槐耳疗法使癌症成功康复和健康维护稳步推进，失败治疗趋于终结
田中真奈実1、田中朝雄1、滕飞2、林宏2、李宁3、罗竹3、贞广庄太郎4、铃木俊之5、丁伟6、陆正鑫7
1.Bradeion医学科学研究所 日本神奈川县
2.深圳华大基因科技有限公司 中国广东深圳
3.华大基因（日本）日本神户
4.龟田医疗中心·森之里医院 外科 日本神奈川县
5.东海大学医学院附属大矶医院 外科 日本神奈川县
6.日本汉方新药株式会社 日本东京
7.启东盖天力药业有限公司 中国江苏启东
摘要 随着致癌分子、基因和机制的发现，癌症研究取得了进展。但即使有了新技术的出现，随之而来的药物发现仍然不敷需要，伴随数量有限的抗癌策略的选择也不尽如人意。它被认为部分原因是单靶向剂对来自多种因素和环境压力的疾病有一定的限制。目前在癌症治疗策略中的这些缺陷主要是由于缺乏癌症康复所需的信息。为了确定癌症恢复的分子基础，与癌变过程中的分子基础进行比较，故必须获得最低限度的基本信息。为此，我们应该有成功的药物来可能和可靠地治疗这种疾病。
我们已经确认了槐耳的抗癌作用，其独特的特点是：
1）无副作用或毒性，
2）呈剂量依赖性，
3）通过同步组织再生导致特定癌细胞死亡，
4）miRNA介导的转录控制通过依赖于个体基因组潜能挽救多种信号转导。
在此我们总结了我们的基因组项目在怀耳疗法治疗癌症患者的临床研究中的结果。通过对总RNA和小分子非编码RNA测序进行肿瘤修复过程中大数据分析。结果显示，在RNA编辑事件、生物分子和多种信号通路的行为和协调方面存在显著差异，这超出了致癌过程中根据结果的任何推测。
现在是改变“癌症治疗”观点的时候了，从单纯的杀死癌细胞到再生因为衰老和长期生活中的压力积累而被破坏的生物生理功能。槐耳提供了一个及时的触发因子，诱导自发的基因组能力和灵活性，以挽救受损的、有功能缺陷的细胞，重建体内平衡。我们将增加槐耳效果对遗传突变人群的致癌预防作用，以及对受损神经元间/内部信号传递的补偿作用。
关键词 槐耳；癌症治疗；大数据分析；miRNA药物转录调控；组织再生；表观遗传学；神经退行性疾病
1.历史悠久，与槐耳的短距离相遇
近年来，中草药越来越受到世界各国的关注，尤其是作为癌症等疾病的辅助治疗和保健作用。在亚洲历史上天然疗法中，槐耳（Trametes robiniophila murr）长期以来被报道对长寿、健康维护和癌症有显著疗效[1-3]。中草药的难点在于缺乏质量标准化的定量制剂，长期以来阻碍了中草药的普遍使用和向公众推广。从20世纪70年代开始，随着技术的进步，人们开始大量培育这些有用的品种，并以常规的，质量控制下的颗粒剂形式进行销售，目前槐耳已被公认为中国的抗癌专利药（中国食药监局许可证Z20000109) [2, 4, 5]。日本患者申请槐耳治疗需要几十年的时间。大量的报道（主要来自中国）表明，其许多分子机制与肿瘤特异性凋亡、自噬细胞死亡有关，甚至通过使用体外培养的癌细胞进行的特异性免疫调节对转移性病变也有效[2-15]。但是即使经过几十年的连续研究，槐耳效果的现实问题仍未得到解决。
21世纪初，日本国立癌症研究所附属有明医院引入了槐耳疗法，以应对不能进行常规化疗或手术切除的严重晚期癌症患者。令人惊讶的是，观察到预后和生活质量评估的以剂量依赖方式显著改善，尤其是在肝细胞癌和乳腺癌上。此后，累积的成功结果足以让众多的主治医生和患者共同认识到槐耳的抗癌作用。我们自己也证实了这种巨大的改善不仅在癌症患者身上，而且在其他疾病如皮肤、肝脏、肾脏疾病和紊乱中也有，更重要的是，还神经退行性疾病如帕金森氏症[16]。在中国，许多通过体外培养细胞和与接种癌细胞的动物模型试验的研究揭示了其作用，但具体机制尚不清楚。
