摘 要：以生化黄腐酸（BFA）为原料，通过超声活化法制备黄腐酸叶面肥（ABFA），以ABFA为螯合剂，硫酸亚铁（FeSO4）为铁源、硫酸锌（ZnSO4）为锌源，制备黄腐酸螯合铁叶面肥（ABFA-Fe）、黄腐酸螯合锌叶面肥（ABFA-Zn）.在单因素实验基础上，以螯合率为指标，采用正交实验优化ABFA-Fe、ABFA-Zn最佳制备条件.通过UV-Vis、FT-IR、XPS、XRD和SEM对三种叶面肥的结构与形貌进行了表征.结果表明，ABFA-Fe的最佳制备条件为：pH=5、反应温度50 ℃、m（ABFA）∶m（FeSO4）=1∶2、反应时间60 min，螯合率59.93%；ABFA-Zn的最佳制备条件为：pH=7、反应温度30 ℃、m（ABFA）∶m（ZnSO4）=1∶2、反应时间120 min，螯合率85.93%.种植实验结果表明，ABFA-Fe、ABFA-Zn可有效提高叶片叶绿素含量，促进小油菜生长.
关键词：生化黄腐酸；黄腐酸螯合铁；黄腐酸螯合锌；螯合；叶面肥
中图分类号：TQ440.7”’ 文献标志码： A
e
0 引言
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
1.1.1 主要试剂
生化黄腐酸，武汉吉业升化工有限公司；硫酸锌、硫酸亚铁、抗坏血酸、盐酸羟胺、亚硫酸氢钠、氨水、无水乙醇，天津市天力化学试剂有限公司；苏州青小油菜菜籽，北京农科院；康朴多元微肥，德国康朴公司.
1.1.2 主要仪器
Cary5000型紫外-可见-近红外分光光度计，美国安捷伦；Vertex70型傅里叶变换红外光谱仪，德国布鲁克Bruker公司；X射线光电子能谱仪，美国Thermo；Smart Lab 9kW型X-射线衍射仪、S4800型场发射扫描电镜，日本理学.
1.2 实验方法
1.2.1 ABFA的制备
将5.0 g生化黄腐酸溶解于50 mL去离子水中，设置超声功率100 W，在超声设备中持续超声1 h将其活化，得到ABFA.
1.2.2 Fe2+抗氧化剂的选择
抗氧化剂种类的筛选，具体过程如下：取3份ABFA，每份5.0 g，加入5.0 g FeSO4，再分别加入0.5 g盐酸羟胺、抗坏血酸、亚硫酸氢钠3种抗氧化剂.用氨水调节pH为6，在60 ℃恒温振荡器中反应2 h.将反应液以3 500 r/min离心10 min，倒掉上清液，沉淀干燥称重，比较三组样品的沉淀质量，选择沉淀质量最少的作为Fe2+的抗氧化剂.
抗氧化剂用量的优化，具体过程如下：取5份ABFA，每份5.0 g，加入5.0 g FeSO4，再分别加入2%、4%、6%、8%、10%抗氧化剂，其他反应条件同上，考察不同抗氧化剂添加量对沉淀质量的影响，选择沉淀质量最少的抗氧化剂添加比例进行ABFA-Fe的制备.
1.2.3 ABFA-Fe、ABFA-Zn的制备
ABFA-Fe的制备方法：将5.0 g ABFA溶解于50 mL去离子水中，加入7.5 g FeSO4，再加入一定量抗氧化剂，氨水调节pH为5，在50 ℃下搅拌反应90 min.反应结束后，将反应液以3 500 r/min离心10 min，取上清液，倒入4倍量无水乙醇中沉淀2 h，抽滤得到深棕色粉末，用无水乙醇冲洗3次，在60 ℃烘箱中干燥12 h，得到ABFA-Fe.
ABFA-Zn的制备方法：将5.0 g ABFA溶解于50 mL去离子水中，加入10 g ZnSO4，氨水调节pH为6，在40 ℃下搅拌反应120 min.反应结束后，将反应液倒入4倍量无水乙醇中沉淀2 h，抽滤得到淡黄色粉末，用无水乙醇冲洗3次，在60 ℃烘箱中干燥12 h，得到ABFA-Zn.
采用单因素实验分别对ABFA- Fe和ABFA-Zn的制备影响因素：m（ABFA）∶m（FeSO4）、m（ABFA）∶m（ZnSO4）、反应pH、反应时间、反应温度进行优化.Fe2+的螯合率采用邻菲罗啉法进行测定，Zn2+的螯合率采用EDTA滴定法进行测定［24，25］.
