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2017 年至 2024 年间，在巴西库里蒂巴巴巴拉那联邦大学临床医院流式细胞术实验室对 125 名急性淋巴细胞白血病 （ALL） 患者进行了回顾性跟踪。T 细胞 ALL （n = 18） 和混合表型急性白血病 （MPAL） My/T （n = 1） 病例被排除在本研究之外。
共有 106 名 B-ALL 患者可用于遗传和表型分析。其中，27 例患者（成人 20 例，儿童 7 例），t（9;22）（问 34.1;q11.2）易位和/或 BCR：：ABL1 重排被选中，对转录亚型和临床、形态学和表型特征进行详细分析。
对照组包括 79 名 B-ALL 患者（27 名成人和 52 名儿童），可进行高灵敏度 MRD 分析。该组包括 24 例二倍体核型病例和 36 例细胞遗传学异常病例：12 例超二倍体核型、5 例ETV6：：RUNX1 病例、2 例 E2A：:P BX 病例和 10 例 KMT2A 重排 （KMT2Ar）。7 例患者表现出不同的异常，其中 2 例 del6、同染色体 i（9）和 i（7），1 例 add7,1 例 t（8;12） 和一个 del（14）。此外，19 名患者缺乏中期或分子结果。
图 1 显示了儿童和成人队列之间基因改变和差异的百分比分布。
诊断时的细胞遗传学分析和分子筛查显示，9 名患者有其他细胞遗传学异常，包括复杂/变异的费城染色体，以及 5 例具有隐秘的费城染色体携带 BCR：：ABL1 重排的病例。B/My MPAL 患者的低二倍体核型，罕见 （7;14）易位。
关于 BCR：：ABL1 融合转录物类型，17 例患者（63.0%）仅表达 p190（e1a2）融合，被归类为“从头”Ph+ ALL，而 10 例患者（37.0%）表达 p210 融合，被归类为继发性慢性粒细胞白血病（CML-BP）淋巴母细胞转化。
在 CML-BP 患者中，3 例（10.0%）仅表达 p210 转录本：2 例为 e13a2（b2a2），1 例为 e14a2（b3a2）。7 例（23.3%）共表达 p190 和 p210 转录本，其中 2 例为 e14a2（b3a2）和 e1a2,3 例为 e13a2（b2a2）和 e1a2,2 例为 3 个转录本：e13a2（b2a2）、e14a2（b3a2）和 e1a2。
2.3. BCR：：ABL1 阳性 B-ALL 组的临床特征和结果
BCR：：ABL1 阳性 B-ALL 组包括 7 名儿童和 20 名成人，中位年龄为 31.3 岁（范围 3.8-75.6）。9 名患者在初始全血细胞计数中表现为白细胞增多和中性粒细胞增多，提示多系受累，尽管只有 2 名患者记录了酪氨酸激酶抑制剂治疗的慢性期 CML。在 4 例患者中观察到髓外疾病：2 例中枢神经系统受累，1 例乳腺浸润，1 例肝浸润。
根据转诊中心方案，患者接受诱导多化疗联合 TKI（伊马替尼、尼罗替尼或达沙替尼）。对首次完全缓解的符合条件的患者进行同种异体干细胞移植（allogeneic stem cell transplantation， SCT）[31]。
诱导化疗后，只有两名患者达到 FCM-MRD 和 PCR-MRD 阴性状态。15 例 MRD 水平呈阳性 （>0.01%），而 8 例患有活动性疾病 （MRD > 5%）。2 例患者表现出原发性难治性疾病，未接受进一步治疗。5 名老年人 （18.5%） 的早期死亡发生在诱导失败或难治性疾病中。三名儿科患者和两名年轻成人 （AYA） 患者通过 TKI 和大剂量化疗实现了持久缓解，无需 SCT。接受 SCT 的 19 名患者中有 6 名复发，其中 4 名需要第二次 SCT。4 名复发患者和 6 名移植相关毒性患者死亡。9 名患者在 SCT 后仍接受长期随访。
BCR：：ABL1 阳性 B-ALL 亚组之间的诊断平均年龄相当：p190 Ph+ ALL 患者为 29.3 岁，p210 CML-BP 患者为 36.3 岁。初始血细胞计数显示，与 CML-BP 组相比，Ph+ ALL 组的平均白细胞水平显着降低（17,358/μL vs. 129,711/μL，p = 0.01）。在前体左移、母细胞优势、血红蛋白水平或血小板计数方面，两组之间没有发现显着差异。“从头”Ph+ ALL 组的总生存期（OS）为 62.4%，CML-BP 组为 56.2%（HR 0.701,95%CI 0.2098–2.226，p = 0.53）。 “从头”Ph+ ALL 组和 CML-BP 组之间的无事件生存率和复发率相当。由于没有发现其他显着差异，因此将患者作为单个费城染色体阳性 B-ALL 组 （Ph+ ALL） 进行集体分析。
