虽然线粒体自噬或自噬缺乏会导致退行性疾病，但脂肪细胞中基本自噬基因的缺失却会降低体重。棕色脂肪组织（Brownadipose tissue，BAT）在体重调节和代谢控制中起着重要作用。然而，维持BAT功能的关键细胞机制仍不清楚。在该研究中，发现一种与帕金森疾病相关，并参与小鼠选择性线粒体自噬的基因pink1的整体或棕色脂肪细胞特异性缺失，会诱发小鼠BAT功能障碍和肥胖。线粒体功能缺陷是激活NLRP3炎症小体的上游信号之一。在pink1基因敲除（knockout，KO）小鼠的棕色脂肪细胞前体（Brownadipocyte precursors，BAPs）中诱导NLRP3。出乎意料的是，NLRP3诱导并没有引发典型的炎症反应。相反，NLRP3诱导通过增加白色脂肪细胞特异性基因的表达和抑制棕色脂肪细胞特异性基因的表达，导致pink1 KO BAPs分化为白色脂肪细胞。在pink1基因敲除小鼠中nlrp3缺失逆转了BAT的功能障碍。相反，脂肪组织特异性atg7 KO小鼠的BAT中Nlrp3的表达明显降低。总的来说，该研究的数据表明线粒体自噬在调节脂肪组织和全身能量方面的作用不同于一般的自噬新陈代谢。该研究发现了一个新的线粒体-NLRP3途径导致BAT功能障碍。nlrp3基因敲除能够消除BAT功能障碍，这表明nlrp3的转录功能是一个意想不到的，但却是肥胖相关代谢疾病的一个非常特殊的治疗靶点。
Fig.1 pink1 KO小鼠的能量消耗减少。（A）用RD（regular diet）或HFD（high-fat diet）喂养的pink1 KO（pink1）小鼠和WT（wild-type）同窝小鼠的体重（n= 13）。（B）每只小鼠平均每日的食物摄入量（n = 13）。（C-F）pink1 KO小鼠的EE（energy expenditure）降低。（C）耗氧量和二氧化碳产量（n=8）。（D）EE的计算为（3.815+1.232×RER）×VO2 /瘦质量（n=8）。（E）RER和（F）运动行为（n=8）。数据均以M ± SD表示，（D）采用学生双尾非配对t检验（Student’s two-tailedunpaired t-test）进行数据分析,（A-C、E 和F）采用单因素重复测量方差分析（one-wayrepeatedmeasures ANOVA）进行数据分析，** 表示p < 0.01，***表示p< 0.001。
Fig.2 pink1 KO小鼠的胰岛素抵抗。（A）pink1 KO小鼠（n= 6）的空腹血糖、胰岛素和游离脂肪酸（FreeFatty Acid，FFA）水平。（B）高胰岛素-正葡萄糖钳夹研究中的葡萄糖输注率（Glucose infusion rate，GIR）（n = 7）。（C）80至120分钟（n= 7）的平均GIR值。（D）胰岛素耐量测验（insulintolerance test，ITT）（n= 7）。（E）ITT的葡萄糖消失率（kITT；%/min）（n=7）。数据均以M ± SD表示，（A、C和E）采用学生双尾非配对t检验（Student’s two-tailedunpaired t-test）进行数据分析，（B、D）采用单因素重复测量方差分析（one-wayrepeatedmeasures ANOVA）进行数据分析，*表示p< 0.05，** 表示p < 0.01。
Fig.3 pink1 KO小鼠棕色脂肪功能障碍。（A、B）H&E染色的BAT切片，比例尺为50µm。（A）用Image J测量16周龄小鼠H&E切片脂肪细胞的平均大小。（B）对于每只小鼠，随机选择H&E切片的10个区域进行分析（n= 4）。（C和D）BAT透射电子显微图像显示pink1 KO小鼠（n=4）线粒体基质膨胀和线粒体嵴紊乱，比例尺为1µm。（D）用Image J对随机抽取的4只小鼠的10幅图像进行TEM图像的形态计量分析。（E）来自3个独立实验的BAT中UCP1蛋白的代表性westernblot图像（左图）。在每个胶孔中蛋白质的量均为30μg，检测UCP1和ACTB的曝光时间均为30s，详见补充材料的图S3。用Image J对UCP1的强度进行定量分析，并与ACTB进行比较（右图）。