在单因素实验基础上，采用四因素三水平正交实验设计，考察不同因素对于螯合率的影响，确定最佳反应条件，方差采用SPSS软件分析.
1.3 种植实验
1.3.1 种植方法
取直径15 cm、高10 cm的种植盆若干，每盆放置1 kg土壤，土壤来自陕西科技大学种植园.取若干小油菜种子置于250 mL锥形瓶中，在25 ℃恒温恒湿培养箱中培养72 h，每间隔24 h，换水一次.选取生长程度接近的小油菜苗，进行移栽，保持3 cm间距，在陕西科技大学植物培养间进行培养，设置环境条件：温度25 ℃～28 ℃，湿度50 %～60%.将ABFA-Fe、ABFA-Zn每个正交实验样本取样0.5 g，设置三组对照组：①ABFA、②市售肥（康朴多元微肥）、③清水（无肥料），稀释500倍后在小油菜生长期间进行叶片喷施，每周喷施一次，每次5 mL.种植期间，除喷施肥料不同，其余条件一致，培养45天后采摘，记录不同样本喷施后植株的生长数据.
1.3.2 小油菜叶片叶绿素含量测定
叶绿素提取剂的配制：将无水乙醇与丙酮按照V∶V=1∶1进行混合，配好的提取剂在室温干燥处密封保存.
叶绿素的提取：将采摘的小油菜叶片擦洗干净，于冰箱冷藏室保存备用.取0.5 g叶片，倒入20 mL提取液，密封，置于室温避光处静置提取12 h，抽滤，将滤液用25 mL棕色容量瓶定容.以提取剂作为空白溶液，分别在645 nm和663 nm处测量滤液吸光度.总叶绿素含量按照公式（1）计算：
式（1）中：W—总叶绿素含量，mg/g；A663—663 nm处吸光度；A645—645 nm处吸光度；m—样品湿重，g.
1.4 分析与测试
紫外全波长光谱分析：以硫酸钡作为空白对照样品，将ABFA、ABFA-Fe、ABFA-Zn压片后，在200～800 nm波长范围内扫描基线，得到三种物质的紫外全波长光谱；FT-IR测试：采用溴化钾压片法进行制样，测定样品在4 000～400 cm-1的红外光谱；XPS测试：取5 mg 样品，进行X射线光电子能谱宽谱扫描和元素窄谱扫描； XRD测试：采用X-射线衍射仪分析样品晶体结构，扫描范围5 °～85 °；SEM测试：通过粉末制样法，分析样品形貌.
2 结果与讨论
2.1 ABFA-Fe、ABFA-Zn制备条件分析
2.1.1 Fe2+抗氧化剂的选择
铁元素在植株的生长发育中有着重要作用，缺铁会导致叶片黄化.Fe2+可直接被植物吸收利用，但Fe2+极易被氧化为Fe3+，并且土壤中的铁主要以Fe3+形式存在.Fe3+需要在植物体内经过一系列转运与还原变为Fe2+才可被吸收.因此，为提升吸收速率，减少植物缺铁的症状，需要在反应体系中加入抗氧化剂，减少Fe2+的氧化.
盐酸羟胺、抗坏血酸和亚硫酸氢钠3种抗氧化剂的抗氧化效果如图1（a）所示，其中抗坏血酸效果最好，盐酸羟胺最差.图1（b）是不同抗坏血酸添加量对沉淀质量的影响，随着抗坏血酸比例的逐渐增大，沉淀质量先减小后增大，当添加量为8%时效果最佳.因此，选择抗坏血酸作为抗氧化剂，添加量为8%.
2.1.2 ABFA-Fe、ABFA-Zn单因素实验结果
（1）反应pH优化
由图2可知，随反应pH增加，Fe2+与Zn2+的螯合率呈现出先增加后降低的趋势，当pH=6时螯合率最高.因为在水中，Fe3+在pH=2.7时开始沉淀，Fe2+在pH=6.5时开始沉淀，Zn2+在pH=9时开始沉淀，Fe2+在pH=4时，开始氧化成Fe3+，形成沉淀.酸性环境中，H+易与Fe2+、Zn2+竞争供电子基团，不利于螯合物的生成，因此螯合率较低，随着pH升高，OH-增多，Fe2+、Fe3+与Zn2+生成沉淀，螯合率降低.
