微精选

糖含量是决定果实风味品质和营养价值的关键因素。钙在果实发育和品质形成中发挥着广泛的调控作用，然而，钙介导的糖积累的分子机制尚不完全清楚。

本研究证明，钙处理可促进柑橘果实和愈伤组织中糖分的积累，同时上调蔗糖转运蛋白基因CsSWEET17的表达。功能分析表明，膜定位的CsSWEET17蛋白具有蔗糖转运活性。在柑橘汁囊、愈伤组织和异源番茄系统中转基因过表达CsSWEET17，蔗糖水平持续升高。相反，通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）或RNA干扰（RNAi）抑制CsSWEET17的表达，会显著降低柑橘中的蔗糖含量。

进一步研究确定，CsMYB36是一种钙响应型转录因子，可直接激活CsSWEET17的表达。转基因验证表明，钙信号和CsMYB36介导的蔗糖积累均严格依赖于CsSWEET17的转录调控。我们的研究阐明了一个新的钙-MYB36-SWEET17调控模块，该模块控制蔗糖的积累，为基于钙的策略在柑橘品质改良中的应用提供了分子层面的见解，并为果蔬作物中糖转运蛋白的调控机制提供了基础信息。

2.1 钙诱导的蔗糖积累与CsSWEET17的高表达有关

为了研究钙对果实品质形成的作用，我们在果实发育阶段用钙处理脐橙（Citrus sinensis Osb.var.brasliliensis Tanaka），并测量了果实中的糖含量。结果表明，柑橘类水果的汁囊和果皮中果糖、葡萄糖和蔗糖含量显著增加（图1A-B）。

为了进一步阐明钙介导的糖积累的潜在机制，我们用Ca（NO3）2处理了“国庆1号”品种的愈伤组织。15天后，糖含量分析显示，钙处理愈伤组织中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量显著高于对照样品（图1C）。值得注意的是，蔗糖积累在这些组织中表现出最显著的增强，与葡萄糖和果糖水平相比，表现出统计学上的显著升高。

我们还测量了钙处理过的汁囊、果皮和愈伤组织中的钙含量，与未处理的对照组相比，所有这些都显示出显著的增加（图1D-F），表明钙诱导的蔗糖积累在柑橘果实和愈伤组织内是保守的。为了揭示钙处理提高果实糖含量的潜在分子调控机制，我们用三个生物重复对钙处理和对照柑橘愈伤组织样本进行了RNA测序（RNA-seq）分析。通过差异表达基因（DEG）分析，我们确定了可能参与糖含量调节的候选转运蛋白基因。其中，大多数糖相关转运蛋白显示上调模式（图1G），被选为候选基因。

对七个基因的RT-qPCR分析显示，与对照组相比，经C处理的样本中CsSWEET17的表达最显著上调（图1H）。基于SWEET17与几种植物物种（拟南芥、大豆和玉米）的蛋白质序列比对，CsSWEET117在植物中高度保守，含有7个典型的跨膜结构域（TM）。我们使用RT-qPCR进一步研究了CsSWEET17在柑橘汁囊和果皮中的空间和时间表达模式。结果表明，CsSWEET17在果皮中的表达始终远高于汁囊中的表达，并且在两种组织中的表达随时间略有下降（图1I）。考虑到大多数维管束聚集在果皮中，这意味着CsSWEET17可能参与了糖从果皮到汁囊的过程。

图1。钙诱导柑橘中蔗糖的积累，CsSWEET17

（A-B）的发现钙诱导汁囊（A）、果皮（B）和柑橘愈伤组织（C）中蔗糖含量较高。

（D-F）对照和钙处理的柑橘汁囊（D）、果皮（E）和愈伤组织（F）中的钙含量测定。

（G）热图，显示钙处理（Ca-1-3）和对照（CK-1-3）愈伤组织中差异表达基因（DEGs）的表达模式。这些值表示对数转换的FPKM（每千基百万碎片数）级别。（