槐耳有效成分为蛋白多糖，多糖含量41.53%，氨基酸含量12.93%，水分含量8.72%。蛋白多糖是槐耳提取物中最有效的抗癌成分，对乳腺癌MCF-7、肝癌H22、Lewis肺癌和肉瘤小鼠S180细胞均有抑制作用（未公布的数据）[6-15]。更重要的是，槐耳没有毒副作用（LD50值为∞), 并保证在任何情况下对任何健康问题都有广泛的用途，且不干扰常规疗法。
我们不得不等到进入系统化大数据分析的时代，有足够的专家来处理人体生理信息[17-20]。2018年3月5日经日本医学会批准（ID:JMA-IIA00335），我们开始了临床研究。通过对自愿的癌症患者总RNA和小分子非编码RNA测序，我们发现了数量惊人的基因组和基因改变，表明在癌症恢复过程中，基因组具有极大的灵活性和可能性[16]。由此产生的大量序列具有NCBI基因表达综合数据库（NCBI-GEO，GSE157086），其在整个项目期间不断加载新确定的序列[4-10]。在21世纪，将槐耳作为癌症治疗的一个新选择很有意思，这是秦始皇于公元前247年至210年间，组织的寻找天然产物（草药、水果、花卉等）以求长生不老的探险活动的结果。
2.被证实的假说：确认槐耳挽救Hippo信号通路
不仅在癌症病例中，我们还观察到槐耳的多维疗效，尤其是对肝功能不全、肾炎、支气管扩张、便秘和皮肤病变的呈剂量依赖性的疗效[16]。因此，很难确定槐耳对这些多种疾病作用的简单分子机制。我们寻找了可能解释临床特征中观察到的这些多重事件的假设候选通路。它应该具有整合多种信号级联以调节组织和器官内稳态的特性。
如图1所示（由美国加利福尼亚州圣地亚哥的 Dr Mo博士提供[21]），槐耳的靶向癌与那些受到Hippo信号通路致癌潜能强烈影响的靶向癌重叠[21，22]，这是众所周知的细胞命运和组织平衡的控制机制。Hippo信号通路的失调与癌症的发生有关，如报道的在肝、肺、结直肠、卵巢和前列腺中，包括转移，这些都与槐耳靶向癌完全重叠。我们假设了Hippo信号通路可能是槐耳效果的主要分子机制，并试图通过简单的试验来证明这一点。
我们用带高表达性非磷酸化转录共活化因子Yorkie（Yki:V5S168A）的转基因果蝇作为肿瘤模型，仅用连续浓度的槐耳颗粒饲喂突变体孵化幼虫，一周即可成虫。我们用以确定槐耳对于Hippo信号通路中断的突变果蝇的效果的简单试验，在第一次试验时即获成功。与临床观察结果一样，槐耳在7天内以剂量依赖性的方式，明显挽救了表达为粗糙眼球形成的功能（图2）。正如在公元前220年预测的那样，Hippo通路的这种调节伴随着代谢组学的强烈转变，从早期胚胎模式转变为“再生”形式。
图1 Mo JS等人展示的果蝇和哺乳动物Hippo信号通路的模型示意图[21]，而红色圆圈yki S168表示本研究中使用的果蝇突变体的变化（左）。哺乳动物信号级联中的红色箭头（右）表示假定的槐耳效应点。所示细胞具有各自的细胞连接；粘连连接（AJ）、紧密连接（TJ）和间隔连接（SJ）。果蝇和哺乳动物的Hippo通路组成以各种颜色显示，箭头和钝线分别表示激活和抑制。黄色球体表示目标蛋白通过激酶磷酸化。连续线表示已知的相互作用，而虚线表示未知的机制[16]。
图2 利用Hippo信号通路中断的突变果蝇进行槐耳试验的总结示意。槐耳的服用使转基因果蝇中过多的非磷酸化Yorkie（ykiS168A）引起的糙眼形成恢复正常[16]。
