rp（N-SHH-rp，+）或载体（N-SHH-rp，-）处理并培养 24 h 的 SK-OV-3 细胞中 GLI1、GPR137 和 RAB8A 的蛋白水平。E 用 N-SHH-rp（N-SHH-rp，+）或载体（N-SHH-rp，-）处理并培养 24 h 的 SK-OV-3 细胞分离的膜部分中 GPR137 和 RAB8A 的蛋白水平，使用 EZRIN 作为膜蛋白的上样对照。F 通过密度测定法和分别对 （E） 中的 GPR137 和 RAB8A 条带进行定量。G 用 N-SHH-rp 或载体处理并培养 24 小时的 SK-OV-3 细胞中 GPR137 衍生信号的免疫荧光染色。细胞核用 DAPI 染色。棒材，5 μm。H 用 N-SHH-rp（N-SHH-rp，+）或载体（N-SHH-rp，-）处理并培养 24 h 的 A2780 细胞分离的膜组分中 GPR137 和 RAB8A 的蛋白水平，以 EZRIN 作为膜蛋白的上样对照。 误差线，SD
GPR137-RAB8A 的抑制通过停用 HH 信号传导阻碍体内 OC 进展
为了最终测试 GPR137-RAB8A 信号轴在体内 OC 进展中的致癌作用，作者建立了 SK-OV-3 细胞系和 A2780 细胞系，分别通过感染携带靶向 GPR137 或 RAB8A 的 shRNA 序列的左旋病毒，稳定表达 GPR137-shRNA 和 RAB8A-shRNA。与携带扰乱 shRNA 序列的相应对照 SK-OV-3 细胞和 A2780 细胞相比，GPR137-shRNA 慢病毒感染的 SK-OV-3 细胞导致裸鼠的异种移植物肿瘤重量和肿瘤体积显着降低（图 7A、B、D、H），而 RAB8A 低表达的 A2780 细胞在原位浆液性卵巢癌小鼠模型中始终显示卵巢肿瘤重量降低（图 7E，F，I）。此外，与相应的对照相比，该GPR137-suppression组和 RAB8A 敲低组的小鼠体重均较低（图 7C，G）。另一方面，与对照肿瘤相比，沉默 RAB8A 导致肿瘤细胞增殖显着减少，但凋亡 OC 细胞率显着升高（图 7J-M）。此外，RAB8A-shRNA-expressing 肿瘤组还表现出 GLI1 和 PTCH1 染色减弱（图 7N）以及 GLI1 和 PTCH1 蛋白表达下调（图 7O），这与 HO8910 衍生肿瘤细胞中异种移植物生长和 GLI1 表达RAB8A-ovexpression的积极作用形成鲜明对比（图 4 H-K）。综上所述，这些数据表明，GPR137-RAB8A 轴通过 HH 在体内 OC 进展中起着重要而积极的作用。
GPR137-RAB8A 的抑制阻碍体内 OC 进展。一种裸鼠 ，其异种移植物来源于稳定表达 GPR137-shRNA（shRNA-GPR137）或对照病毒（shRNA-Control）的 SK-OV-3 细胞。N = 6。B 显示两组肿瘤异种移植物大小的图像。C 在肿瘤细胞感染后第 3、6、9、12、15 和 18 天检查（A）中小鼠的体重。D 在肿瘤细胞感染后第 3、6、9、12、15 和 18 天测量 （A）中的肿瘤体积。E 来自 A2780 细胞的原位卵巢肿瘤的裸鼠稳定表达 RAB8A-shRNA （shRNA-RAB8A） 或对照病毒 （shRNA-Control）。N = 6。F 图像显示两组肿瘤的大小。G 在肿瘤细胞感染后第 4、8、12、16、20、24 和 28 天检查（E）中小鼠的体重。H 接种后第 18 天稳定表达 GPR137-shRNA （shRNA-GPR137） 或对照病毒 （shRNA-Control） 的 SK-OV-3 细胞来源的异种移植物的重量。I 接种后第 28 天稳定表达 RAB8A-shRNA （shRNA-RAB8A） 或对照病毒 （shRNA-Control） 的 A2780 细胞来源的卵巢肿瘤的重量。J Ki67 染色源自稳定表达 RAB8A-shRNA （shRNA-RAB8A） 或对照病毒 （shRNA-Control） 的 A2780 细胞，在接种后第 28 天进行染色。棒材，100 μm。K Ki67 指数（%）的统计分析（J）。L 膜联蛋白 V-mCherry 染色源自稳定表达 RAB8A-shRNA 的 A2780 细胞（shRNA-RAB8A）或对照病毒（shRNA-Control）的肿瘤组织，在接种后第 28 天。细胞核用 DAPI 染色。棒材，100 μm。 M 膜联蛋白 V-mCherry 阳性细胞的统计分析 （%），来自 （L）。N 稳定表达 RAB8A-shRNA 或对照病毒（shRNA-Control）的 A2780 细胞形成的原位卵巢肿瘤中 GLI1 和 PTCH1 的 IHC 染色。棒材，100 μm。O 稳定表达 RAB8A-shRNA（shRAB8A，+）或对照病毒（shRAB8A，-）的 A2780 细胞形成的原位卵巢肿瘤组织中 GLI1、PTCH1 和 RAB8A 的蛋白水平。棒材，100 μm.** p < 0.01;误差线，标清。
总结
综上所述，本研究证实了 GPR137-RAB8A 轴在 OC 细胞 HH 信号转导中的关键作用，GPR137-RAB8A-HH 通路可能为 OC 提供治疗靶点。
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