H）RT-qPCR证实了钙处理愈伤组织中CsSWEET17的转录水平。

（I）柑橘果实发育过程中CsSWEET17在汁囊和果皮中的表达模式。

2.2 CsSWEET17定位于质膜/液泡膜，具有蔗糖转运活性

为了确定CsSWEET17的亚细胞定位，使用根癌农杆菌在烟草表皮细胞中瞬时表达CsSWEET-17-GFP融合构建体。pRI101-GFP（空载体，EV）用作对照。如图2A所示，在质膜上观察到CsSWEET17-GFP荧光，与mCherry-CBL1n-OFP质膜标记物共定位。这些发现提供了CsSWEET17定位于质膜的证据。

先前的研究报告称，SWEET17蛋白也位于液泡膜上。为了验证这一观察结果，我们对原生质体和释放的液泡进行了亚细胞定位分析。值得注意的是，CsSWEET17显示出多面体定位模式，分布在质膜、液泡膜和小囊泡上。这种多室分布反映了最近报道的番茄SlSWEET17的行为，表明柑橘和番茄之间SWEET117同源物之间存在保守的膜运输机制。

进一步应用己糖和蔗糖转运缺陷酵母菌株CSY4000检测CsSWEET17的转运底物。使用酵母表达载体pDR196表达CsSWEET17，StSUT1和空的pDR196载体分别作为阳性和阴性对照。正如预期的那样，所有菌株在2%（w/v）麦芽糖培养基上生长相似。然而，与空的载体对照细胞相比，具有CsSWEET17和StSUT1的酵母可以在2%（w/v）蔗糖培养基上良好生长，但在2%（w/w）果糖或葡萄糖培养基上没有生长差异（图2B）。这一结果表明，CsSWEET17具有蔗糖转运蛋白的功能。

为了进一步分析CsSWEET17的转运特性，在酵母摄取试验中使用了14C标记的蔗糖。如图2C-D所示，在最佳pH5.5条件下，表达CsSWEET17的CSY4000酵母细胞的蔗糖摄取率显著高于对照组。在存在100倍过量未标记糖的情况下，评估14C-蔗糖的竞争性摄取，以评估CsSWEET17的底物特异性。结果表明，只有非放射性蔗糖将14C-蔗糖的吸收降低到对照的52%，而其他底物，包括葡萄糖、果糖、核糖、木糖、半乳糖和甘露糖，则没有影响。这表明CsSWEET17是蔗糖特异性转运蛋白（图2E）。

此外，低浓度的质子解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）显著降低了14C-蔗糖的摄取，使其降至对照摄取的10%（图2E），表明通过CsSWEET17摄取糖是质子偶联过程。在表达CsSWEET17的非洲爪蟾卵母细胞中也观察到一致的14C-蔗糖摄取结果。总的来说，这些发现表明，膜定位的CsSWEET17特异性运输蔗糖。

图2:CsSWEET17的亚细胞定位及其蔗糖转运活性的验证

（A） CsSWEET17在烟草叶中瞬时表达的亚细胞定位，与质膜标记蛋白（mCherry-CBL1n-OFP）共定位。 

（B） CsSWEET17补充了蔗糖和己糖转运蛋白缺陷型酵母菌株CSY4000，与阴性对照pDR196空载体相比，在选择性培养基上的生长证明了这一点；阳性对照StSUT1-pDR196。

