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结果：
通过 scRNA-seq 分析揭示的 UCEC 中六种细胞类型的细胞焦亡相关基因表达景观
为表征 UCEC 中的不同细胞类型，作者应用了正常子宫内膜组织和子宫内膜肿瘤组织的 scRNA-seq 数据，分析了包含 UCEC 患者和健康个体共 9012 个细胞的 scRNA-seq 数据集，并构建了统一流形近似和投影（UMAP）以可视化细胞聚类结果（ Fig. S1 A）。其中，6089 个细胞来自肿瘤样本，2923 个来自健康组织，包括六种细胞类型（髓系细胞、淋巴细胞、内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和上皮细胞），这些细胞类型使用经典标记基因进行了注释（图 1 A-B 和 S1B）。
通过单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）分析 UCEC 细胞类型中炎症小体相关基因的表达谱。(A) 该图展示了已识别的细胞类型，并使用经典标记基因进行注释。(B) UMAP 图显示了上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞在 UCEC 患者和健康个体之间的表达情况。(C) 六种细胞类型中炎症小体相关基因表达的差异。点的尺寸代表表达该基因的细胞百分比。点的颜色代表平均表达水平；红色表示高表达，蓝色表示低表达。(D) 每种细胞类型中炎症小体相关基因的百分比。(E) 每种细胞类型的炎症小体评分。(F-H) 肿瘤组织中 BAX、IL1B 和 TNF 的平均表达水平。(I) 通过炎症小体相关基因进行降维和聚类识别的 UMAP 图，显示三个聚类。 (J) 通过三种细胞焦亡调节因子聚类进行无监督聚类的 DEGs 热图。
使用小提琴图说明不同细胞类型中标记基因的表达分布 (Fig. S1 C)。为了进一步探索细胞焦亡相关基因与 UCEC 之间的关系，作者对不同细胞类型中的细胞焦亡相关基因进行了表达和比例分析。主要细胞焦亡相关基因（包括 TP53, TNF, IL1B, IL1A, BAX, CHMP4A, CHMP3, 和 CHMP2A）的 RNA 表达在 UCEC 细胞中显著高于正常组（图 1 C）。特别是，UCEC 组在上皮细胞中显示高表达 TP53, CHMP2A, CHMP3, CHMP4A 和 BAX，而 TNF, IL1A, IL1B, IL-6, CHMP4A 和 BAX 在巨噬细胞中高表达 ( Fig. S1 D)。为了更好地理解细胞焦亡相关基因的比例，作者探索了每种细胞类型中这些基因的表达百分比，发现 IL1B, CHMP2A, CHMP3, CHMP4A 和 BAX 在各种 UCEC 细胞类型中的表达比例相对较高（图 1 D）。 此外，为了鉴定细胞焦亡相关基因的全局表达情况，作者使用细胞焦亡相关基因作为评分，通过 Add Module Score 方法计算整体基因表达模式，结果显示巨噬细胞评分最高，而上皮细胞评分最低（ Fig. S1 E）。与六种细胞类型的平均评分相比，巨噬细胞评分高于平均值（图 1 E）。随后，作者分析了正常组织和肿瘤组织中与细胞焦亡相关的基因表达情况。统一流形近似和投影（UMAP）图显示，BAX、IL1B 和 TNF 主要在肿瘤组织中的上皮细胞和巨噬细胞中表达（图 1 F-H 和 S1F-H）。这些结果表明，细胞焦亡相关基因在 UCEC 中表达，并通过异常高表达在肿瘤调控中发挥关键作用。
鉴于上述提到的细胞焦亡相关基因表达增强，作者探索了这些基因在不同细胞类型中的表达和调控情况。利用细胞焦亡相关基因进行降维，并使用 UMAP 可视化簇的分布。作者在这些细胞中检测到三种异质性细胞组成，发现 pyr-0 主要聚集在淋巴细胞中，pyr-1 聚集在上皮细胞中，而 pyr-2 聚集在巨噬细胞中（图 1 I）。为了确定每个簇的细胞身份，作者通过差异基因表达分析，利用已知的上皮细胞类型标记基因（如 KRT23）来生成簇特异性标记基因，以确定簇的调控情况。此外，作者识别出 pyr-2 中的 PLAUR 和 CCRL2 等基因作为与巨噬细胞相关的基因（图 1 J）。为了探索细胞焦亡相关基因的特征及其不同的生物学作用，使用细胞焦亡相关基因进行无监督聚类分析揭示了三种表达模式（簇 1、簇 2 和簇 3）。 接下来，作者研究了 UCEC 中与细胞焦亡相关的基因在三个簇中的分子调控（图 2 A）。
