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3.1. 筛选卵巢癌顺铂耐药/敏感血清中的 ANXA114‐26
最初，作者采用 iTRAQ 技术筛选了卵巢癌顺铂耐药/敏感患者血清中小分子肽的差异表达，结果显示共鉴定出 41 种差异表达的小分子肽（倍数变化>2，p < 0.05）。
作者假设通过增加在小分子肽中下调的、在化疗耐药患者血清中下调的小分子肽浓度，可以逆转化疗耐药性。在搜索数据库和相关文献后，作者注意到一个由 ANXA1 的 14-26 位氨基酸衍生的短肽序列 IENEEQEYVQTVK，因此将其命名为 ANXA114-26。尽管 ANXA1 作为前体蛋白在肿瘤中的作用已被广泛报道，但据作者所知，小分子肽 ANXA114-26 尚未被报道过。
3.2. ANXA114-26 抑制卵巢癌细胞增殖并减少耐药蛋白表达
为确定 ANXA1 的表达与卵巢癌化疗耐药性之间的关系，作者检测了 SKOV3 和 SKOV3/DDP 细胞系中 ANXA1 表达的差异，PCR 和 Western blotting 结果均显示 SKOV3/DDP 细胞中 ANXA1 的表达增加（图 1A–B ）。结果表明，ANXA1 的表达水平与卵巢癌细胞化疗耐药性密切相关，在亲本细胞中表达低，在耐药细胞中表达高。作者推测 ANXA114‐26 和 ANXA1 可能竞争性结合同一配体 FPR，当 ANXA114‐26 结合 FPR 配体时，ANXA1 无法结合 FPR。因此，ANXA1 介导的卵巢癌细胞顺铂耐药性被逆转。
ANXA114‐26 抑制卵巢癌细胞增殖并减少耐药蛋白表达。(A)SKOV3 和 SKOV3/DDP 细胞系中 ANXA1 mRNA 表达的差异。(B)SKOV3 和 SKOV3/DDP 细胞系中 ANXA1 蛋白表达的差异。(C)SKOV3 细胞系中细胞活力的变化。(D)SKOV3/DDP 细胞系中细胞活力的变化。(E)通过 EdU 检测 SKOV3 细胞系的细胞增殖率。(F)通过 EdU 检测 SKOV3/DDP 细胞系的细胞增殖率。(G)BAX mRNA 的相对表达。(H)Bcl‐2 mRNA 的相对表达。(I)BAX 和 Bcl‐2 的蛋白表达水平。(J)MRP1 mRNA 的相对表达。(K)MRP1 的蛋白表达水平。数据表示为均值±标准差。数据在三次独立重复实验中验证，*p < 0.05，**p < 0.01。
为探索 ANXA114‐26 对卵巢癌细胞增殖活性的影响。作者用不同浓度的 ANXA114‐26 分别孵育卵巢癌细胞亲本细胞系 SKOV3 和耐药细胞系 SKOV3/DDP。分别于 24、48 和 72 小时后，通过 CCK‐8 试验评估细胞活力。结果表明，孵育 24 小时后，500 μg/mL ANXA114‐26 组的细胞增殖显著低于对照组；孵育 48 和 72 小时后，与对照组相比，10 μg/mL、100 μg/mL 和 500 μg/mL ANXA114‐26 组的细胞增殖显著降低，且细胞增殖的降低程度随孵育浓度和时间的增加而逐渐增强。（图 1C–D ）。考虑到顺铂的毒性和作用，后续实验采用 10 μg/mL 和 80 μg/mL ANXA114‐26 的浓度。
SKOV3 和 SKOV3/DDP 细胞与 ANXA114‐26 共孵育 48 小时，通过 EdU 实验检测 SKOV3 和 SKOV3/DDP 细胞的增殖情况。结果表明，ANXA114‐26 以浓度依赖的方式降低了 SKOV3 和 SKOV3/DDP 细胞的增殖率（图1E–F ）。
接下来，SKOV3 和 SKOV3/DDP 细胞被处理 ANXA114‐26 48 小时，通过 qRT‐PCR 和 Western blot 检测促凋亡蛋白 BAX 和抗凋亡蛋白 Bcl‐2 的 mRNA 和蛋白表达。结果表明，ANXA114‐26 能够上调两种细胞系中 BAX 的表达并下调 Bcl‐2 的表达（图1G–I ）。此外，ANXA114‐26 能够下调 SKOV3 和 SKOV3/DDP 细胞系中 MRP1 的 mRNA 和蛋白表达（图 1J–K ）。总之，ANXA114‐26 可以抑制卵巢癌细胞的增殖并逆转顺铂耐药性。