（C）通过14CSuc掺入测量CsSWEET17在酵母系统中pH依赖性蔗糖摄取的研究。

（D）CsSWEET17对蔗糖的时间依赖性摄取，pDR196（空载体）作为阴性对照。

（E）在没有竞争性糖和代谢抑制剂的情况下，将对照条件设置为100%，测量CsSWEET17对14CSuc的摄取。

（F）CsSWEET17的米氏动力学分析显示，Km为290.84μM，Vmax为23.584 pmol蔗糖min-1 mg-1细胞FM（新鲜重量）。

2.3 CsSWEET17提高柑橘和番茄果实中的蔗糖含量

为了进一步阐明CsSWEET17在植物蔗糖积累中的作用，将重组构建体CsSWEET17-pK7WG2D和CsSWEED17-pTRV2分别渗透到柑橘汁囊中，以实现CsSWEET7的过表达（OE）和病毒诱导的基因沉默（VIGS）。通过RT-qPCR确认靶基因表达水平和浸润成功率（图3A）。结果显示，CsSWEET17 OE样品中的蔗糖浓度显著高于对照组，而CsSWEET17 VIGS汁囊表现出相反的表型（图3B）。随后，重组构建体CsSWEET17-pK7WG2D（OE）和CsSWEED17-pK7GWIWG2D（RNAi）用于农杆菌介导的柑橘愈伤组织转化。RT-qPCR分析鉴定了两个过表达系（SWEET17-OE1和SWEET17-OE2）和两个RNA干扰（RNAi）系（SWEE T17-Ri1和SWEE T17-Ri2），以及用空载体（EV）转化的愈伤组织作为对照（图3C）。与对照组相比，过表达系的蔗糖含量增加了约1.5倍（图3D）。相反，RNAi系显示蔗糖积累减少，表现出相反的表型（图3D）。此外，将重组构建体CsSWEET17-pK7WG2D转化到番茄子叶中，以产生异源过表达转基因材料。RT-PCR分析产生了纯合的转基因T2系（图3E）。转基因番茄果实在红熟期的糖含量测量表明，CsSWEET17显著增强了蔗糖积累（图3F）。这些来自CsSWEET17转基因柑橘汁囊、愈伤组织和番茄的表型结果共同表明，CsSWEET17是柑橘果实蔗糖积累的正调节因子。

图3。CsSWEET17有助于蔗糖的积累

（A-B）。转基因汁囊中CsSWEET17（A）的转录表达水平和蔗糖含量（B）。过表达空载体（EV-OE）和TRV2空载体（EV-VIGS）是指对照。

（C-D）转基因柑橘愈伤组织中CsSWEET17（C）和蔗糖含量（D）的转录表达水平。过表达空载体（EV-OE）和RNAi空载体（EV Ri）是指对照。

（E）过表达转基因番茄果实系（L1和L2）中CsSWEET17表达的果实照片和分析。

（F）野生型和过表达转基因番茄果实中的蔗糖含量。

2.4 CsMYB36的鉴定及表达模式分析

为了研究CsSWEET17促进蔗糖积累的分子机制，我们使用TBtools 42分析了CsSWEET17基因起始密码子上游1100 bp内的启动子序列（补充图S4A）。此外，从转录组数据中鉴定出钙处理诱导的六种转录因子（TF）（图4A）。其中，经RT-qPCR方法证实，CsMYB36显示出最显著的钙诱导表达（图4B）。

多重序列比对显示，CsMYB36包含保守的R2R3 MYB转录因子结构域，如之前报道的那样。用核标记蛋白进行的亚细胞定位分析进一步证实了CsMYB36的核定位（图4C）。此外，表达分析表明，CsMYB36在果皮中高度表达，在果实发育过程中其表达水平降低，与CsSWEET17相似（图4D）。

为了验证候选TFs与CsSWEET17启动子的结合能力，在添加了Aureobasidin A（AbA）的SD/-U-L培养基上观察酵母单杂交（Y1H）菌落的生长两天。结果表明，只有CsMYB36与CsSWEET17启动子结合，实现了酵母的稳定生长（图4E）。这些发现支持CsMYB36作为CsSWEET17的潜在上游转录调节因子，值得进一步研究。