UCEC 患者和健康个体中细胞焦亡调节因子的表达模式。(A) UCEC 患者和健康个体中细胞焦亡调节因子簇的表达模式。来自 UCEC 组和健康组的无监督聚类 DEGs 热图；每个模块中的 DEGs 进行了注释；折线图显示了基因模块表达的趋势，右侧文本显示了每个模块基因的富集通路。(B-E) 在 GEPIA 2 中根据高表达与低表达 BAX (B)、SLC16A10 (C)、NLRC3 (D)和 CXCR6 (E)对 UCEC 队列进行分层分析的 Kaplan-Meier 生存曲线，显示了无进展生存期。
在簇 1（pyr-0）中，包括GPR171 和 NLRC3 等基因调节与肿瘤发生和发展相关的通路，如细胞-基底粘附。在组 2（pyr-1）中，FXYD3、MUC13、BNIP3 和 KRT23 调节星形胶质细胞分化、发育和胶质生成等通路。在簇 3（pyr-2）中， BX640514.2 、PLAUR、CCRL2、SLC16A10 和 KMO 调节髓系白细胞活化和炎症反应通路。总体生存分析表明，这些基因表达的差异对患者预后产生不同影响，揭示了与细胞焦亡相关的簇中差异表达基因在指导患者预后方面的临床价值。BAX、KMO 和 SLC16A10 在巨噬细胞中表达。高表达 BAX 和 KMO 以及低/中等表达 SLC16A10 与更好的生存状态相关（图 2 B-C）。NLRC3 和 CXCR6 在淋巴细胞中表达。这些基因高表达的患者的生存状态更好（图 2 D-E）。 这些结果表明，上皮细胞、巨噬细胞和淋巴细胞中凋亡相关基因的异常高表达可以促进某些基因的表达，而这些基因的异常表达会激活肿瘤相关通路；而凋亡相关基因和调控基因的异常高表达会影响巨噬细胞和淋巴细胞，最终影响肿瘤的形成和进展。根据与凋亡相关的基因，在 UCEC 和对照样本中发现了三个簇。其中两个最丰富的簇主要聚集在上皮细胞和巨噬细胞中。作者鉴定了每种细胞类型中高表达的基因，并使用这些基因进行了 Gene Ontology (GO)分析。结果进一步证实了簇定义的准确性。综上所述，作者的研究揭示了 UCEC 中与凋亡相关的基因组成，并全面展示了凋亡对 UCEC 的潜在影响，值得进一步研究。
IL-6 激活 UCEC 上皮细胞中的肿瘤相关通路
作者发现上皮细胞是子宫体子宫内膜癌（UCEC）中最丰富的细胞群体，并且与细胞焦亡相关的基因表达高度聚集在这个细胞类型中（pyr-1）。为了进一步探索上皮细胞的生物学功能，作者对上皮细胞中的差异表达基因（DEGs）进行了生物学功能富集分析。涉及上调 DEGs 的通路包括细胞呼吸、ATP 代谢过程、细胞解毒、蛋白质折叠和内在凋亡信号通路。与下调 DEG 相关的通路包括肿瘤坏死因子（TNF）通路、细胞迁移的负调控、对伤口的响应调控以及细胞外基质组织（图 3 A）。
上皮细胞中 IL-6 的特异性上调导致了 UCEC 的发病机制。(A) 水平条形图表示差异表达最显著的通路。在 UCEC 中观察到基因功能富集（上调和下调）与对照组相比。 (B) 上皮细胞中 UCEC 的细胞焦亡特征显著失调。（Wilcoxon 检验，P < 0.001）。 (C) UCEC 中 KRT8 与细胞焦亡特征的相关性.R = 0.37, P < 0.05。 (D) UCEC 中 KRT23 与细胞焦亡特征的相关性.R = 0.21, P < 0.05。 (E) UCEC 中 FXYD3 与细胞焦亡特征的相关性.R = 0.32, P < 0.05。 (F) IL-6 与其他基因之间相关性的网络分析。 (G) IL-6 模块富集的功能通路条形图；X 轴是-log（p 值），Y 轴代表基因所涉及的不同通路。 (H) IL-6 与上皮细胞增殖的正向调控之间的相关性 (R = 0.3,3 P<0.05, Spearman’s 相关性分析)。 (I) 细胞间通讯分析（髓系细胞与上皮细胞之间）。 (J) 低 IL-6 组与高 IL-6 组之间不同基因表达的占比。 (K) 点图展示了髓系细胞与上皮细胞之间的通讯及配体-受体相互作用（高 IL-6 与低 IL-6）。
