衰老导致毛囊细胞外基质（ECM）发生显著变化，对头发生长产生深远影响。毛乳头（DP）的ECM是毛发生长的主要调节器，在衰老过程中如何变化在很大程度上仍然未知。重庆大学雷明星教授团队的研究推进了人们对DP ECM如何影响毛囊生长的理解，并为通过应用低温治疗来解决衰老过程中的脱发等问题提供了潜在的途径。通过调节ECM成分来减缓毛囊的老化过程可能为持续的毛囊生长和预防不必要的脱发提供临床指导。
衰老的特征是组织完整性逐渐丧失，导致生物功能受损、对疾病的易感性增加，并最终死亡。衰老对皮肤的影响特别突出，皮肤附属物如毛囊的丧失。毛囊是研究衰老的良好模型，毛发稀疏、脱落、毛发灰白以及毛囊萎缩是毛囊细胞衰老的常见表现。这些在很大程度上与毛囊干细胞（HFSC）的改变有关，特别是毛乳头（DP）。
DP在毛囊的发育、生长、周期和老化过程中受到过多分子信号的影响。HFSC的自我更新和活化能力反映的毛囊老化是由内在和外在因素的积累决定的。内在因素，如表观遗传景观，干性决定因素和生化信号的仔细平衡都有助于衰老期间头发周期和生长的改变。外在因素，如细胞外基质（ECM）也可以对毛囊稳态和毛发生长产生深远的影响。ECM分子的受控释放可以在体内和体外有效地激活HFSC，从而增强毛囊再生。然而，ECM组分的消耗，可以将HFSC分化重新引导到表皮谱系中，导致毛囊萎缩和衰老期间的损失。此外，ECM也可以调节终末或毫毛的形成，较厚的末端毛囊的ECM更丰富。然而,尽管近年来毛囊衰老研究取得了前所未有的进展，但衰老过程中DP ECM的改变如何影响毛囊生长仍然难以捉摸。
除了毛囊微环境的外在因素外，外部环境中外部因素的变化也有助于毛发生长和周期的调节。例如，人类的毛发脱落和周期表现出明显的季节性模式。与环境温度相对较低的春季和冬季相比，环境温度较高的夏季会脱落更多的毛发，生长期的毛囊数量更多。那么，温度可以调节皮肤老化过程中的毛发生长吗？
1、毛囊老化过程中DP-HM连接处THSD4表达减少
比较年轻和衰老小鼠触须和人类头皮毛囊的毛球中整体胶原蛋白含量发现，年轻和年老毛囊的DP区域的Herovici染色呈现蓝色，表明大部分是未成熟的胶原蛋白；内部ECM在年轻卵泡中广泛分布，在老年卵泡中显著减少（图1A）。与年轻毛囊相比，具有较小DP面积和胶原蛋白含量的老化毛囊显示出显著较低的生长速率（图1B），说明DP含量的变化影响了毛囊在体外的生长能力。然后，对年轻和老年小鼠触须毛囊进行批量RNA-seq，通过加权基因共表达网络分析，将年轻和老化卵泡中的差异表达基因与DP ECM相关基因重叠，共发现39个基因，其中Igfbp2、THSD4和Col3a1排名最高，小鼠皮肤和人头皮毛囊的RNA-seq数据进一步证实了这一结果（图1C和D）。这表明THSD4表达对毛囊衰老有很强的影响。接下来，对年轻和老年皮肤样本进行scRNA-seq分析，使用特征性基因标记物在年轻和老年皮肤中发现了15个不同的细胞簇（图1E）。仅在年轻卵泡的DP细胞簇中检测到THSD4的表达，因为它在老化过程中显著下调（图1F）。人和小鼠毛囊的IF染色证实了THSD4随着衰老而显著下降；此外，在DP-HM连接的较低区域中检测到THSD4（图1G-I），表明THSD4在介导上皮-间充质相互作用（EMI）中的潜在功能作用，这对毛发生长至关重要。
图1 THSD4表达随年龄增长而减少
2、THSD4通过诱导毛发基质细胞增殖促进毛发生长