图4。CsMYB36的筛选与定位分析

（A） 热图显示了钙处理和对照（未处理）愈伤组织中显著不同的转录因子的表达模式。

（B）RT-qPCR分析显示，与对照组相比，钙处理的愈伤组织中CsMYB36的表达显著上调。这表明钙处理与CsMYB36的表达之间存在很强的相关性。

（C）利用瞬时表达和荧光显微镜证实了CsMYB36在烟草叶片中的亚细胞定位。与核标记物（mCherry）的共定位表明CsMYB36定位在细胞核中。

（D）分析了CsMYB36在柑橘果实发育不同阶段在汁囊和果皮中的表达模式。

（E）CsMYB36与CsSWEET17启动子结合的酵母单杂交（Y1H）测定

2.5 CsMYB36结合CsSWEET17的启动子并激活其表达

鉴于Y1H试验中观察到的稳定酵母生长表型，进行了双荧光素酶（LUC）试验，以阐明CsMYB36如何调节CsSWEET17表达（图5A）。与对照组（EV-62SK）相比，用CsMYB36-62SK和CsSWEET17-0800pro共过滤的烟叶表现出显著更高的萤光素酶活性（图5B）。这一结果与LUC/REN酶活性测量和体内叶片成像一致（图5C），表明CsMYB36通过与其启动子结合积极调节CsSWEET17的表达。

为了鉴定CsMYB36的特异性结合位点，根据MRE、MYB和MBS结合基序的位置，将CsSWEET17启动子分为四个片段（标记为A、B、C和D，在图5D中显示为黄色矩形）。将含有至少一个MYB结合基序的每个片段插入pAbAi载体中，并与CsMYB36-PGADAT7共转化到Y1H酵母细胞中。在含有150mg/L AbA的SD/-U/-L板上生长表明，CsMYB36特异性结合了CsSWEET17pro-C片段。

为了确认CsMYB36与CsSWEET17启动子的体内结合，使用稳定表达35S:：CsMYB36-flag的转基因柑橘愈伤组织和无flag载体作为对照进行染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR。还包括一个没有结合基序的阴性对照区（CK）。ChIP-qPCR结果显示，35S:：CsMYB36标志愈伤组织的免疫沉淀样本中C片段显著富集（图5E）。该片段位于ATG起始密码子上游578 bp处，包含一个MRE和一个MYBcore基序，被设计为F1和F2，以便通过Y1H分析进一步确认（图5D）。酵母生长结果显示，CsMYB36特异性结合CsSWEET17启动子的F1序列（图5F）。

此外，电泳迁移率变化分析（EMSA）证实了CsMYB36的体外DNA结合位点。设计了与CsSWEET17启动子F1区相对应的探针，包括标记的、未标记的竞争性和突变探针。探针移动证实了CsMYB36与位于CsSWEET17起始密码子（ATG）上游578-604bp的区域特异性结合。这种结合活性随着未标记的竞争性探针的加入而降低（图5G）。总之，这些结果表明，CsMYB36直接与CsSWEET17启动子结合，这与它作为CsSWEET17转录正调控因子的作用是一致的。

图5。CsMYB36与CsSWEET17的启动子结合

（A） 双荧光素酶测定中报告子和效应子结构的示意图。

（B）双荧光素酶报告子测定，证明了烟草叶中CsSWEET17启动子和CsMYB36之间的相互作用。

（C）LUC测定结果表明，CsMYB36增强了CsSWEET17启动子的转录活性。L

（D）CsSWEET17启动子内CsMYB36转录因子结合位点的结构图。区域A-D表示通过ChIP-qPCR（E）和Y1H实验

（F）进行MYB36结合测定的片段。F1和F2表示在Y1H实验中测试的特定启动子区域。

（E）ChIP-qPCR分析证实，CsSWEET17启动子序列在MYB36-FLAG蛋白上富集，表明直接结合和调控。

（F）分段Y1H实验揭示了CsMYB36与CsSWEET17的启动子区域F1和F2之间的特异性相互作用。阳性对照（pGBKT7-P53和pGADT7-53）验证了相互作用检测方法。