3.3. ANXA114‐26 与顺铂联合使用可抑制卵巢癌细胞的增殖，并降低顺铂耐药蛋白的表达
作者应用 ANXA114‐26 联合顺铂观察其对卵巢癌细胞增殖的影响。CCK‐8 和 EdU 实验结果显示，与对照组相比，顺铂处理组显著降低了 SKOV3 细胞的增殖，但对 SKOV3/DDP 细胞的增殖没有显著抑制作用。在 ANXA114‐26 联合顺铂处理组中，两种细胞的增殖均以 ANXA114‐26 浓度依赖的方式显著降低（图 2A–D ）。与对照组相比，单独顺铂处理组 SKOV3 细胞中 Bcl‐2 的表达显著降低，但 SKOV3/DDP 细胞中 Bcl‐2 的表达没有降低，在 ANXA114‐26 联合顺铂处理组中，随着 ANXA114‐26 浓度的增加，两种细胞中 Bcl‐2 的表达均显著降低。与对照组相比，单独顺铂处理组 SKOV3 和 SKOV3/DDP 细胞中 BAX 的表达略有增加，在 ANXA114‐26 联合顺铂处理组中，随着 ANXA114‐26 浓度的增加，两种细胞中 BAX 的表达均显著增加（图 2E–G ）。 上述结果表明，顺铂单独使用可以抑制 SKOV3 细胞的增殖，但 SKOV3/DDP 细胞的增殖没有被抑制或轻微抑制，然而，顺铂与 ANXA114‐26 联合使用显著抑制了两种类型细胞的增殖。
ANXA114‐26 与顺铂联合抑制卵巢癌细胞增殖并降低耐药蛋白的表达。(A)SKOV3 细胞系的细胞活力变化。(B)SKOV3/DDP 细胞系的细胞活力变化。(C)通过 EdU 检测 SKOV3 细胞系的细胞增殖率。(D)通过 EdU 检测 SKOV3/DDP 细胞系的细胞增殖率。(E)BAX mRNA 的相对表达。(F)Bcl‐2 mRNA 的相对表达。(G)BAX 和 Bcl‐2 的蛋白表达水平。(H)MRP1 mRNA 的相对表达。(I)MRP1 的蛋白表达水平。数据表示为均值±标准差。数据在三次独立重复实验中得出，*p < 0.05，**p < 0.01。与 10 μg/mlANXA114‐26+ DDP 相比，# p < 0.05， ## p < 0.01。
随后，结果表明，在顺铂处理组中，SKOV3 和 SKOV3/DDP 细胞的 MRP1 表达与对照组相比无显著差异。在 ANXA114‐26 联合顺铂处理组中，MRP1 的表达随着 ANXA114‐26 浓度的增加而降低（图2H–I ）。上述结果表明，ANXA114‐26 与顺铂的结合可以降低 SKOV3 和 SKOV3/DDP 细胞的 MRP1 表达，逆转卵巢癌细胞的化疗耐药性。
3.4. ANXA114‐26 通过与 FPR 受体竞争性结合，促进卵巢癌细胞凋亡并降低其耐药性。
Ac2‐26 是一种来源于 ANXA1 N 端 2-26 位的肽，可模拟 ANXA1 的生物学效应。9, 20ANXA1 分泌到细胞外，通过细胞膜上的受体 FPR（包括 FPR1、FPR2 和 FPR3）发挥其生物学功能。 8, 10, 14Boc‐MLF 是一种常用的 FPR1 抑制剂。 21以 SKOV3/DDP 细胞为例，作者研究了 Boc‐MLF 和 Ac2‐26 对卵巢癌细胞增殖和药物耐药性的影响。通过 qRT‐PCR 和 Western blot 检测 BAX、Bcl‐2 和 MRP1 的 mRNA 和蛋白表达。结果表明，Boc‐MLF 处理组的细胞中 BAX 表达增加，而 Bcl‐2 和 MRP1 的表达水平降低。Ac2‐26 处理组的细胞中 BAX 表达降低，而 Bcl‐2 和 MRP1 的表达增加（图 3A–D ）。上述结果表明，Boc‐MLF 通过抑制 FPR1 可增加细胞凋亡并降低 MRP1 表达。Ac2‐26 可激活 FPR，促进卵巢癌细胞增殖和 MRP1 表达，这与作者检测到的 SKOV3/DDP 中 ANXA1 的高表达一致。
ANXA114‐26 通过与 ANXA1 竞争性结合 FPR 受体，促进卵巢癌细胞凋亡并降低其耐药性。(A) BAX mRNA 的相对表达。(B) Bcl‐2 mRNA 的相对表达。(C) MRP1 mRNA 的相对表达。(D) BAX、Bcl‐2 和 MRP1 的蛋白表达水平。(E) SKOV3 细胞系的细胞活力变化。(F) SKOV3/DDP 细胞系的细胞活力变化。(G) BAX mRNA 的相对表达。(H) Bcl‐2 mRNA 的相对表达。(I) MRP1 mRNA 的相对表达。(J) BAX、Bcl‐2 和 MRP1 的蛋白表达水平。数据表示为均值±标准差。数据在三次独立重复实验中均得到验证，*p < 0.05，**p < 0.01。与 ANXA114‐26 + Ac2‐26 相比，# p < 0.05， ## p < 0.01。