使用慢病毒载体将sh-Thsd4递送到年轻小鼠（3M）的背部皮肤毛囊中，以评估其功能影响。Western Blotting和qRT-PCR表明慢病毒感染和shRNA有效负载递送成功，sh-Thsd4导致THSD4表达显著降低（图2A）。在对照组中，毛囊到达皮下脂肪层；而Thsd4敲除组中的毛囊显著较短，并保持在生长期的早期阶段；此外，Thsd4敲除还减少了DP和毛发基质区域中Lef1和PCNA阳性细胞的数量（图2B）。另一方面，将其重组蛋白（rTHSD4）注射到老年小鼠（24M）的背部皮肤后，rTHSD4的补充导致卵泡生长以及DP和基质细胞的Lef1和PCNA表达增加（图2C）。这表明THSD4通过调节HM细胞增殖促进毛囊生长。然后，使用离体小鼠触须和人类头皮和毛囊的器官培养。在小鼠和人离体毛囊中，siThsd4导致相似或更短的毛干，而rTHSD4显著增加了毛干长度（图2D和E）。IF染色显示Thsd4敲低后PCNA阳性细胞的数量显著减少，而rTHSD4处理后这些细胞的数量显著增加（图2F）。这进一步表明DP分泌的THSD4通过促进HM细胞的增殖来增强毛囊生长。
图2 THSD4通过诱导DP细胞增殖促进毛发生成。
3、THSD4增强上皮细胞和间充质细胞之间的相互作用
毛囊的生长是由上皮细胞和间充质细胞之间的相互作用引发的。该研究建立了类器官培养系统模拟上皮-间充质的相互作用。从小鼠皮肤类器官的scRNA-seq数据中分离表皮和真皮细胞并预测它们的相互作用。使用指定的特异性基因标记物鉴定了2个上皮细胞组（SBC和BC）和5个真皮细胞组（FB1-4和pDC（DP前体））（图3A）。使用皮肤类器官的前体细胞pDC进行CellChat和CellCall分析，结果显示pDC和真皮细胞（FB1-3）以及代表上皮细胞的SBC和BC组之间的相互作用的显著数量和强度，并且老化后细胞间相互作用的数量和强度降低（图3B和C）。接下来，使用皮肤类器官培养进一步验证。新生儿皮肤类器官中的表皮细胞聚集体更大且更紧凑，真皮细胞的外周粘附增加，而成人皮肤类器官中的表皮细胞聚集体更小，外周真皮细胞更少且分散（图3D）。新生皮肤类器官中表达THSD4（图3E），特别是在邻近表皮聚集体的真皮细胞中。这表明皮肤类器官可以用作研究THSD4功能作用的体外模型。
在新生皮肤类器官中，THSD4敲低显著减少了表皮周围真皮细胞的层数（图4A）。然而，rTHSD4处理成人皮肤类器官后，表皮聚集体周围的真皮细胞层数量显著增加（图4B）。这些结果表明，THSD4促进了表皮和真皮细胞之间的相互作用。接下来，使用PCNA和P63作为新生儿和成人皮肤类器官中THSD4调节后的各自标志物来评估表皮细胞增殖和干性。THSD4敲低导致新生儿皮肤类器官中PCNA和P63阳性细胞的数量急剧减少，rTHSD4处理显著增加了新生儿和成人皮肤类器官中PCNA和P63阳性细胞的数量（图4C-F）。此外，用THSD4敲低的新生皮肤类器官移植的裸鼠产生显著更少的毛发，而在移植后，rTHSD4处理的成年皮肤类器官中产生显著更多的毛发（图4G和H）。rTHSD4还增加了在人诱导多能干细胞衍生的皮肤类器官中形成的卵泡数量（图4I）。总之，THSD4在调节上皮-间充质相互作用中的潜在作用，这是年轻和老化毛囊中头发生长所必需的。
图3 皮肤类器官的ScRNA-seq分析预测表皮-真皮相互作用。
图4 THSD4增强表皮和真皮之间的粘附。
4、SDC4诱导THSD4表达以促进毛发生长
使用年轻和老年小鼠皮肤毛囊的scRNA-seq数据再次进行CellChat分析，以鉴定DP中THSD4的潜在上游调节因子。由于HM和DP的潜在相互作用，将重点放在HM和DP隔室上。与老年毛囊相比，年轻毛囊中的HM-DP相互作用更强，并且信号转导Ptn（HM）至Sdc4（DP）是仅在年轻毛囊中富集的最突出的配体/受体对之一（图5A和B）。Sdc 4表现出与THSD4相似的表达模式，使得其在年轻毛囊的DP中高度表达，但在老化时显著下调（图5C）。在新生儿皮肤类器官细胞中添加重组SDC4（rSDC4）上调THSD4表达，并增加新生儿和成人皮肤类器官中粘附于表皮的真皮细胞层的数量（图5D和E）,表明上皮-间充质相互作用增强。在新生儿和成人皮肤类器官中也检测到更大量的PCNA和P63阳性细胞，表明增殖能力增加（图5F）。体内研究显示，在裸鼠中移植后，单独的rSDC4处理导致从成人皮肤类器官的显著毛发再生（图5G）。总的来说，SDC4可能通过上调毛囊DP中的THSD4介导毛发再生。