（G）电泳迁移率变化分析（EMSA）表明CsMYB36与CsSWEET17启动子结合。

2.6 CsMYB36通过增加CsSWEET17的转录水平来提高蔗糖含量

虽然CsMYB36已被证明可以积极调节CsSWEET17的转录，但其在糖积累中的潜在作用需要进一步阐明。通过农杆菌介导的柑橘汁囊转化，我们证明CsMYB36的过表达显著增强了CsSWEET17的表达，并显著增加了汁囊中的糖含量（图6A-B）。糖含量的升高与这两个基因的上调呈正相关（图6C）。相比之下，果汁囊中CsMYB36的沉默导致CsSWEET17表达显著下调（图6A-B），蔗糖水平相应降低（图6C）。此外，基于RT-qPCR分析，我们成功地产生了具有CsMYB36过表达（OE）和RNAi敲除的稳定转基因柑橘愈伤组织，以及具有异位CsMYB35过表达的转基因番茄果实（图6D和6G）。每组鉴定出两个阳性转基因系。CsMYB36和CsSWEET17的表达水平相应地增加或减少（图6E）。与对照组相比，CsMYB36 OE样品中的蔗糖含量显著较高，而RNAi敲除系表现出相反的表型（图6F）。同样，番茄果实表型表明，CsMYB36过表达显著提高了蔗糖水平（图6H）。

我们进一步分析了番茄SlSWEET17的启动子，该启动子含有MYB的结合位点。Y1H实验还表明，CsMYB36可以结合SlSWEET17启动子。CsMYB36过表达番茄中SlSWEET17的转录水平相应增加，这意味着柑橘和番茄之间MYB36-SWEET7模块的潜在保守调控机制。SlSWEET17的亚细胞定位分析证实了其主要的质膜定位。使用CSY4000的功能互补分析显示了类似的酵母生长表型，因为SlSWEET17的酵母表达可以在蔗糖培养基中良好生长，但在葡萄糖和果糖培养基中生长不良。这一观察结果表明，SlSWEET17类似于柑橘中的CsSWEET7，选择性地促进蔗糖运输。这些结果提供了令人信服的生物学证据，支持CsMYB36通过上调SWEET17表达促进蔗糖积累的积极调节作用。

图6。CsMYB36与柑橘和番茄中的蔗糖积累有关

（A-C）转基因汁囊中CsMYB35（A）和CsSWEET17（B）的转录表达水平以及蔗糖含量（C）过表达空载体（EV-OE）和TRV2空载体（EV-VIGS）是指对照。

（D-F）转基因柑橘愈伤组织中CsMYB36（D）和CsSWEET17（E）的转录表达水平以及蔗糖含量（F）。

（G）过表达转基因番茄果实中CsMYB36表达的果实照片和转录本分析。

（H）过表达转基因番茄果实中的蔗糖含量。

2.7 钙和CsMYB36诱导的糖积累取决于CsSWEET17

为了研究CsMYB36和CsSWEET17之间的遗传关系，采用柑橘愈伤组织共转化进行基因表达和蔗糖含量测定。在空白载体（EV-Ri）的对照愈伤组织中过表达CsMYB36显著增加了蔗糖含量。然而，当CsMYB36在CsSWEET17 RNAi背景中过表达时，蔗糖积累效应被消除（图7A-C）。

为了进一步验证CsSWEET17在钙诱导的蔗糖积累中的作用，在钙处理下检测了对照（EVRi）和CsSWEET17-RNAi转基因愈伤组织样本中的蔗糖含量。结果表明，钙在对照愈伤组织中诱导了更高的CsSWEET17表达水平并增加了蔗糖含量，但在CsSWEET17 RNAi系中没有（图7D-E），这意味着钙诱导的蔗糖积累依赖于CsSWEET127的表达。总的来说，这些发现提供了强有力的生物学和遗传学证据，表明钙和CsMYB36通过依赖于CsSWEET17的机制调节蔗糖积累。

图7。CsSWEET17对CsMYB36和钙诱导的柑橘蔗糖积累至关重要。

在转基因组织培养的柑橘愈伤组织系中，包括空载体对照和CsSWEET17沉默背景，实现了CsMYB37的过表达。使用RT-qPCR分析CsMYB36（A）和CsSWEET17（B）的表达水平，并测量蔗糖含量（C）。

（D-E）对CsSWEET17 RNAi愈伤组织进行钙处理，以研究其对蔗糖含量的影响。使用RT-qPCR分析CsSWEET17（D）的表达水平，并测量蔗糖含量（E）。

（F）示意图模型说明了CsMYB36调节柑橘果实中CsSWEET17介导的糖运输和积累的分子机制。

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