因此，我们成功地证明了我们关于槐耳抗癌作用的分子机制是基于Hippo信号通路的转录调控失调的假设[21,22]，这可能影响细胞的命运，不仅癌症，而且许多疾病也是通过Hippo通路控制的。当然，与人体生理系统的实际情况相比，使用实验模型进行的检测有很大的差异和局限性，这促使我们考虑下一阶段的临床研究。
相反，为证实结果，许多体外研究伴随我们的实验，为Hippo信号通路失调，转录控制的中断是癌变的主要过程提供了证据[23-29]。然而由于没有观察到通过挽救Hippo信号通路使疾病中恢复正常，这些报道大多是对过去历史的重复。虽然我们真心希望能有有助于癌症康复的额外的成功控制材料，但我们还没有发现任何一种。此外，除了Hippo信号通路外，没有其他的研究发现癌症恢复的可能机制。
3.基因组项目的开启：深入了解槐耳给药后分子事件的临床研究
在这里我们需要两年的时间来准备临床研究。我们开始了临床研究和基因组范围项目，以全面了解槐耳效果的分子基础[30-34]。作为第一步，我们分析了31名患者的92份血液样本，平均每个样本产生超过7.4G的碱基。我们重复，这个分析可以用于1）人类基因及其分子方面的信息积累，由于2）研究人员的巨大努力使信息定量井然有序（最重要的是使用超级计算机9号，由3） 华大基因神户公司及深圳华大基因的卓越专家完成任务。
我们假设的代表性图如图3[16]所示。图3展示了槐耳对癌症治疗的假定疗效。由于Hippo信号通路的紧密联系，我们从2017年开始对多功能控制酶-DYRK1A（双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1[35]）进行了特别的评论，特别是它在维持生物生理功能协调方面的显著特点。2020年10月，我们最终确定并证明了DYRK1A和槐耳中界定的显著的效应相似性。事实上，我们也成功地鉴定了槐耳对突变的EGFR和其他酪氨酸激酶受体（c-MET/erbB-2）的补偿作用[31]。我们在许多癌症患者中发现了丰富的转录组突变；然而值得注意的是，DYRK1A中没有突变[35]。这表明DYRK1A功能的重要性优于由主要癌基因、肿瘤抑制基因和其他已报道基因协调的任何功能（见下一节，表1）。
槐耳影响了几乎所有生命和生存所必需的分子[30-34]。通过连接转录因子（RNA编辑事件），经由miRNA和piRNA介导的控制[36-38]，挽救和补偿中断的信号通路的典型发现来自转录控制，所有这些都源于全基因组转录和翻译的改变和修饰[34]。首先，A-G转换（共3237169241896个，37.0%）和A-C转换（共43213个，6.5%）的SNP变异体比率较高，跳跃外显子为51%，这影响转录因子和多种信号转导通路中相应基因的表达。槐耳的服用通过大量下调多种信号传递通路，帮助挽救了缺陷细胞通信系统[32]。此外，槐耳似乎参与了表观遗传转录后调控，以预防整个家族成员的癌变和肿瘤发生[31，32]。
哪种癌症治疗策略或常规化疗可以涵盖所有癌症患者所需的基因组和基因改变？通过采用包括果蝇品系在内体外实验和体内实模型，基因组和基因中如此多的数量变化此前从未被报道。
因此，我们应该有一个不受拘束的视角去看待结果的真实性，去达到癌症治疗对任何病人、任何阶段、任何起源的目的。它取得的成果是惊人的，超出了任何预期和我们的想象，只有少数研究者能够理解它们的真正含义。连续发表的文献[16，30-34]证明了“癌症康复”在遗传密码语言中的意义。得益于日本京都大学[39]的KEGG信号传导通路特征，这些基因和功能的改变清楚地显示在这些文献中。