在本系列中，与其他 B-ALL 病例一样，Ph+ ALL 患者主要表现出典型的常见前 B 细胞免疫表型（CD19 和 CD10 阳性，细胞质 IgM 阴性）。然而，4 例 CD10 表达较弱或异质。
在几乎所有 Ph+ ALL 病例 （96.3%） 中观察到 CD34 强表达，而其他 B-ALL 患者的这一比例为 48.8%。相反，大多数 Ph+ 患者的 CD38 表达呈阴性或暗淡（22.2% CD38 阳性），而其他 B-ALL 病例的表达为 62%。结果，Ph+ ALL 患者 （77.7%） 的 CD34++CD38-/dim 原始细胞模式明显高于其他 B-ALL 病例 （20.2%，p < 0.0001）。
图 2 显示了遗传改变和成熟表型之间相关性的热图，显示了 CD34++CD38-/dim 表达模式与 BCR：：ABL1 阳性 B-ALL 病例的强关联。
热图说明了遗传改变和成熟表型之间的相关性，强调表达模式 CD34++CD38−/dim 与BCR：：ABL1 阳性 B-ALL 病例和 CD34+CD38+ 与超二倍体的显着关联。
尽管BCR：：ABL1 阳性 B-ALL 与任何特定标志物无关（p = 0.34），但该系列中的所有病例都表现出至少一种白血病相关免疫表型（LAIP），适合通过流式细胞术监测 MRD。
评估了 20 名患者 （74%） 的 CD66c 表达，其中 14 名 （70%） 显示 CD66c 阳性，6 名 （30%） 显示呈阴性表达。在 17 名患者 （63%） 中评估了标志物 CD73 和 CD304。该组 8 例（47%）CD66c+/CD73+双阳性，CD304 阴性，其余 8 例 CD66c+/CD73+/CD304+三阳性。此外，9 例（53%）CD66c+/CD304+双阳性，CD73−表达。CD123 检测 26 例（93%），阳性或微阳性 19 例（73%）。
值得注意的是，CD66c 表达阴性的 6 名患者表现出 CD73 和/或 CD304 的强烈阳性，确保所有费城染色体阳性病例都表达了适合流式细胞术 MRD 监测的抗原。
在检测 3 个标志物（CD66c、CD304 和 CD73）的病例中，17 例 Ph+病例中有 8 例（47.0%），58 例非 Ph+病例中有 25 例（43.1%）对所有 3 个标志物均呈阳性，两组间差异无统计学意义。图 3 说明了 CD73+和 CD34+CD38−/dim 淋巴母细胞的代表性病例。
代表性的 MRD 流式细胞术图和 APS1 视图显示淋巴母细胞（红色）表现出表型 CD10++、CD20 阴性、CD34+、CD38-/dim、CD66c/CD123 阴性和 CD73/CD304++。在 BV605 荧光染料上证实了 CD73 的阳性。APS 视图显示原始细胞（红色）、成熟 B 细胞（蓝色）和 B 细胞前体（绿色）之间的明显区别。
显示了费城染色体阳性病例与其他 B-ALL 遗传亚型之间观察到的免疫表型差异。
2.4.3. Ph+ ALL 与其他 B-ALL 病例的比较
在 B-ALL 对照队列中，正常核型与 CD66c+ 表达呈正相关 （p = 0.006），而其他遗传异常与特定 LAIP 无显着关联 （p = 0.076）。
在确诊遗传异常的病例中，TEL：：AML1 与 CD73+和 CD73+/CD304+表达显著相关（p = 0.002）;E2A：:P BX1 与 CD73+表达有关（p < 0.001）;和超二倍体核型与 2 个或 3 个标志物的阳性相关（CD66c+CD73+CD304+，p = 0.05）。相比之下，KMT2A 重排与包括 CD10（Pro-B ALL 表型）在内的标志物的丢失相关，并且与 CD66c、CD73 和 CD304 阳性呈负相关。
与BCR：：ABL1 阳性 B-ALL 患者相比，非 Ph+ B-ALL 患者的 CD66c+/CD73+（56.9% vs. 94.0%）、CD66c+/CD304+（6.9% vs. 58.8%）和 CD73+/CD304+（15.5% vs. 75.5%）的双阳性率显著降低（p < 0.001）。
图 4 使用热图说明了遗传改变与白血病相关免疫表型之间的相关性。
热图说明了遗传改变和 LAIP 表型之间的相关性，显示 CD66c+ 和 CD304+ 与BCR：：ABL1 病例之间可能存在关联。
2.5. 费城染色体阳性病例 FCM-MRD 与 PCR-MRD 的相关性