为了进一步探究 ANXA114‐26 是否通过 FPR 受体调节卵巢癌细胞，作者使用 CCK‐8 实验检测 ANXA114‐26 是否能够逆转 Ac2‐26 的增殖效应。结果显示，与对照组相比，Ac2‐26 组促进细胞增殖，而 ANXA114‐26 抑制细胞增殖。与 Ac2‐26 组相比，ANXA114‐26 + Ac2‐26 组的细胞活力降低（图 3E–F ），表明 ANXA114‐26 能够抑制 Ac2‐26 的增殖效应。通过 qRT‐PCR 和 Western blot 检测 BAX、Bcl‐2 和 MRP1 的 mRNA 和蛋白表达，结果显示，与 ANXA114‐26 组和 Ac2‐26 组相比，ANXA114‐26 + Ac2‐26 组的 BAX 表达水平高于 Ac2‐26 组且低于 ANXA114‐26 组。Bcl‐2 和 MRP1 的表达水平低于 Ac2‐26 组且高于 ANXA114‐26 组（图 3G–J ）。这些结果表明，ANXA114‐26 通过与 FPR 结合，逆转了 Ac2‐26 对卵巢癌细胞增殖和药物耐药性的影响。
3.5. ANXA114‐26 可能通过细胞周期蛋白 D1 和 NF‐ĸB 信号通路影响卵巢癌细胞的增殖和药物耐药性
肿瘤细胞中的耐药性据报道与细胞周期蛋白 D1 和 NF-ĸBp65 的表达水平相关。22, 23, 24, 25作者的实验结果表明，SKOV3/DDP 细胞系的细胞周期蛋白 D1 和 NF-ĸBp65 表达水平高于 SKOV3 细胞系（图 4A–C ），这表明细胞周期蛋白 D1 和 NF-ĸBp65 表达水平的升高可能与卵巢癌细胞的耐药性有关。在用不同浓度的 ANXA114-26 处理细胞后，采用 qRT-PCR 和 Western blot 检测细胞周期蛋白 D1 和 NF-ĸBp65 的 mRNA 和蛋白表达变化。结果表明，随着 ANXA114-26 浓度的增加，细胞周期蛋白 D1 和 NF-ĸBp65 的表达水平降低（图 4D–F ）。作者还检测了用 ANXA114-26 联合顺铂处理的卵巢癌细胞中细胞周期蛋白 D1 和 NF-ĸBp65 表达的变化。结果表明，单独顺铂处理组与对照组相比，细胞周期蛋白 D1 和 NF-ĸBp65 表达无显著变化，而在 ANXA114-26 联合顺铂处理组中，随着 ANXA114-26 浓度的增加，细胞周期蛋白 D1 和 NF-ĸBp65 的表达水平降低（图 4G–I ）。 上述结果表明，顺铂对 Cyclin D1 和 NF‐ĸBp65 的表达没有影响，而 ANXA114‐26 与顺铂联合使用可以降低 Cyclin D1 和 NF‐ĸBp65 的表达。
ANXA114‐26 可能通过 Cyclin D1 和 NF‐ĸBp65 信号通路影响卵巢癌细胞的增殖和药物耐药性。(A) SKOV3 和 SKOV3/DDP 细胞系中 Cyclin D1 mRNA 表达的差异。(B) SKOV3 和 SKOV3/DDP 细胞系中 NF‐ĸBp65 mRNA 表达的差异。(C) SKOV3 和 SKOV3/DDP 细胞系中 Cyclin D1 和 NF‐ĸBp65 蛋白表达的差异。(D) Cyclin D1 mRNA 的相对表达。(E) NF‐ĸBp65 mRNA 的相对表达。(F) Cyclin D1 和 NF‐ĸBp65 的蛋白表达水平。(G) Cyclin D1 mRNA 的相对表达。(H) NF‐ĸBp65 mRNA 的相对表达。(I) Cyclin D1 和 NF‐ĸBp65 的蛋白表达水平。数据在三次独立重复实验中验证，*p < 0.05，**p < 0.01。
总之，ANXA114‐26 可能通过降低 Cyclin D1 和 NF‐ĸBp65 的表达来抑制 SKOV3 和 SKOV3/DDP 的增殖并逆转细胞耐药性。