（F）小鼠在室温（RT）下和暴露于4°C下6小时（n=7）后的体温。（G）棕色脂肪细胞特异基因的mRNA表达（n=6）。数据均以M ± SD表示，（B）采用具有Bonferroni校正的单因素方差分析（One-way ANOVA with Bonferronicorrection）进行数据分析，（D-G）采用学生双尾非配对t检验（Student’stwo-tailed unpaired t-test）进行数据分析。与WT组比较，*表示p< 0.05，** 表示p < 0.01，***表示p< 0.001；与RD组比较，#表示p< 0.05，##表示p < 0.01，###表示p< 0.001。
Fig.4 ADRB3激动剂对腹股沟WAT（iWAT）产热基因诱导的影响。8周龄雄性WT和pink1 ko小鼠每日腹腔注射CL-316,243（CL），连续注射3天。（A）iWAT的H&E染色图像。比例尺为50µm（n=4）。用Image J测量16周龄小鼠H&E切片脂肪细胞的平均大小。（B）每只小鼠随机选择H&E染色图像的10个区域进行分析。（C）UCP1阳性的脂肪细胞免疫组化染色图像，箭头表示iWAT中的UCP1染色。比例尺为50µm（n=4）。（D）Ucp1和产热基因表达的柱状图（n=6）。数据均以M ± SD表示，（B）采用具有Bonferroni校正的单因素方差分析（One-way ANOVA with Bonferronicorrection）进行数据分析，（D）采用学生双尾非配对t检验（Student’stwo-tailed unpaired t-test）进行数据分析。CL治疗小鼠与CL未治疗小鼠相比，*表示p<0.05，ns表示无显著性差异。
Fig.5 pink1 KO的棕色脂肪细胞前体（Brownadipocyte precursors ，BAPs）无法分化为棕色脂肪细胞。（A-C）从WT和pink1 KO小鼠的肩胛间的BAT基质血管中获得的部分BAPs可分化为棕色脂肪细胞。分化7天后，固定脂肪细胞，并用油红O染色液将脂滴染色。（A）相位对比图像。比例尺为50µm（n=4）。（B、C）分化的棕色脂肪细胞采用油红O染色液染色的显微图像。用Image J测量脂滴面积，在每张图像中选取10-12个区域进行分析，绘制柱状图。比例尺为10µm（n=4）。（D、E）分化的棕色脂肪细胞（n=6）中棕色脂肪细胞特异性基因（D）和白色脂肪细胞特异性基因（E）的mRNA表达水平的柱状图。（F）采用mt-Keima方法估计WT和pink1 KO BAPs的线粒体自噬能力。用Image J（n=9）测定mt-Keima染色（458nm）和线粒体与溶酶体融合（561nm）的荧光强度比值。（G）使用线粒体超氧化物探针MitoSoxRed通过流式细胞术测量线粒体的活性氧（ROS），并定量分析MitoSox红色荧光强度（n= 5）。数据均以M ± SD表示，（C-G）采用学生双尾非配对t检验（Student’stwo-tailed unpaired t-test）进行数据分析。*表示p< 0.05，** 表示p < 0.01，***表示p< 0.001。
Fig.6 pink1 KO BAPs中NLRP3表达增加与炎症小体激活无关。（A）显示了来自3个独立实验的WT和pink1 KO小鼠BAPs中NLRP3的mRNA表达水平（n=6）和（B）具有代表性的western blot图像及柱状图。每个胶孔中蛋白质的量均为10μg，检测NLRP3和ACTB的曝光时间均为2min，详见补充材料图S5A。使用Image J对NLRP3的水平进行定量分析，并与ACTB进行比较。（C）裂解的CASP1的免疫印迹，用ATP（5mM，30分钟）刺激来自WT或pink1 KO小鼠的LPS-primed（100ng/ml，4h）BAPs和BMDMs。图像显示了来自3个重复的独立实验的代表性印迹图像。（D）每个胶孔中蛋白质的量均为10μg，检测BAPs中CASP1和ACTB的曝光时间分别为5min和2min。详见补充材料图S5B和S5D。（E）BMDMs中pro-CASP1、裂解CASP1和ACTB的曝光时间分别为30s、30min和30s。详见图补充材料图S5C和S5E。（F）酶联免疫吸附法（ELISA）测定LPS和ATP处理后上清液中IL1B的水平（n=6）。数据均以M ± SD表示，采用学生双尾非配对t检验（Student’stwo-tailed unpaired t-test）进行数据分析。*表示p< 0.05，** 表示p <0.01，***表示p< 0.001，ns表示无显著性差异。