为进一步探索 pyroptosis 相关基因在上皮细胞中的作用，使用 AUCell 展示了正常组和肿瘤组之间 pyroptosis 特征的差异。结果表明，在 UCEC 上皮细胞中，肿瘤组的 pyroptosis 特征高于正常组（图3 B）。作者还分析了 pyr-1 中鉴定基因与上皮细胞 pyroptosis 特征之间的相关性，确定 pyroptosis 特征与 KRT8（R = 0.37）、KRT23（R = 0.21）和 FXYD3（R = 0.32；图 3 C-E）之间存在正相关关系。这些结果表明，pyroptosis 基因的异常高表达调控了 UCEC 上皮细胞中的肿瘤相关信号通路。
为识别导致上皮细胞中细胞类型特异性失调的细胞焦亡相关基因，作者利用集中于子宫体子宫内膜癌（UCEC）中的细胞焦亡相关基因，通过加权相关网络分析（WGCNA）识别与上皮细胞相关的关键模块，该分析揭示有 20 个基因与上皮细胞中细胞焦亡相关基因的表达密切相关。特别是，棕色模块呈现了细胞焦亡相关基因 IL-6 的上调。为更好地理解 IL-6 的功能作用，作者搜索了与 IL-6 相关的 20 个基因（图 3 F），并进行了 GO 功能富集分析。分析显示细胞增殖、凋亡过程调控、程序性细胞死亡的正调控、转化生长因子（TGF）-β受体信号通路以及 RNA 代谢过程调控的上调（图 3 G）。此外，IL-6 的表达与上皮细胞增殖呈正相关（R = 0.33；图 3 H）。接下来，作者使用 CellChat 检测上皮细胞和其他细胞中 IL-6 表达的相互作用（图。 3 I), 并且观察到在 UCEC 患者中，IL-6 高表达组与特定基因（包括 NOTCH, TWEAK, SEMA4, CD46, THBS, DESMOSOME, COLLAGEN 和 SPP1）以及其他细胞类型存在显著相互作用（图 3 J）。一些受体-配体对仅在 IL-6 高表达组中表达，例如 TNFSF12-TNFRSF12A、SEMA4A-PLXNB2 和 CD99-CD99（图 3 K）。以上结果表明，IL-6 作为上皮细胞中与细胞焦亡相关的关键基因，会失调上皮细胞增殖，并干扰受体-配体对在 UCEC 上皮细胞中的特异性调控作用。
BAX 和 TNF 在巨噬细胞中通过细胞焦亡途径促进肿瘤进展
由于与焦亡相关的基因在巨噬细胞组（pyr-2）中高度聚集，作者对 UCEC 巨噬细胞中差异表达基因（DEGs）进行了生物学功能富集分析，以探索巨噬细胞的生物学功能。一些通路被上调，例如抗原处理和呈递、内皮细胞趋化性正向调控、超分子纤维内化负向调控、T 细胞介导免疫正向调控以及白细胞细胞间黏附正向调控。然而，一些通路被下调，包括外源性凋亡信号通路调控和上皮细胞增殖调控（图 4 A）。
巨噬细胞中 BAX 和 TNF 的特异性上调导致了 UCEC 的免疫功能障碍。(A) 代表差异最显著的通路水平条形图。功能富集分析显示 UCEC 中高表达（Up）和低表达（Down）的基因。 (B) 巨噬细胞中 UCEC 的细胞焦亡特征显著失调。（Wilcox 检验，P < 0.001）。 (C) CCRL2 与 UCEC 细胞焦亡特征之间的相关性.R = 0.67, P < 0.05。 (D) KMO 与 UCEC 细胞焦亡特征之间的相关性.R = 0.36 P<0.05。 (E) PLAUR 与 UCEC 细胞焦亡特征之间的相关性.R = 0.46, P < 0.05。 (F) BAX 与其他基因之间相关性的网络分析。 (G) BAX 模块富集的功能通路条形图；X 轴为-log（p 值），Y 轴代表基因所涉及的通路。 (H) BAX 与参与免疫反应的巨噬细胞激活的相关性 (R = 0.59, P < 0.05. 