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导语 
还在为环境毒理学研究没思路、没抓手而发愁吗？今天，我们为你拆解一套“从万人队列到分子靶点”的王炸组合拳思路。看一篇高分论文如何以PFOS（一种常见持久性污染物）为例，先用NHANES近万人的大数据锁定其与慢性肾病的关联，再通过网络毒理学预测出PI3K-AKT等关键通路，最后用分子对接和动物实验“一锤定音”。这套丝滑连招，堪称高效发文的“标准答案”！
结果：
在这项调查中，作者在 2003 年至 2018 年期间从 NHANES 中总共选择了 9119 名参与者，其中 1531 人 （16.79%） 被诊断出患有 CKD。通过比较基本信息，发现CKD患者与非CKD患者在基本信息和PFOS方面存在显著差异。与肾功能正常的人相比，CKD 患者平均年龄较大，更有可能是女性和非西班牙裔白人。他们的平均 BMI 也较高，平均 PIR 较低，受过高中以上教育的人比例较低，饮酒率较低。此外，CKD 组自我报告的高血压和糖尿病发生率显着高于肾功能正常的个体。CKD人群中全氟辛烷磺酸的平均水平显著升高
受限三次样条（RCS） 是一种不依赖先验分布的经典统计方法。因此，作者应用 RCS 进一步评估 PFOS 和 CKD 之间的非线性关联，调整所有协变量，将节数设置为 3。结果表明，PFOS与CKD之间存在显著的非线性关系（非线性P = 0.015;图1然后，作者应用基于广义加性模型（GAM）的分段逻辑回归，结合递归算法来检测阈值效应（Chen et al.， 2024）。具体而言，全氟辛烷磺酸与CKD呈U形关联，拐点为9.54 ng/mL。此外，PFOS与多个肾功能相关参数表现出显著相关性：尿白蛋白（负相关，r = -0.03，P = 0.02）、尿肌酐（正相关，r = 0.03，P = 0.04）、eGFR（负相关，r = -0.09，P = 2.9 × 10⁻⁹）和UACR（负相关，r = -0.03，P = 0.043）（图1C）。
通过整合来自STITCH化学相互作用网络、SwissTargetPrediction、CompTox数据库和TargetNet的数据，共鉴定了225个与PFOS相关的靶基因（图S1A）。GO富集分析表明，这些PFOS相关基因主要参与对外界刺激的反应、脂肪酸代谢和对脂多糖暴露的反应等生物学过程（图S1B）。此外，根据KEGG通路富集分析，PI3K-AKT、MAPK 和 Ras 信号通路表现出显着的富集（图 S1B）。
3.4. 鉴定全氟辛烷磺酸在CKD中的关键靶基因和潜在生物学功能
从 GeneCards 和 OMIM 数据库中，作者鉴定了 17,179 个与 CKD 相关的靶基因。通过将这些基因与全氟辛烷磺酸相关靶基因相交，作者将结果缩小到215个共同基因，这些基因被指定为慢性肾病中全氟辛烷磺酸的核心靶基因（图2A）。作者使用R中的“clusterProfiler”包对这215个相交基因进行GO项和KEGG通路富集分析，以研究PFOS加剧CKD的分子机制。GO分析表明，核心靶基因在生物过程中显著富集，包括对外源刺激的响应、外源代谢、细菌分子相互作用和小分子代谢的调节（图2B）。作者选择了前20个KEGG通路富集项，如图2C和2D所示。结果表明，PFOS暴露主要影响PI3K-AKT、MAPK、Ras、甲状腺激素信号传导和EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药途径5种环境信息处理途径。此外，这些靶点与内分泌抵抗和粘连斑等细胞过程相关，并显着参与生物体系统和人类疾病，特别是几种癌症相关途径。这些发现表明，全氟辛烷磺酸可能通过调节与炎症、细胞存活和肿瘤发生相关的信号通路来促进 CKD 的进展。
图2.全氟辛烷磺酸在CKD中的核心靶基因及潜在生物学功能的鉴定。（A）维恩图说明了PFOS相关靶基因与CKD相关靶基因的交集，其中相交基因被标记为CKD中PFOS的关键靶基因;（B）核心靶基因GO富集分析结果的条形图;（C）和（D）分别是气泡图和条形图，描绘了这些核心靶基因的KEGG通路富集分析结果。