Fig.7 pink1 KO小鼠BAPs中Nlrp3的增加可转录激活白色脂肪细胞分化。（A、B）NLRP3与Cebpa启动子区域的结合。采用染色质免疫共沉淀（ChIP）技术测定Cebpa启动子的nt-374-365区域中的NLRP3结合位点。ChIP检测采用未分化或分化5天后的BAPs。（C、D）野生型BAPs中Nlrp3过表达对Nlrp3、白色脂肪细胞（C）和棕色脂肪细胞特异性标记物（D）表达的影响。用携带Nlrp3或对照载体（Con）的慢病毒转染BAPs，分化7天后获得BAPs（n=6）。（E-H）通过Pink1在pink1 KO BAPs中过度表达来挽救线粒体自噬。用慢病毒将pink1 KO BAP转染为pink1（pink1–Pink1）或对照载体（pink1-Con）。（E）采用mt-Keima法评估线粒体自噬。用Image J（n=4）测定mt-Keima染色（458nm）和线粒体与溶酶体融合（561nm）的荧光强度比值。（F-H）Nlrp3（F），白色脂肪细胞标志物（G）和棕色脂肪细胞（H）的mRNA表达水平（n= 6）。数据均以M ± SD表示，（B-E）采用学生双尾非配对t检验（Student’stwo-tailed unpaired t-test）进行数据分析，（F-H）具有Bonferroni校正的单因素方差分析（One-way ANOVA with Bonferronicorrection）进行数据分析，与WTBAPs组进行比较， *表示p < 0.05，**表示p< 0.01；与pink1 KO BAPs组进行比较，# 表示p < 0.05。
Fig.8 在pink/ nlrp3 double-KO小鼠中，pink1 KO小鼠的BAT变化被逆转。（A-D）每组八周大的雄性小鼠RD喂养8周。pink1/nlrp3 double-KO小鼠（pink1 nlrp3）（n= 4）中BAT的气体交换情况（A）和H&E染色图像（B）。比例尺为50µm。（C）pink1 KO和pink1/nlrp3 double-KO小鼠的BAT的代表性透射电子显微图像，bar为1μm。（D）BAT中BAT特定基因的mRNA表达水平（n= 6）。（E）对pink1 casp1double-KO（pink1 casp1）小鼠（n= 4）的BAT进行H＆E染色，比例尺为50µm。数据均以M ± SD表示，（A）采用具有Bonferroni校正的单因素方差分析（One-way ANOVA with Bonferroni correction）进行数据分析，（D）采用具有Bonferroni校正的单因素方差分析（one-way ANOVA with Bonferroni correction）进行数据分析。与WT组进行比较，** 表示p< 0.01，***表示p < 0.001；与pink1 KO小鼠组进行比较，#表示p< 0.01。（F、G）在pink1 nlrp3 KO BAPs中将分化缺陷逆转为成熟的棕色脂肪细胞。（F）从pink1 nlrp3 double-KO小鼠（n = 4）获得的分化的棕色脂肪细胞中形态变化逆转的相差显微镜图像（上）和油红O染色图像（下）。图像为分化7天后采集，比例尺为5 µm（相差显微镜）和50 µm（油红O染色）。（G）BAPs中BAT标记的mRNA表达水平（n = 6）。数据均以M ± SD表示，采用具有Bonferroni校正的单因素方差分析（one-way ANOVA with Bonferroni correction）进行数据分析，与WT BAPs组进行比较，** 表示p < 0.01；与pink1 KO BAPs组进行比较，#表示p< 0.01。