斯皮尔曼相关性分析)。 (I) 淋巴细胞、内皮细胞、髓系细胞和上皮细胞之间通讯的 Cellchat 分析。 (J) 低和高 BAX 组之间不同基因表达的百分比。 (K) 内皮细胞与髓系细胞、上皮细胞与髓系细胞、淋巴细胞与髓系细胞之间的通讯和配体-受体相互作用，以散点图形式展示（高 BAX 对比低 BAX）。 (L) 包含 TNF 的 WGCNA 模块网络。 (M) TNF 模块富集的功能通路条形图；X 轴是 -log (p 值)，Y 轴代表基因所参与的不同的通路。 (N) BAX 与巨噬细胞免疫反应的正调控的相关性 (R = 0.59, P < 0.05, 斯皮尔曼相关性分析)。
为探究与细胞焦亡相关的基因在巨噬细胞中的作用，作者对细胞焦亡特征进行了差异表达分析，结果显示肿瘤组的细胞焦亡特征表达上调，而正常组则未上调（图 4 B）。为确定细胞焦亡与巨噬细胞中 pyr-2 高变基因之间的相关性，作者发现细胞焦亡特征与 CCRL2（R = 0.67）、KMO（R = 0.36）和 PLAUR（R = 0.46；图 4 C-E）之间存在正相关关系。这些结果表明，细胞焦亡基因的失调可能上调 UCEC 巨噬细胞中的肿瘤相关基因。
为确定与细胞焦亡相关的基因在巨噬细胞类型特异性失调中的作用，作者检测了巨噬细胞中的基因表达。在所有基因中，BAX 与其他基因相比表现出最高的上调。为阐明 BAX 上调的预后价值，作者使用集中于 UCEC 的细胞焦亡相关基因，通过 WGCNA 识别与巨噬细胞相关的关键模块：黄色和粉色模块与巨噬细胞呈现显著相关性，分别包含 BAX 和 TNF 基因。为探索与 BAX 表达相关的功能富集，作者搜索了 20 个 BAX 相关基因（图 4 F），并进行了 Gene Ontology（GO）功能富集分析，结果显示细胞因子介导的信号通路、磷酸酶活性正向调控、凋亡过程正向调控、白介素-1 介导的信号通路以及宿主防御反应在巨噬细胞中上调（图 4 G）。 此外，在巨噬细胞中对 BAX 表达与肿瘤相关通路进行相关性分析，以验证 BAX 在 UCEC 巨噬细胞中上调的机制。BAX 表达与参与免疫反应的巨噬细胞激活呈正相关（R = 0.59；图 4 H）。使用 BAX 进行的细胞链分析揭示了巨噬细胞与其他三种细胞类型（包括上皮细胞、淋巴细胞和内皮细胞）之间的各种不同相互作用（图 4 I）。高 BAX 表达组在 UCEC 患者中与特定基因（包括 CD137, SELPLG, CSF, TNF, ANNEXIN 和 FN1）和其他细胞类型表现出显著相互作用（图 4 J）。一些受体-配体对，如 TIGHT-NECTIN2、GDF15-TGFBR2 和 F11R-F11R，仅在高 BAX 表达组中表达（图 4 K）。以上结果表明，BAX 作为巨噬细胞中一个关键的细胞焦亡相关基因，失调了巨噬细胞增殖以及受体-配体对在 UCEC 巨噬细胞中的特异性调控作用。
为探索巨噬细胞中TNF 的细胞类型特异性调控机制，以及 TNF 在巨噬细胞细胞类型特异性失调中所起的作用，通过 WGCNA 方法鉴定了 UCEC 巨噬细胞中 TNF 的生物学功能。WGCNA 分析显示，有 20 个基因与巨噬细胞中 TNF 的表达密切相关（图 4 L）。功能富集分析表明，这些基因主要富集在 DNA 去甲基化、巨噬细胞分化、先天性免疫反应调控、自噬的正调控以及 TNF 超家族细胞因子产生调控（图 4 M）。此外，TNF 与巨噬细胞分化的正调控之间存在正相关关系（图 4 N）。使用 TNF 进行细胞链分析显示，巨噬细胞与其他三种细胞类型之间存在多样且独特的相互作用（ Fig. S2 A）。随后，将样本分为低 TNF 表达组和高 TNF 表达组，以进一步探索 TNF 在巨噬细胞中的作用。
作者发现，在 UCEC 患者中，TNF 高表达组与特定基因（包括 CD137, SELPLG, CSF, TNF, 和 FN1）以及其他细胞类型存在显著相互作用（ Fig. S2 B）。TNF 高表达组与一些已表达的受体配体对存在显著相互作用，例如 TIGHT-NECTIN2、CCL5-CCR1 和 CCL14-CCR1（ Fig. S2 C）。以上结果表明，BAX 和 TNF 作为巨噬细胞中重要的细胞焦亡相关基因，不仅可以特异性地失调巨噬细胞分化和免疫反应，还可以失调 UCEC 巨噬细胞中的受体配体对。