在将上述215个核心靶基因输入String数据库后，作者使用Cytoscape软件可视化了PPI蛋白相互作用网络（图3A）。将STRING PPI网络导入Cytoscape后，在cytoHubba中由MCC进一步选择和排名前40个节点，并将其映射到一个子网络中（图3B）。根据MCC拓扑分析，这40种蛋白质被认为是STRING网络中最重要的部分。内圈的10个基因被鉴定为参与CKD的关键PFOS相关基因。
图3.关键基因的鉴定。（A）由215个核心靶基因构建的PPI网络;（B）使用MCC算法鉴定关键基因，前10个枢纽基因以橙色突出显示;（C）核心靶点KEGG富集分析基因交集的水平梯度条形图（前10名）。
将与CKD中PFOS暴露相关的10个核心靶点输入DAVID数据库进行KEGG通路富集分析。可视化了FDR值最低的前20条显着富集的途径（图3C）。气泡图中的每个点代表一条通路，大小表示相关基因的数量，颜色梯度反映统计显着性（−log₁₀P 值）。左侧的桑基图显示了核心基因和富集途径之间的映射关系，彩色链接说明了基因-途径连接。值得注意的是，富集的途径主要与免疫和炎症反应、癌症相关过程和细胞信号调节有关。其中，糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路以及流体剪切应力和动脉粥样硬化通路的代表性较高，提示这些生物学过程可能介导PFOS的肾毒性作用。TP53、AKT1、PTGS2 和 CXCL8 等核心基因在多个途径中发挥核心作用，强调了它们在 PFOS 相关 CKD 病理学中的潜在调节重要性。有趣的是，ALB 没有出现在前 20 个富集途径中的任何一个中，这可能表明其间接或特定环境的参与。这些发现为全氟辛烷磺酸暴露与 CKD 之间的分子事件提供了机制见解，突出了未来干预的潜在治疗靶点
使用GEO数据库GSE32591的CKD相关数据集，进行了逻辑回归分析，重点是已经鉴定的10个核心基因。分析表明，除CXCL8、ICAM1和TGFB1外，其中7个关键基因与CKD进展具有统计学意义的相关性（图4A）。基于这些发现，构建了包含ALB、TP53、PTGS2、AKT1、IGF1、MMP9和IL10的预测列线图（图4B）。使用ROC和校准曲线评估了该模型的性能。ROC分析得出的AUC为0.96，表明对CKD具有很强的预测能力（图4C）。校准曲线评估显示Hosmer-Lemeshow检验P值为1.0，反映了预测结果和实际结果之间的极好一致性。该列线图与理想的参考模型密切相关，证实了这七个靶点在诊断CKD方面的可靠性（图4D）。为了进一步评估其临床相关性，进行了决策曲线分析（DCA）。列线图的决策曲线在0-1阈值概率范围内超过了“全部”和“无”策略，这意味着巨大的净收益和很高的实用价值（图4E）。最后，检查了这些候选基因在GSE32591数据集中的表达谱。在CKD和对照样品之间，TP53、MMP9和IL10没有发现统计学上的显着表达差异（图4F），导致它们被排除在后续分析之外。相比之下，其余4个基因（ALB、PTGS2、AKT1和IGF1）在组间表现出明显的差异表达，与逻辑回归结果一致（图4F）。因此，这4个基因被确定为PFOS参与CKD的关键靶点。
图4.诊断模型构建与评估。（A）CKD相关数据集GSE32591中关键靶基因的logistic回归分析森林图;（B）基于所选诊断基因构建的列线图;（C）关键靶基因的ROC曲线;（D）关键靶基因的校准图;（E）关键靶基因的DCA图;（F）GSE32591数据集中CKD和对照组之间关键靶基因的表达量。数据以SEM±均值表示（n = 93）。星号表示具有统计学意义的差异（*P < 0.05）。