3.6. ANXA114‐26 通过抑制 FPR/Cyclin D1/NF‐ĸBp65 通路，促进卵巢癌细胞凋亡并减少 MRP1 表达
作者研究了 Boc‐MLF 和 Ac2‐26 对 SKOV3/DDP 细胞中 Cyclin D1 和 NF‐ĸBp65 表达的影响。结果表明，Boc‐MLF 处理组的细胞中 Cyclin D1 和 NF‐ĸBp65 的表达降低。Ac2‐26 处理组的细胞中 Cyclin D1 和 NF‐ĸBp65 的表达增加（图 5A–C ）。这些结果表明，Boc‐MLF 通过抑制 FPR1 导致 Cyclin D1 和 NF‐ĸBp65 表达降低，而 Ac2‐26 通过激活 FPR 促进卵巢癌细胞中 Cyclin D1 和 NF‐ĸBp65 的表达。
ANXA114‐26 通过抑制 FPR/Cyclin D1/NF‐ĸBp65 通路促进卵巢癌细胞凋亡并减少 MRP1 表达。(A) Cyclin D1 mRNA 的相对表达。(B) NF‐ĸBp65 mRNA 的相对表达。(C) Cyclin D1 和 NF‐ĸBp65 的蛋白表达水平。(D) Cyclin D1 mRNA 的相对表达。(E) NF‐ĸBp65 mRNA 的相对表达。(F) Cyclin D1 和 NF‐ĸBp65 的蛋白表达水平。(G) 质粒转染后 Cyclin D1 mRNA 表达的验证。(H) 质粒转染后 Cyclin D1 蛋白表达的验证。(I) 通过 Annexin V‐FITC/PI 检测卵巢癌细胞凋亡。(J) BAX mRNA 的相对表达。(K) Bcl‐2 mRNA 的相对表达。(L) MRP1 mRNA 的相对表达。(M) NF‐ĸBp65 mRNA 的相对表达。(N) BAX、Bcl‐2、MRP1 和 NF‐ĸBp65 的蛋白表达水平。数据在三次独立重复实验中验证，*p < 0.05，**p < 0.01。
为探究 ANXA114‐26 是否通过与 Ac2‐26 竞争性结合 FPR 来调节 Cyclin D1 和 NF‐ĸBp65 的表达，作者使用 qRT‐PCR 和 Western blot 检测 ANXA114‐26 是否能逆转 Ac2‐26 对 Cyclin D1 和 NF‐ĸBp65 的促进作用，结果显示 ANXA114‐26 + Ac2‐26 组的 Cyclin D1 和 NF‐ĸBp65 表达水平低于 Ac2‐26 组，但高于 ANXA114‐26 组（图 5D–F ）。这些结果表明，ANXA114‐26 通过与 FPR 竞争性结合 Ac2‐26，逆转了 Ac2‐26 对 Cyclin D1 和 NF‐ĸBp65 的促进作用。
为了进一步阐明 ANXA114‐26 是否通过 CyclinD1 抑制细胞增殖并降低 MRP1 表达，作者检测了 SKOV3 和 SKOV2/DDP 细胞在过表达 Cyclin D1 后的凋亡和药物耐药性变化（图 5G–H ）。流式细胞术结果显示，与 ANXA114‐26 组相比，ANXA114‐26+OE‐Cyclin D1 组的凋亡细胞减少，表明 Cyclin D1 的过表达可以逆转 ANXA114‐26 对卵巢癌细胞的抑制作用（图 5I ）。通过 qRT‐PCR 和 Western blot 检测 BAX、Bcl‐2、MRP1 和 NF‐ĸBp65 的表达水平，结果显示，与 ANXA114‐26 组相比，ANXA114‐26+OE‐Cyclin D1 组的 BAX 表达降低，而 Bcl‐2、MRP1 和 NF‐ĸBp65 的表达水平升高（图 5J–N ）。这表明 ANXA114‐26 通过 Cyclin D1 对卵巢癌细胞的增殖、药物耐药性以及下游蛋白 NF‐ĸBp65 产生多重作用。
总结
总之，作者发现了一种名为 ANXA114‐26 的小分子肽，它是 ANXA1 的 N 端肽。ANXA114‐26 能与 ANXA1 在肿瘤微环境中竞争性结合细胞膜受体 FPR。ANXA114‐26 通过 FPR/Cyclin D1/NF‐ĸBp65 通路促进卵巢癌细胞凋亡并降低其耐药性。ANXA114‐26 在细胞外发挥作用。需要进一步研究以确定 ANXA114‐26 逆转卵巢癌化疗耐药性和抑制卵巢癌细胞生长的最佳浓度。
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