内皮细胞、成纤维细胞和淋巴细胞中与细胞焦亡相关的基因在生物通路上的调控
为进一步探索 pyroptosis 基因在内皮细胞中的生物学功能，作者对内皮细胞中的 DEGs 进行了生物学功能富集分析。多个通路被上调，如参与细胞激活的正向调控、细胞粘附的正向调控、细胞因子产生的正向调控、免疫效应过程正向调控以及 IL1 产生的调控。然而，内皮细胞凋亡过程、血管生成、迁移和分化则被下调（ Fig. S3 A）。为揭示 pyroptosis 相关基因在内皮细胞中的作用，作者对 pyroptosis 特征进行了差异表达分析。小提琴图显示，与正常组相比，内皮细胞中的肿瘤组中 pyroptosis 特征上调（ Fig. S3 B）。这些结果表明，pyroptosis 基因的失调可以上调 UCEC 内皮细胞中的肿瘤相关基因。为探索 pyroptosis 相关基因在内皮细胞类型特异性失调中的作用，作者检测了内皮细胞中 pyroptosis 相关基因的表达。 在这些基因中，CHMP4A 与其他基因相比显示出最高的上调。为了阐明 CHMP4A 上调的预后价值，作者使用集中于子宫体子宫内膜癌（UCEC）的细胞焦亡相关基因，通过 WGCNA 识别与内皮细胞相关的关键模块，并发现包括 CHMP4A 在内的蓝色模块与内皮细胞显著相关（ Fig. S3 C）。接下来，作者搜索了与 CHMP4A 表达相关的 20 个基因（ Fig. S3 D），并通过 GO 功能富集分析确定了四个与肿瘤相关的信号通路，包括细胞对 IL1 的反应、对 TNF 的反应、血管生成、伤口愈合和细胞扩散，这些通路在内皮细胞中上调（ Fig. S3 E）。使用 CHMP4A 进行的细胞链分析揭示了内皮细胞与其他两种细胞类型（包括上皮细胞和巨噬细胞）之间多样化且独特的相互作用（ Fig. S3 F）。 作者发现，在子宫内膜癌（UCEC）患者中，CHMP4A 高表达组与特定基因（包括 CD137, PROS, GAS, CEACAM, NOTCH, CD46, CSF, 和 FN1）以及其他细胞类型存在显著相互作用（ Fig. S3 G）。一些受体-配体对仅在 CHMP4A 高表达组中表达，例如 LGALS9-CD44、LAMC2-CD44、LCMC2-(ITGA9+ITGB1)、LCMC1-(ITGA9+ITGB1)和 LCMB3-(ITGA9+ITGB1； Fig. S3 H）。这些结果表明，CHMP4A 是内皮细胞中与细胞焦亡相关的关键基因，它失调了内皮细胞增殖的调控，并在 UCEC 内皮细胞中受体-配体对的特定调控作用。
为进一步探索巨噬细胞中炎症体基因的生物学功能，作者对巨噬细胞中的差异基因表达进行了生物学功能富集分析。一些通路，如伤口愈合、胶原纤维组织、内在凋亡信号通路、缺氧反应和 TGF-β反应，被上调。然而，其他基因被下调，包括负向调控细胞周期、转移酶活性调控和细胞增殖调控相关的基因（ Fig. S4 A）。小提琴图显示，与正常组相比，肿瘤组中巨噬细胞中的炎症体特征基因上调（ Fig. S4 B）。这些结果表明，炎症体基因的失调可以调控 UCEC 巨噬细胞中的肿瘤相关基因。为探索炎症体相关基因在内皮细胞类型特异性失调中的作用，检测了内皮细胞中炎症体相关基因的表达。 在众多基因中，BAX 表现出比其他基因更高的上调，为了阐明 BAX 上调的预后价值，作者使用了集中于 UCEC 的细胞焦亡相关基因，通过 WGCNA 识别与内皮细胞相关的关键模块，发现了与内皮细胞显著相关的紫色模块。青色模块基因分别是 BAX 和 COL6A3。( Fig. S4 C)。接下来，作者搜索了 20 个与 BAX 相关的基因 ( Fig. S4 D)。GO 功能分析中富集了与肿瘤相关的五个信号通路，包括细胞外基质组织、胶原纤维组织、凋亡过程调控、细胞对 TGF-β 刺激的反应以及成纤维细胞增殖的正调控 ( Fig. S4 E)。