Fig.9 棕色脂肪细胞中的Pink1缺乏症诱发棕色脂肪功能障碍。（A）pink1 KO小鼠（n = 4）的棕色脂肪特异性（pink1 f / fUcp1-Cre）或骨髓细胞特异性（pink1 f/f-Lyz2-Cre）的O2消耗和CO2产生。（B）pink1 f/f Ucp1-Cre pink1 KO小鼠和pink1 f/f小鼠的能量消耗(n = 4)。（C）BAT的H＆E染色图像，比例尺为50 µm（n = 4）。（D）棕色脂肪特异基因的mRNA表达水平（n=4）。（E）pink1 f/f Ucp1-Cre pink1 KO小鼠和pink1 f/f小鼠在室温及4°C暴露6h后的体温（n = 4）。（F、G）pink1 f/fUcp1-Cre pink1 KO小鼠和pink1 f/f小鼠的ITT（F）和ITT的葡萄糖消失率（kITT，%/min）（G）。数据均以M ± SD表示，（A、F）采用单因素重复测量方差分析（One-way repeated-measures ANOVA）进行数据分析，（C）采用具有Bonferroni校正的单因素方差分析（one-way ANOVA with Bonferroni correction）进行数据分析，（B、D、E和G）采用学生双尾非配对t检验（Student’s two-tailed unpaired t-test）进行数据分析，与pink1f/f组进行比较，*表示p< 0.05，** 表示p < 0.01，***表示p< 0.001；与pink1 f/f Ucp1-Cre组进行比较，# 表示p < 0.05，##表示p< 0.01，ns表示无显著性差异。
本文以题为“Mitophagy deficiencyin creases NLRP3 to induce brown fat dysfunction in mice”于2020年5月发布在期刊AUTOPHAGY上。
论文链接：https://www./doi/full/10.1080/15548627.2020.1753002
文中在测定正常饮食组（regulardiet，RD）或高脂肪饮食组（high-fatdiet，HFD）的小鼠体成分（TBW、TBFW、TBLW）的部分使用了韩国OsteoSys 公司的iNSiGHT VET DXA小动物双能X射线骨密度及体成分分析仪（但相应图像在图中未展示），该设备主要用于对活体麻醉状态下的体重在10-500g的实验动物或者离体的软组织、骨骼等进行高分辨率的X光成像。同时得到相应的BMC，BMD，FAT，Lean，骨体积等数值，以及相应指标的百分比含量值。
设备主要特点：
1. 可分析大小不同的模式动物大鼠、小鼠或中小型动物（如鸡、鱼、兔子等）的骨密度和体成分，扫描区域面积为16.5cm×25.5cm。同时除了大鼠、小鼠测量模式外，还提供骨骼模式，可以准确测量离体组织的骨密度。
大鼠骨密度的测量
离体组织骨密度的测量
大鼠体成分测量图像（红色表示脂肪）
2. iNSiGHT VET DXA采用锥形束扫描技术和高性能平板探测器，可实现快速扫描（25s），大幅缩短实验时间，降低人力成本。
3. iNSiGHT VET DXA小动物双能X射线骨密度及体成分分析仪提供高精准度数据（R²＞0.9，CV＜1%）。
4. 高分辨率图像（最大可进行4倍变焦，图像的高分辨率达到31μm）。
用iNSiGHT VET DXA获得的高清分辨率图像
5. 软件操作简单，可提供整体动物以及多个ROI数据分析。
iNSiGHT VET DXA软件分析界面
6. 可实现长时间动态分析，在纵向研究中，软件可对同组数据进行趋势分析。
ROI历史趋势分析
7. 多种数据输出格式（Excel和Tiff等），便于图像编辑和数据分析。
iNSiGHT VET DXA小动物双能X射线骨密度及体成分分析仪，已在以下领域有所应用，并在不断扩充中：
1.新药研究
2.肥胖研究
3.关节疾病、类风湿研究
4.内分泌、糖尿病、代谢疾病研究
5.食品安全领域
#artContent h1{font-size:16px;font-weight: 400;}#artContent p img{float:none !important;}#artContent table{width:100% !important;}