首先，很明显，单一靶向治疗策略不足以治疗癌症（表1）[40]。表2[31]显示了多种信号通路的变化。如这些表格所示，只有数百个分子的靶向远远不能满足癌症康复的需要。我们应该重新考虑癌症治疗策略，因为人体生理在癌症完全康复的漫长过程中会经历如此多的动态变化，对多种信号通路的重新调节进行补偿。如前所述，在常规化疗中常用的单靶向药物，如FOLFOX、FOLFIRINOX和顺铂，对于由多种因素和环境压力引起的疾病，应该有一定的使用限制[32]。
图3 槐耳解救Hippo信号通路中断的抗癌作用综述。槐耳对肿瘤增殖及血管生成，转移的抑制作用，并在诱导自噬癌细胞死亡（左下角），右下角的图突出了受损组织的再生机制[16]。
我们完全同意肿瘤病灶的外科切除，如果适用的话，切除肿瘤肿块应该是首选[31，32]。然而，即使成功地切除了病灶，它仍然存在隐匿转移的可能性，更重要的是，需要长期控制（癌症）干细胞以防止复发或转移[30]。最长时间的病例就是我们曾遇到过一例乳腺癌术后39年发生复发的患者。
如上所述，了解恢复过程的最佳数据来自转录因子（TF）-差异表达基因（DEG）网络，它只能通过总RNA测序获得[31-34]。对每一个分子进行滴定都远远不足以监测病人。在全世界范围内使用这种大数据分析变得越来越流行，最近还涉及到SARS-COV2和其他病毒感染，正如前面所强调的那样。我们的数据也检测到多种病毒感染，如乳头状瘤病毒，HIV-1感染，以及其它DNA病毒感染。
表1 主要癌基因和抑癌基因随表达的改变。红色亮字：上调的改变的基因，蓝色亮字：下调的改变的基因。黑色字母表示没有数量变化的基因[31]
表2
表2 表1描述了遗传改变的信号传递通路。通路分为两类；下调和上调。每个通路的典型相关功能用粗体字母表示和突出显示。蓝色表示下调，红色表示上调。调节的变化取决于槐耳服用的时间进程[31]。
相反，与使用铂（II）配合物的常规化疗相比，每个信号通路中的大多数转录物都显著下调，特别是在中枢和外周神经系统的信号传递中[32]。顺铂：CDDP的长期治疗导致新生细胞中的RNA合成完全破坏，抑制自发的物质合成，最终抑制受损细胞和组织的繁殖。因此，槐耳疗法对晚期恶性肿瘤患者也是有效的，需要更细致、更精确的基因组监测来控制铂（Ⅱ）配合物治疗的效果。
5.槐耳对组织再生和干细胞控制的影响（控制IPS/ES细胞）
观察到经过槐耳处理对组织再生的显著影响，同时观察到癌细胞的死亡和积极清除那些受损的细胞碎片。观察到槐耳对高危患者癌症进展的预防作用，以及通过诱导多能干细胞（IPS）/胚胎干细胞（ES）的转录调控，在切除受损病灶后同步进行组织再生的作用[30]。对总转录组和非编码RNA的大数据分析揭示了挽救这些患者多种信号通路功能障碍，包括Notch、NFκB、Wnt信号通路与这些途径中的调控转录因子。这些挽救了影响着干细胞转化的调控系统，这个系统调控着新生细胞的增殖和分化。诱导的正常组织再生是对iPS/ES细胞产生进行转录控制的结果（见图3）。
在控制iPS/ES产生的基因家族中，尤其是c-myc表达水平在其他基因或基因家族中起主要作用[30]。这些结果为阐明槐耳效果提供了线索，不仅有助于癌症的康复，而且有助于通过干细胞调控来控制正常组织再生，从而预防由日常环境应力积累和衰老引起的许多相关疾病和紊乱。另外，传统的化疗被认为对控制干细胞无效。它被认为是复发和死亡的原因之一，即使持续化疗也会复发，尤其是乳腺癌[15]。槐耳在长期预防癌症复发这一点上显示出明显的优越性。
6.对突变转录组和基因突变的发病机制的表观遗传学观察