使用 BAX 进行细胞链分析显示，成纤维细胞与其他四种细胞类型（上皮细胞、淋巴细胞、内皮细胞和巨噬细胞）之间存在多种不同的相互作用 ( Fig. S4 F)。 作者发现高 BAX 表达组在 UCEC 患者中与特定基因（包括 WNT, ANGPTL, ncWNT, 和 THY1）以及其他细胞类型存在显著相互作用（ Fig. S4 G）。一些受体配体对，如 D99-CD99、ADGRE5-CD55 和 SPP1-CD44，仅在高中表达组中表达（ Fig. S4 H）。以上结果表明 BAX 是成纤维细胞中一个关键的细胞焦亡相关基因，并失调了 UCEC 成纤维细胞中内皮细胞增殖和受体配体对的特定调控活性。
为了进一步探索 pyroptosis 基因在淋巴细胞中的生物学功能，作者利用 WCGNA 识别了淋巴细胞中的关键 pyroptosis 基因；关键基因是 TNF。作者分析了在淋巴细胞中表达的其它基因与 pyroptosis 特征的相关性，发现 PTPCR 与 pyroptosis 特征之间存在正相关关系 ( Fig. S5 A)。
接下来，作者搜索了与 TNF（ Fig. S5 B）相关的 20 个基因，通过 GO 功能分析富集了与肿瘤相关的五个信号通路，包括细胞因子产生正调控、I-kappa B 激酶/NF-kappa B 信号通路、T 细胞活化调控、T 细胞介导的对肿瘤细胞的免疫反应调控以及细胞对肿瘤坏死因子的反应（ Fig. S5 C）。使用 TNF 进行 Cellchat 分析显示，淋巴细胞与其他三种细胞类型（包括上皮细胞、内皮细胞和巨噬细胞）之间存在多种不同的相互作用（ Fig. S5 D）。随后，作者将样本分为低表达和高表达 TNF 两组，以进一步探索 TNF 在淋巴细胞中的作用。两组的受体-配体对没有差异（ Fig. S5 E）。这些结果表明，TNF 是淋巴细胞中与细胞焦亡最相关的基因，能够激活 UCEC 淋巴细胞中的肿瘤相关通路。
与焦亡相关的基因抑制免疫细胞浸润并阻碍免疫通路激活
为进一步验证与细胞焦亡相关的基因在肿瘤微环境（TME）中的作用及其临床相关特征，作者基于与细胞焦亡相关的基因，使用来自癌症基因组图谱（TCGA）的数据分析了 401 例子宫内膜癌（UCEC）患者的转录组数据。分析发现与细胞焦亡相关的基因中存在拷贝数变异（CNV）频率，并显示出拷贝数扩增（ Fig. S6 A）。此外，与细胞焦亡相关的基因之间存在一些相互作用（ Fig. S6 B）。热图显示，肿瘤组的多数细胞焦亡相关基因表达水平高于正常组（图 5 A）。
通过 RNA-seq 建立风险预后模型的细胞焦亡评分。(A) 正常组织和 UCEC 样本中 51 个细胞焦亡调节因子基因表达水平的差异。方框的上端和下端代表数值的四分位距。方框内的线表示中位数，点表示离群值。星号代表统计 P 值（*P < 0.05；** P < 0.01；*** P < 0.001）。(B) 不同组患者的 PCA 图。(C) 聚类 1 和聚类 2 患者总生存期的 Kaplan-Meier 曲线（两阶段检验，P < 0.05）。(D) 条形图显示显著的 GO 功能项。(E) GSVA 富集分析显示不同细胞焦亡调节因子聚类中生物通路的激活状态。热图用于可视化这些生物过程；红色代表激活通路，蓝色代表抑制通路。UCEC 队列用作样本注释。 (F) 评估风险评分在 UCEC 队列中预后性能的时间依赖性受试者工作特征曲线。 (G) Kaplan-Meier 曲线展示 UCEC 队列中高风险和低风险组患者的生存概率。 (H) 描述两组间细胞免疫反应差异的箱线图。 (I) 展示不同评分组中免疫功能及免疫细胞激活状态的 nhiệt độ đồ，肿瘤纯度、ESTIMATE 评分、免疫评分和基质评分被用作免疫功能指标。红色，激活状态；蓝色，抑制状态。 (J) 不同等级组间风险评分的差异。 (K-L) 高风险组和低风险组间 TIDE (K) 和 PDL-1 (L) 的差异，分别。
这些结果表明，与细胞焦亡相关的基因在子宫体子宫内膜癌的发生和发展中发挥着重要作用。