（2）ABFA与FeSO4、ZnSO4质量比优化
由图3可知，随着硫酸盐用量的增加，螯合率先增大，后减小，在m（ABFA）∶m（FeSO4）=1∶1.5，m（ABFA）∶m（ZnSO4）=1∶3时，螯合率最大.这是因为ABFA上有多个可发生螯合反应的基团，当硫酸盐用量增加，Fe2+与Zn2+含量变大，多个基团参与螯合反应，螯合率增大，当Fe2+与Zn2+含量持续增加，超过ABFA的螯合能力，部分与OH-反应产生沉淀.
（3）反应时间优化
由图4可知，随着反应时间的增加，螯合率先增大后减小，ABFA-Fe在90 min时螯合率最大，ABFA-Zn在150 min时螯合率最大.这是因为，反应时间过短，反应不彻底导致螯合率较低；随着时间的延长，反应达到平衡，继续延长时间，部分螯合物将会发生分解，导致螯合率降低.
（4）反应温度优化
由图5可知，螯合率随着反应温度的上升，出现先升高后降低的趋势，ABFA-Fe与ABFA-Zn均在40 ℃时螯合率最大.这是因为随着温度的升高，分子开始活化，有效碰撞次数增加，提高了化学反应速率，所以螯合率增大；当反应达到平衡，温度继续升高时，化学平衡会向逆反应方向移动，导致螯合率降低.
2.1.3 ABFA-Fe、ABFA-Zn正交实验结果
（1）ABFA-Fe正交实验结果分析
在单因素实验基础上，选择A（pH）、B（反应温度）、C（m（ABFA）∶m（FeSO4））、D（反应时间）作为正交实验的考察因素，如表1所示.
表2为ABFA-Fe的正交实验结果.结果表明，影响ABFA螯合率的因素顺序为B＞D＞C＞A，即反应温度为主要影响因素，反应时间为次要因素，m（ABFA）∶m（FeSO4）为第三因素，pH为第四因素.
表3为ABFA-Fe正交实验的方差分析，P＜0.001表示差异极显著.结果显示4个因素均对螯合率影响显著，结合表2结果，最优工艺为A1B3C3D1，按照最优工艺条件进行三次重复实验，螯合率最高可达到59.93%，高于正交实验组其它实验组，表示实验结果稳定可行.
（2）ABFA-Zn正交实验结果分析
在单因素实验基础上，选择A（pH）、B（反应温度）、C（m（ABFA）∶m（ZnSO4））、D（反应时间）作为正交实验的考察因素，其结果如表4所示.
表5为ABFA-Zn的正交实验结果，结果表明，影响ABFA螯合率的因素顺序为A＞B=C＞[JP2]D，即pH为主要影响因素，反应时间与m（ABFA）∶[JP]m（ZnSO4）为次要因素，pH为第三因素.
表6为ABFA-Zn正交实验的方差分析，P＜0.001表示差异极显著.结果显示4个因素均对螯合率影响显著，结合表5结果，最优工艺为A3B1C1D1，按照最优工艺条件进行三次重复实验，螯合率最高可达到85.93%，高于正交试验组其它实验组，表示实验结果稳定可行.
2.2 种植实验结果分析
微量元素在植物的生长过程中起着不可替代的作用.铁是合成叶绿素的重要元素，参与光合作用与呼吸作用，缺铁将导致植物叶片失绿，严重时，叶片完全变白出现坏死斑点，植株死亡.因此在植株的生长期间，需要获得足够的铁元素.图6（a）为ABFA-Fe的正交实验样本种植结果，相对于ABFA对照组（①），总叶绿素含量提升10 %～35%，株高提升4 %～36%；相对于市售肥对照组（②），总叶绿素含量提升2 %～25%，株高提升6 %～40%；相对于清水对照组（③），总叶绿素含量提升55%～90%，株高提升26 %～65%.
锌元素间接影响植物生长素的合成，缺锌将导致植株矮小，生长停滞，在植物生长过程中补充锌元素有助于提高植物的抗逆性.图6（b）为ABFA-Zn的正交实验样本种植结果，相对于对照组（①），总叶绿素含量提升8%～72%，株高提升0.1%～49%；相对于对照组（②），总叶绿素含量提升0.6%～60%，株高提升2%～53%；相对于对照组（③），总叶绿素含量提升52%～143%，株高提升21%～81%.
种植实验结果表明ABFA-Fe与ABFA-Zn对小油菜的生长有明显刺激作用，有效改善了植株的光和性能.
2.3 分析与测试
2.3.1 紫外全波长光谱分析
ABFA、ABFA-Fe、ABFA-Zn的紫外全波长光谱测定结果如图7所示.谱图整体趋势先上升再降低，逐渐趋于平缓，由于黄腐酸是含有大量含氧官能团的芳香化合物，不饱和特性使其在280 nm附近出现吸收峰.反应发生后，生成了更加稳定的ABFA-Fe和ABFA-Zn，价电子跃迁所需要的能量增加，导致吸收带的最大吸收波长发生移动，因此ABFA-Fe和ABFA-Zn的最大吸收波长分别蓝移至271.51 nm和262.19 nm.