图5 毛基质和DP之间的相互作用通过SDC4驱动THSD4表达
5、THSD4通过上调CXCL 1刺激毛发生长
使用scRNA-seq数据，首先鉴定了年轻和老年毛囊DP中的THSD4阳性细胞（图6A），然后进行KEGG通路分析，这导致基于老化的不同富集谱（图6B）。年轻毛囊的途径中脂质代谢和动脉粥样硬化排名最高，而且编码趋化因子（C-X-C基序）配体1的Cxcl1是在该途径中的候选基因之一（图6B）。接下来进一步探索Cxcl1。首先评估了THSD4调节后小鼠背部皮肤中XCL1水平的变化。小鼠背部皮肤毛囊样品的免疫荧光标记显示，THSD4沉默后Cxcl1下调，rTHSD4处理后Cxcl1上调,特别是在HM-DP连接区（图6C）。这也在新生儿皮肤类器官中得到了证实,添加rTHSD4导致表皮聚集体周围真皮细胞中CXCL1表达增加（图6D和E）.此外，在成人皮肤类器官中加入外源性CXCL 1（rCXCL1）,真皮和表皮边界周围层粘连蛋白（Lama）和Col XVII（Col17a1）表达增加,导致基底膜完整性改善（图6F）,表明上皮-间质相互作用增加。在移植到成年小鼠中后,rCXCL1处理的成年细胞皮肤类器官有显著的毛发生长，而在对照小鼠中没有观察到毛发生长（图6G）这些发现证明THSD4至少部分地通过上调Cxcl1来促进毛发生长。
图6 THSD4通过上调CXCL 1刺激毛发生成。
6、暴露于低温促进老化毛囊中的毛发生长
各种外部环境因素也可以改变毛囊功能和毛发生长，暴露于非冷冻低温可以通过ECM的修饰有效地改变人体组织的生理学。首先，将来自9个月大的小鼠的老化毛囊短暂暴露于各种低温（15℃-0℃）5分钟（图7A）。结果发现，5℃以下的处理（低温处理LTT）导致毛球尺寸和DP面积的显著增加（图7B和C），表明毛发生长的潜在增强。短暂暴露于低温也诱导皮肤中两种最常见类型的胶原蛋白I型和III型胶原蛋白的表达（图7D）。此外，SDC4、THSD4和CXCL1的表达也显著上调（图7E）。这表明SDC4/THSD4/CXCL 1轴是感觉反应机制的一部分，该机制将外部宏观环境信号传递给DP，DP是毛发生长的主要调节因子。进一步的IF和WB分析显示，低温处理显著增加了THSD4的表达（图7E），这表明增加的DP-HM相互作用，以及HM中的P63阳性细胞和PCNA阳性细胞，表明毛发生长增强（图7F）。这些结果首次证明了非冻结低温对毛发生长的影响，并暗示THSD4将外部宏观环境的物理线索传递给DP，进一步扩展了其功能重要性。
图7 低温促进毛发生长。
总之，该研究强调了维持DP细胞中THSD4表达对于抗衰老和增强毛发诱导作用的重要性。该研究还揭示了新的机制，导致DP细胞群的聚集和老化过程中真皮和表皮细胞之间的相互作用。尽管如此，该研究结果是证明非冷冻低温处理的毛发促进作用的第一个证据，这为其在临床上的潜在应用开辟了途径。
参考文献
Wang M, Wang M, Jiang J, Li K, Liang H, Wang N, Zou Y, Wang D, Zhou S, Tang Y, Wu W, Qiu W, Li X, Wang X, Xie Q, Xiang X, Zhou W, Yang L, Chuong CM, Lei M. THSD4 promotes hair growth by facilitating dermal papilla and hair matrix interactions. Theranostics. 2025 Feb 25;15(8):3571-3588. doi: 10.7150/thno.103221. PMID: 40093891; PMCID: PMC11905124.