非监督聚类分析和主成分分析（PCA）对 401 例 UCEC 患者进行分类，并识别出两种不同的修饰模式（Figs. S6 C 和 5B），包括 292 例模式 A 和 109 例模式 B。这些聚类分别命名为聚类 1 和聚类 2。生存分析表明，这些聚类与 UCEC 患者的预后显著相关，其中聚类 1 表现出明显的生存优势（图 5 C）。接下来，作者使用所有基因进行了功能富集分析。GO 富集分析显示某些肿瘤相关通路被激活，如激活素受体信号通路、外轴丝动力蛋白臂、角化包膜和轴丝动力蛋白复合物的调控（图 5 D）。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集分析表明，与聚类 1 相比，聚类 2 中 DNA 复制和核苷酸修复相关通路的表达更高（图 5 E）。
由于上述分析基于整个队列，因此它们无法准确预测单个肿瘤中炎症小体相关表达的规律。因此，作者利用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归分析建立了一个预后风险评分模型，以量化子宫内膜腺癌（UCEC）患者中炎症小体相关基因的表达，并预测 UCEC 患者的治疗反应和预后。作者选择了与炎症小体相关且系数不为零的基因，并在生存分析中使用这些基因（ Fig. S6 D）。受试者工作特征（ROC）曲线验证了该预后风险模型的预测能力（图 5 F）。对系数不为零的炎症小体相关基因进行主成分分析（PCA）将患者分为两组（ Fig. S6 E）。作者选择了最佳截断值，将得分高于该值的患者定义为炎症小体高分组；否则，定义为炎症小体低分组（ Fig. S6 F）。生存分析显示低分组患者的生存率更好（图 5 G）。
为探究细胞焦亡相关基因在肿瘤微环境（TME）中免疫细胞浸润中的作用，作者比较了两组间免疫细胞浸润程度和免疫相关通路状态的差异。作者发现，在细胞焦亡高评分组中，包括 B 细胞、T 细胞、NK 细胞和巨噬细胞在内的免疫细胞浸润程度较低（ Fig. S6 g），该组的免疫相关通路也被抑制，例如 I 型/II 型干扰素应答、T 细胞共刺激和促炎通路（图 5 h）。热图更直观地显示，在高评分组中，多种免疫细胞和免疫通路呈现低表达状态（图 5 I）。高评分组的微环境、基质、免疫系统、巨噬细胞和 ESTIMAT 评分均低于低评分组（ Figs. S6 H-L）。然而，高评分组的肿瘤纯度更高（ Fig. S6 M）。这些结果表明，与细胞焦亡相关的基因可以阻断免疫细胞的浸润并抑制相关免疫通路。
为了更好地验证乌尔里希体腔上皮癌（UCEC）患者中与细胞焦亡相关的基因评分的评估潜力，作者将该评分与相关的临床特征相结合，包括年龄、肿瘤等级和生存情况。作者观察了高分组和低分组中具有不同临床特征的患者比例。直方图显示，在高分组中，肿瘤等级为 3 级、死亡状态和年龄>65 岁的患者比例更高 ( Figs S6 N-P)。此外，箱线图更直观地展示了不同临床组之间的评分差异；G3 组患者的评分显著高于 G1 和 G2 组患者的评分 (图 5 J)，而死亡且年龄>65 岁的患者组的评分也较高 ( Figs. S7 A-B)。生存分析也显示，无论年龄和肿瘤等级如何，低分组的生存情况总是优于高分组的生存情况 ( Figs. S7 C-F)。这些结果表明，该评分可以预测个体特征，并有可能作为生物标志物来评估 UCEC 患者的临床特征和预测预后。
为验证评分与抗癌药物反应的关系，作者使用肿瘤免疫功能障碍和排斥（TIDE）基于治疗前的肿瘤特征预测免疫检查点抑制剂（ICI）的治疗效果。低评分组的 TIDE 评分和 PD-1 表达显著高于高评分组（图 5 K-L），表明低评分组患者的肿瘤更可能发生免疫逃逸，并对 ICI 的治疗反应较差。然而，在长春碱、来那度胺和替西罗莫司方面，低评分组的 IC50 值低于高评分组（ Figs. S7 G-J）。结果表明，UCEC 评分较低的患者对肿瘤药物的治疗反应更好。
总之，与细胞焦亡相关的基因可作为生物标志物，用于预测个体患者的临床特征和治疗反应。