如前所述，四个主要靶基因显示出与 CKD 的强烈诊断相关性。为了进一步研究全氟辛烷磺酸与这些靶标之间的相互作用，进行了分子对接模拟。在对接分析中，低于 0 kcal/mol 的结合能表示配体与受体自发结合，而低于 -5 kcal/mol 的能量意味着强大的相互作用强度。低于 -7.2 kcal/mol 的结合能表明亲和力异常强。作者的对接结果表明，全氟辛烷磺酸对所有四种目标蛋白的结合能均低于 -5 kcal/mol。具体而言，PFOS在-9.1 kcal/mol时与ALB和PTGS2相互作用，在-6.6 kcal/mol时与AKT1相互作用，在-6.4 kcal/mol时与IGF1相互作用（图5A-E）。这些发现表明全氟辛烷磺酸与四种核心蛋白中的每一种之间都存在相当程度的自发结合和很强的分子亲和力。
图5.通过分子对接和体内研究验证关键靶点。（A-D）分子对接图显示PFOS与四个核心蛋白靶点（ALB、PTGS2、AKT1和IGF1）之间的相互作用;（E）PFOS与核心蛋白之间的分子对接分析总结;（F）PFOS暴露后肾组织的组织学检查（200 ×放大倍数）;（G）实验小鼠组间血尿素氮（BUN）和血清肌酐水平（肾功能的两个指标）的定量比较;（H）对每组肾小管损伤标志物KIM-1和NGAL表达进行蛋白质印迹分析，并对相应的蛋白质表达水平进行统计分析。数据以SEM±均值表示（n = 3）。星号表示具有统计学意义的差异（*P < 0.05）。
为了探索全氟辛烷磺酸诱导的肾损伤的潜在机制，作者最初使用 HE 染色评估了小鼠肾组织的组织病理学状态。与对照组相比，低全氟辛烷磺酸和高全氟辛烷磺酸暴露组表现出明显的肾小管液泡变性，并伴有炎症细胞浸润，如箭头所示（图5F）。随着全氟辛烷磺酸浓度的升高，肾功能损害呈增加趋势，表明肾功能呈剂量依赖性恶化（图5G）。同时，使用蛋白质印迹分析肾小管损伤标志物（NGAL 和 KIM-1）的水平。两种标记物的蛋白质表达都显示出随着 PFOS 暴露量增加而逐渐增加（图 5H）。这些发现证实，全氟辛烷磺酸暴露会显着恶化肾脏病变，并且损伤的严重程度与给药浓度密切相关。
3.10. 小鼠PI3K-AKT信号通路激活的验证
为了进一步确认PI3K-AKT信号通路的改变，作者首先研究了四个重要靶基因的位置。如图S2A所示，IGF1和AKT1被确定为PI3K-AKT信号通路中的关键基因，所有这些基因都以红色突出显示。然后，作者使用蛋白质印迹分析评估了PI3K-AKT通路在每个实验组肾组织中的活性。作者的结果表明，PFOS暴露显着增强了PI3K-AKT通路的激活（图S2B和S2C）。此外，通路激活水平与全氟辛烷磺酸剂量呈正相关。这些结果表明，PFOS 通过上调 AKT1 和 IGF1 的表达来激活 PI3K-AKT 信号通路，从而导致肾损伤。
使用 Coremine 数据库对鉴定的四个关键基因进行了分析，结果显示黄芪（俗称黄芪）是与所有四个基因相关的最相关的中药 （TCM）。随后，黄芪甲苷 IV（黄芪中的主要活性化合物）（Wang et al.， 2023））被用于靶向 ALB、PTGS2、AKT1 和 IGF1 蛋白的分子对接实验。如图 S3A-E 所示，所有四种蛋白质都表现出与黄芪苷 IV 的结合亲和力，每种蛋白质的结合能都低于 -5 kcal/mol。具体而言，黄芪甲苷静脉注射与ALB的相互作用能为-9.9 kcal/mol，与PTGS2的相互作用能为-9.4 kcal/mol，与AKT1的相互作用能为-6.4 kcal/mol，与IGF1的相互作用能为-6.8 kcal/mol。这表明黄芪可能具有相当大的治疗潜力，可以改善由PFOS暴露引起的CKD患者的预后。
总结
本研究整合流行病学分析、网络毒理学和动物实验，在系统水平上研究全氟辛烷磺酸诱导的肾毒性及其潜在机制。这种多学科方法提高了毒性预测的准确性，并有助于识别与全氟辛烷磺酸暴露相关的分子途径和环境健康风险。这些发现为全氟辛烷磺酸介导的肾损伤提供了新的见解，并为未来针对全氟辛烷磺酸相关慢性肾病的诊断和治疗策略提出了潜在的分子靶点。
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