使用 RQ-PCR 和流式细胞术同时分析了 19 个诊断样本和 90 个随访样本。在研究的 109 个样本中，RQ-PCR 和 FCM 在 91 个病例中提供了一致的定性结果，导致 88% 的病例结果一致（Kappa = 0.761，p < 0.001）。
定量比较显示，FCM-MRD 检测到的原始细胞百分比与 RQ-PCR 测量的转录本数量（BCR：：ABL1/ABL 比值）之间存在显著相关性[31]。Pearson 相关性（r = 0.7801;95% CI：0.69–0.84，p < 0.001）和 Spearman 相关性（r = 0.8618;95% CI：0.802–0.9045，p < 0.001）均具有统计学意义，如图 5 所示。
散点图显示多参数流式细胞术（MFC） 检测到的原始细胞百分比与 BCR：：ABL1 转录本之间的相关性。显示 PCR-MRD 和 FCM-MRD 之间差异病例数的直方图。流式细胞术图和 APS 视图来自对差异 FCM-MRD-/PCR-MRD+ 病例的重新分析，显示 70 个细胞事件 CD34+、CD38dim、CD304/CD73+、CD10++，被认为是原始细胞（粉红色）;APS1 视图可以很好地区分成熟（绿色）和前体 B 细胞（蓝色）。
2.5.1 FCM-MRD 灵敏度与 PCR-MRD 相比
与 RQ-PCR 转录本分析相比，流式细胞术对原始细胞检测的灵敏度为 78.9%（95%CI：66.1–88.6%），特异性为 98.8%（95%CI：89.7–99.9%）。同样，阳性预测值为 97.8% （95% CI： 88.5–99.9%），阴性预测值达到 80.9% （95% CI： 69.1–89.7%）。
在 52 份 PCR-MRD 阴性样本中，51 份（98.1%）也为 FCM-MRD 阴性。对于 MRD 阳性样本，与 RQ-PCR 相比，FCM 的检出率为 78.9%（57 个样本中的 45 个）。在 PCR-MRD 阳性率为 >0.01% 的情况下，FCM 可靠地检测到 82.9%（47 个样本中的 39 个）中的所有细胞。
考虑到结果不一致，12 例 PCR-MRD 阳性，但 FCM-MRD 阴性，1 个样本中流式细胞术检测到 MRD，但 RQ-PCR 未检测到。使用 RQ-PCR 检测样品呈阳性，转录水平在极低表达水平下检测到，MRD 指数范围为 0.007-0.105（中位数为 0.085）。
在审查了差异病例后，在高灵敏度流式细胞术测试中三个样品中没有检测到原始细胞（采集了 10,000,000 个事件），RQ-PCR 检测到 e14a2 转录本，但未定量，水平低于检测限 （LoD < 0.0001%）。在其中一个样本中，流式细胞术修订版检测到 0.0007%的原始细胞（10,000,000 例中有 70 个细胞事件），这些原始细胞在初始 FCM-MRD 报告中未考虑（见图 5）。
其他 8 个不一致的样品在 FCM 中的细胞事件不足，无法满足检测 MRD 低于 0.01%的 LoD 和 LLoQ 阈值。在项目的第一年收集了九个样本中的八个，在全面引入批量裂解和标准化的 FCM-MRD 方案之前。FCM 发现 0.07% 的白血病原始细胞且 PCR-MRD 为阴性的差异样本随后在两份连续报告中为 FCM-MRD 阴性。
大多数具有 p190 （e1a2） 转录本的病例在治疗或骨髓移植后达到 PCR-MRD 阴性。在具有多种 BCR：：ABL1 转录物类型的患者中，p190 （e1a2） 转录物通常在 p210 亚型后治疗之前被清除。在分析的 6 例病例中，p190 在 5 例中首先清除，而在 1 例中，p210 在 p190 之前消失。
显示了箱线图，显示了 Ph+ 组和 Ph 阴性 ALL 的每个 MRD 时间点的分布。这些图显示了它们的分布和集中趋势的交集和差异，但组间没有显着性（d15 p = 0.273;d33 = 0.099;d90 = 0.483）。
总结
高灵敏度 FCM-MRD 表现出与 PCR-MRD 相当的性能，凸显了其作为 B 细胞急性白血病 MRD 评估的可靠和补充工具的实用性。此外，所采用的免疫表型策略显示出高特异性，淋巴细胞一致表达已建立的白血病相关标志物和独特的 CD34++CD38−/dim 表达谱。这种模式可能反映了该高风险亚组中的特征性异常表型，为费城染色体阳性 B 细胞急性白血病的生物学和临床行为提供了宝贵的见解。有必要进行进一步的研究，涉及更大的队列和标准化方案，以验证和扩展这些结果 。
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