为验证上述结果的准确性和一致性，作者从基因表达综合数据库（GEO）收集了三组 UCEC 的 scRNA-seq 数据。使用 UMAP 图，作者可视化了这些数据集中的细胞类型，主要包括七种细胞类型（髓系细胞、内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、Mast/BC、T/NK 和上皮细胞），并使用经典标记基因进行注释（ Fig S8 A）。为了更好地理解与细胞焦亡相关的基因比例，作者探索了不同 UCEC 细胞类型中几个关键细胞焦亡相关基因的表达比率，发现 CHMP2A, CHMP3, CHMP4A 和 BAX 具有较高的表达比率（ Fig S8 B）。鉴于这些细胞焦亡相关基因的表达增强，作者进行了降维分析以探索细胞群体内的异质性，识别出五个不同的亚群。为表征每个聚类中的细胞类型，作者分析了各种与细胞焦亡相关的基因的表达谱，发现如下：Pyr-0 以 F2RL1、IGLC3、APOBEC3G、LYAR、CD6 和 RASSF8 为特征；Pyr-1 表现出 RASSF8、CDH11、MFSD2A、PRLR 和 WNT16 的显著表达；Pyr-2 以 ADGRF5、TMEM70、BCL6B、ADGRL4 和 LDLR 为标志；Pyr-3 也显示出 ADGRF5、TMEM70、BCL6B、ADGRL4 和 LDLR 的表达；Pyr-4 以 CTXN1、DPCD、EPPIN、ANKRD66 和 MOSPD1 为特征；Pyr-5 以 PDE4DIP、PILRA、PLA2G7、CASP1 和 KMO 为标志 ( Fig S8 C)。
为了进一步验证 pyroptosis 相关基因集在子宫体子宫内膜癌（UCEC）患者组织中是否在分子水平上具有普遍表达，作者对三位 UCEC 患者（包括子宫内膜肿瘤和癌旁组织）和三位健康个体（正常子宫内膜组织）的子宫内膜组织进行了免疫组化和定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR）实验。作者发现，与正常组织相比，BAX、CHMP2A、CHMPB、IL1A、IL1B 和 VPS24 在肿瘤组织的细胞质和细胞核中表达更强（图 6 A-F，S9A-F）。
采用免疫组化方法验证了子宫内膜癌中细胞焦亡基因的表达。(A-F) 对肿瘤子宫内膜组织（n = 18；标尺：50.0 µm）进行了免疫组化分析。(G-L) 正常组与肿瘤组之间阳性染色的百分比贡献（*, P < 0.05；**, P < 0.01；***, P < 0.001；****, P < 0.0001；ns，无显著性）。
条形图显示，在肿瘤组织中，阳性基因的百分比贡献高于正常组（图6 G-L）。作者还对六个样本进行了 RT-qPCR 检测。结果表明，在癌旁组织中，CHMP2A、CHMP3、CHMP4A、CHMP4B、IL1B 和 VPS24 的表达量高于正常子宫内膜组织（图 7 A-F）。
PCR 被用于验证子宫内膜癌中细胞焦亡基因的表达。(A-I) 正常组与癌旁组之间的相对 RNA 表达水平（来自对照患者（n=3）和 UCEC 患者（n=3）的 UCEC 组织；* P < 0.05；** P < 0.01；*** P < 0.001；ns，无显著差异）。
TNF 表达在肿瘤组中高于癌旁组（图 7 G）。IL-1B 和 TNF 表达在肿瘤组中高于正常组（图 7 H-I）。这些结果表明，与细胞焦亡相关的基因表达水平从正常组织到肿瘤组织逐渐升高，进一步证实与细胞焦亡相关的基因可以作为促癌基因来调控子宫体子宫内膜癌的发生和发展。
总结
综上所述，作者对 UCEC 中五种细胞类型的细胞焦亡相关基因进行了全面分析，展示了其预测 UCEC 的潜力。细胞焦亡预后风险模型也显示出独立的预后能力，为作者的研究领域提供了新颖且深刻的视角。未来，细胞焦亡相关基因有望成为 UCEC 独特诊断标志物和预后指标的尖端领域，为提高早期诊断水平和指导更精准的治疗策略提供重要信息。
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