考虑到癌症的发生和干细胞的控制，遗传性酪氨酸激酶和激酶受体突变的患者应进行表观遗传学研究。表观遗传学是研究遗传表型变化，不涉及DNA序列的改变。表观遗传学通常涉及影响基因活性和表达的变化，这种对细胞和生理表型特征的影响可能是由于外部或环境因素造成的DNA损伤引起的表观遗传变化[41-43]。近年来，因癌症发生的表观遗传影响和干细胞控制的丧失致DNA损伤修复系统的严重损伤已被报道。事实上，DNA损伤是非常频繁的，平均每天每个人体细胞发生6万次。
这些损伤通常大部分被修复，但在DNA修复的部位，表观遗传的改变可以保留下来。已有报道DNA修复基因MLH1的表观遗传沉寂增加了DNA修复酶的水平，如MGMT、MLH1和p53[31，33]。然而，据报道特别是在发生遗传性突变的EGFR和其他酪氨酸激酶受体（c-MET/erbB-2）的癌症患者中[31]，我们观察到许多与DNA错配修复相关的突变和功能中断。在这些患者中，表观遗传系统被指明影响记忆和信号传递间/内中枢和外周神经元。考虑到DYRK1A功能的强相似性，将考虑进一步讨论槐耳对神经学的效果。
Fernandez Martinez P、Sahonero C和Sanchez Gomez P展示了DYRK1A与基本生物系统重要联系的模型示意图[35]。DYRK1A通过抑制肿瘤抑制物来激活已知的致癌前体，这与肿瘤前活性相关。但是DYRK1A的抗肿瘤能力也被描述为通过激活肿瘤抑制因子或抑制致癌蛋白。为了增加DYRK1A功能的复杂性，这种激酶的一些已知底物可以同时具有致癌和抑癌活性，这取决于细胞背景和发育阶段。再次强调，有许多重要的分子和信号通路由DYRK1A控制，在我们的临床研究中从未观察到突变，而其他主要的癌基因和抑癌基因都发生了突变。此外，根据在生物系统中的重要性和必要性，酪氨酸激酶和激酶受体似乎存在着层次结构。
7.槐耳对中枢和外周神经系统神经元间/内信号传递受损的补偿作用
当我们使用转基因果蝇作为癌症模型时[3]，该突变体可用做筛选肌萎缩侧索硬化症（ALS）的备选物。然而，近5年的研究却一无所获。同时，我们观察到FOLFIRINOX疗法成功治愈的胰腺癌患者中枢和外周神经系统的信号传递受损[32]。
最近我们发现了补偿受损神经传递的分子系统，尤其是与神经退行性改变相关的突变转录物（图4）[45]。在发生遗传性突变的EGFR和酪氨酸激酶受体（c-MET、HER2/neu（erbB2）、Htt、Parkin、APP、SOD1、ALS2）以及许多癌基因和肿瘤抑制基因的患者中显著观察到了对神经元间/内部信号传递的挽救。
槐耳治疗虽能阻止这些患者发病，但对他们有影响，可引起轻度抑郁。表观遗传潜力似乎影响这些遗传突变的致病性，通常在DNA错配修复系统中观察到。通过KEGG通路表征，槐耳对神经元间/内部正常功能的恢复有显著影响[44]。虽然我们只观察到一例帕金森病患者成功康复，每个代表性分子的进一步作用还没有确定，且没有发现翻译和转录过程中的突变机制的改变。本研究揭示了参与神经退行性疾病发病的分子和信号通路，以及槐耳对维持和挽救受损神经传递和信号传递的重要作用。神经退行性损伤不可避免地由使用化学物质以及老化过程引起。但是需要强调的是，经过2年治疗，槐耳能够应对病情的严重性和发病率。