2.3.2 FT-IR分析
图8为ABFA、ABFA-Fe和ABFA-Zn的红外光谱图.由图可知，ABFA在3 405 cm-1因醇羟基与酚羟基的O-H伸缩振动，产生一个宽峰，1 030 cm-1处的吸收峰证明了ABFA中存在羟基，而ABFA-Fe与ABFA-Zn在3 315 cm-1附近急剧变化，这是由于ABFA中的酚羟基和醇羟基与Fe、Zn结合所致.ABFA在1 403 cm-1处因羧基中的O-H伸缩振动产生吸收峰，1 609 cm-1处的吸收峰是羧基中的C=O伸缩振动导致的，1 780 cm-1处的吸收峰是羧基中的C-O振动导致的，由此可以判断出ABFA中含有羧酸基团，在ABFA-Fe与ABFA-Zn中，因羧基与Fe、Zn结合，使得吸收峰发生偏移.以上结果证明了螯合反应的发生与螯合物的生成.
2.3.3 XPS分析
如图9（a）所示，ABFA表面含有的C、N、O等元素是构成ABFA的主要元素.对ABFA中的O元素进行窄谱扫描，结果如图9（b）所示，可知ABFA中的O元素主要以羟基、羧基的形式存在.
分别对ABFA-Fe和ABFA-Zn进行X射线光电子能谱宽谱扫描，结果如图9（c）、（e）所示.可看出ABFA在反应前后，C、N、O的结合能发生了变化，ABFA-Fe的表面出现C、N、O、Fe等四种含量较高的元素，ABFA-Zn出现C、N、O、Zn等四种含量较高的元素，表明ABFA与Fe2+、Zn2+发生结合.
对ABFA-Fe和ABFA-Zn中的O元素进行窄谱扫描，并对谱图进行分峰拟合（图9（d）、（f））.反应后，C-O、C=O的结合能均下降，说明ABFA上的羧基、羟基与Fe2+和Zn2+发生了反应.
2.3.4 XRD分析
ABFA、ABFA-Fe、ABFA-Zn的XRD分析结果如图10所示.从图可看出，ABFA的主强峰位于（2θ=38.70 °），在发生螯合反应后，峰强度减弱，产生新的主强峰，ABFA-Fe位于（2θ=21.42 °），ABFA-Zn位于（2θ=31.85 °）.ABFA位于（2θ=32.50 °）的次强峰也在发生反应后产生位移，新的次强峰强度增强.ABFA-Fe、ABFA-Zn的衍射峰较ABFA显著增多，特征衍射峰峰形尖锐，杂质衍射峰较少.以上结果说明ABFA反应前后的晶型发生变化，ABFA-Fe和ABFA-Zn以不同相结构存在.
2.3.5 SEM分析
图11（a）～（d）分别为BFA、ABFA、ABFA-Zn、ABFA-Fe的SEM电镜图.从图中可看出，BFA表面光滑透亮，呈现出清晰的球状结构，活化后的ABFA颗粒尺寸变小，表面粗糙度变大，具有更多活性位点.ABFA与Fe和Zn螯合后，呈现出小颗粒团聚结构，这可能是ABFA发生反应后，原有结构遭到破坏，形成大量突起结构，与金属离子发生反应，除了配位键的生成，ABFA与Fe2+和Zn2+还有相互吸引作用，造成了团聚现象的发生，结构上的差异证明了螯合反应的发生.
3 结论
（1）以BFA为原料，采用超声活化法制备了ABFA.以ABFA为螯合剂，FeSO4为铁源、ZnSO4为锌源，成功制备了螯合率高的ABFA-Fe、ABFA-Zn.
（2）通过单因素实验及正交实验优化出ABFA-Fe的反应条件为：pH=5、反应温度50 ℃、m（ABFA）∶m（FeSO4）=1∶2、反应时间60 min，螯合率59.93%.优化出ABFA-Zn的反应条件为：pH=7、反应温度30 ℃、m（ABFA）∶m（ZnSO4）=1∶2、反应时间120 min，螯合率85.93%.
（3）通过种植实验表明，ABFA-Fe与ABFA-Zn的种植效果要优于对照组，可以促进小油菜的生长，提高光合作用能力，有效改善作物的品质，提升生理活性.
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