图4 神经元内/神经元间信号传递的KEGG特征[45]。Panel A：自上而下，挽救中的神经传递；胆碱能突触、多巴胺能突触和5-羟色胺能突触。用红色方框在丰富分子中突出显示信号传递的定量调控。Panel B：亨廷顿病和帕金森氏症分子修饰的KEGG特征。注意红色箭头所示的Htt（亨廷顿病）和Parkin（帕金森氏症）突变。Panel C：阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化症分子修饰的KEGG特征。注意红色箭头所示的APP（阿尔茨海默病的糖蛋白淀粉样β前体蛋白）、ApoE（载脂蛋白E）、SOD1（超氧化物歧化酶基因）和ALS2（遗传性肌萎缩侧索硬化与肌萎缩侧索硬化潜在相关的Alsin GTPase）。
结合以前的文献[32]，槐耳通过影响多种信号传递通路，在中枢和外周神经系统细胞间通信系统相关功能受损的补偿方面展现出显著的功效。针对特定靶分子的治疗应该有一定的限度来影响所有这些改变，每次有限上调，其它则下调。即使是突变的EGFR和酪氨酸激酶受体，也缺乏药物或候选化合物。本研究为槐耳成功治疗和预防神经退行性疾病提供了线索。
8.终结失败治疗，首选方法
现在是结束癌症治疗策略失败的痛苦和冲突的时候了。我们长期以来发表了许多论文，对有效的药物开发充满了承诺，目前还没有实现。槐耳疗法是成功策略之一，它提供更多选择，尤其是在有许多转移病灶的晚期癌症上。在小剂量每天3g情况下，槐耳也有助于预防癌症进展。根据每个病例的分期、起源和个体特点，槐耳为癌症治疗提供了更多的选择。它早在2000多年前就存在了，没有从古代的智慧中学习，我们就无法探索新的分子靶向潜力。最后，有那么多失败的治疗和同样多的人的生命损失。致癌作用的研究成果，尤其是通过体外实验获得的结果，与临床观察结果有较大差异。当然，通过总RNA测序的定量分析，在癌症患者中检测到的分子方面存在显著的定量差异。癌症恢复的分子基础包括从RNA编辑事件到miRNA和piRNA修饰的转录控制的大量定量变化。
首先，我们应该记住当我们开始治疗癌症时应该考虑什么：1）促进病变内癌细胞特异性死亡；2）丢弃由此产生的受损细胞碎片；3）用正常细胞修复受损和/或切除的组织；4） 防止复发，同时防止邻近和明显的转移。显然，手术切除肿瘤块是首选[1，2]，然而如果适用的话，这只是战胜癌症等疾病的开始。槐耳的抗癌作用是：1）促进病变内癌细胞特异性死亡；2）丢弃由此产生的受损细胞碎片；3）用正常细胞修复受损和/或切除的组织；4） 防止复发，同时防止邻近和明显的转移。
我们的基因组项目证明，从分子和生物生理功能的角度来看，许多“正常”个体并不正常[30-34]。服用槐耳后许多正常人表现出剧烈的基因组和基因改变，以挽救潜在的、无形的多种信号通路中断。即使没有任何症状，由于环境压力的累积和衰老过程，每天都有巨大的癌症风险。早期诊断技术在正确和精确地评估风险方面有一些局限性[33，34]，与此相反，使用内窥镜检查和放射方法进行过度、频繁的医学检查会增加致癌的风险[33]。我们要强调槐耳对中枢和外周神经系统的信号传递、通信传递中的补偿作用，以及神经退行性疾病的辅助治疗作用。
致谢
作者感谢与本研究合作的癌症患者和许多健康志愿者。我们还要感谢中国科学院动物研究所干细胞与免疫学教授赵同标博士对稿件的批评指正。对项目方案进行批评指正、提出意见；审查委员会对项目进行医学伦理和安全监督。我们特别感谢来自美国加州圣迭戈的Mo教授和西班牙马德里的P. Sanchez-Comez教授，允许我们使用本评论引用的相关评论文章中出现的数字。本研究由启东盖天力药业有限公司和日本汉方新药株式会社提供资金支持。
利益冲突声明
作者声明无利益冲突
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