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 根据中华人民共和国农业农村部第194号公告，自2020年7月1日起，饲料生产企业禁止生产含有促生长类药物饲料添加剂的商品饲料。在全面“禁抗”的背景下，寻找“替抗”的产品成为重中之重，而菌酶协同发酵饲料具有替代抗生素的潜力。在利用微生物发酵制作饲料的过程中，选择恰当的发酵菌种是确保发酵饲料质量和效果的关键所在。2013年，我国农业部第2045号公告公布了《饲料添加剂品目录（2013）》，规定只有34种微生物可作为饲料添加剂使用，应用于发酵的菌种主要包括乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌三大类。

发酵饲料在生产时，存在微生物的种类不够多，或者它们产生的酶活性不强、数量不够等问题，不能把饲料原料完全分解，酶解饲料不能产生对动物有益的微生物代谢产物。而菌酶协同发酵饲料则将两种技术结合起来，通过微生物和酶的共同作用，大幅缩短了发酵时间，显著提升了发酵生产的效率，提升了发酵产品的品质。菌酶协同发酵饲料不仅可以改善饲料的风味，还可以将饲料中的大分子营养物质分解为更易吸收的小分子物质、有效减少抗营养因子的含量，从而提升饲料原料的综合利用价值。黄蕊等研究选用枯草芽孢杆菌、德式乳酸杆菌、酵母菌、木瓜蛋白酶和脂肪酶作为菌接种剂和酶添加剂进行菌酶协同发酵。与发酵前组相比，菌酶协同饲料发酵组能够明显提高全蛋粉的小肽含量，并可以增强仔猪对饲料中营养物质的消化能力、吸收效率及利用程度。王诚等研究表明，利用菌酶协同发酵技术处理玉米秸秆，可有效降低青贮饲料的pH、总氨及粗纤维含量，同时显著提升粗蛋白含量。冯江鑫等研究发现，菌酶协同发酵饲料能够明显提高饲料的粗灰分、粗蛋白、粗脂肪等营养物质的吸收率。张学忠研究发现，在仔猪养殖过程中，与对照组相比，菌酶协同组不仅提升了仔猪日增重，降低了料重比，还有效地控制了仔猪的腹泻率。刘宗正等研究表明，利用菌酶协同发酵能显著提高断奶仔猪的日均采食量及平均日增重，并有效降低其腹泻指数，进而改善仔猪的健康状况。

本研究以仔猪饲料为发酵原料，筛选出发酵效果最佳的菌种，并采用菌酶协同发酵技术进一步优化饲料发酵工艺，为发酵饲料菌种选择及其条件优化提供理论支撑。

1.1 试验材料

1.1.1 发酵原料

断奶仔猪饲料。

1.1.2 菌种与复合酶制剂

菌种：罗伊氏乳杆菌（LR）、植物乳杆菌（LP）、乳酸片球菌（PA）、枯草芽孢杆菌（BS）、酿酒酵母（SC），活菌数均为1×108 CFU/mL，由实验室提供。

复合酶制剂：聚糖酶≥4 000 U/g、β-葡聚糖酶≥6 000 U/g、蛋白酶≥10 000 U/g、淀粉酶≥6 000 U/g、纤维素酶≥1 500 U/g、阿拉伯木聚糖酶=1 000 U/g，由甘肃赛诺生物科技有限公司提供。

1.1.3 培养基

包括MRS肉汤培养基、MRS琼脂培养基、LB肉汤培养基、LB琼脂培养基、YPD肉汤培养基及YPD琼脂培养基。

1.1.4 其他材料

蒸馏水、蔗糖。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的活化与传代

将实验室冻存的罗伊氏乳杆菌（LR）、植物乳杆菌（LP）和乳酸片球菌（PA）从-80℃冰箱中取出解冻，在无菌条件下将其转移到MRS液体培养基中进行活化。将活化后的菌种按2%的接种量接种于MRS液体培养基，置于37℃环境孵育12 h。随后划线接种于MRS固体培养基中培养20～24 h。经过三代传代，第三代即为工作菌株。

对于枯草芽孢杆菌和酿酒酵母，可采用相同的方法，分别在LB培养基和YPD培养基下进行活化与传代。

1.2.2 发酵样品的制备

取150 g仔猪饲料、75 mL蒸馏水、4.5 g蔗糖与6 mL菌液（复合菌按照1∶1∶1或1∶1∶1∶1或1∶1∶1∶1∶1的比例）置于密封袋中，将密封袋排气封口，再将饲料混合均匀，置于37℃烘箱发酵48 h。

1.2.3 发酵菌种的筛选

将罗伊氏乳杆菌（LR）、植物乳杆菌（LP）、乳酸片球菌（PA）、枯草芽孢杆菌（BS）和酿酒酵母（SC）按单菌和复合菌（1∶1∶1或 1∶1∶1∶1或1∶1∶1∶1∶1）比例组合，按4%菌液接种量，50%蒸馏水添加量，3%蔗糖添加量，混合均匀后置于37℃恒温箱培养，发酵48 h。发酵结束后，将发酵饲料于65℃环境中烘干，测定发酵饲料样品中酸溶蛋白、总酸和乳酸的含量。

1.2.4 菌液接种量优化

将筛选出的菌种作为发酵菌种，分别按菌液接种量4%、6%、8%接入发酵样品，其余发酵条件不变，测定发酵饲料样品pH、总酸和乳酸的含量。采用单因素试验，每个因素水平设置三个重复。

1.2.5 复合酶添加量优化

在确定菌种和菌液接种量后，分别按复合酶制剂添加量0.018%、0.036%、0.054%加入发酵样品，其余发酵条件不变，测定发酵饲料样品中酸溶蛋白的含量。采用单因素试验，每个因素水平设置三个重复。

1.2.6 发酵样品酸溶蛋白测定

称取1 g发酵样品，加入15%三氯乙酸溶液溶解并定容至50 mL，混匀后静置5 min。用中性定量滤纸过滤后移至离心管，以4 000 r/min离心10 min，取10 mL上清液，后续操作按照粗蛋白的测定方法。

计算公式为：酸溶蛋白（%）＝（V₁-V₂）×C×0.014×6.25×M×10/50式中：V₁、V₂分别为试样和空白组滴定时消耗盐酸标准溶液体积（mL）

1.2.7 发酵样品总酸测定

称取0.5 g发酵样品，放入250 mL烧杯中，加100 mL蒸馏水，60℃水浴30 min。用中性滤纸过滤后取40 mL上清液，加2～3滴1%酚酞指示剂，用氢氧化钠标准溶液滴定至微红且30 s不褪色，记录氢氧化钠消耗体积。空白组用水代替试液。

计算公式为：总酸（%）＝[（V₂-V₁）×C×0.090 08]/（M×0.4）×100

式中：V₁、V₂为空白和试样滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积（mL）；M为样品质量（g）；C为氢氧化钠标准溶液浓度（0.1 mol/L）。

1.2.8 发酵样品乳酸测定

称取0.5 g发酵样品，放入离心管中，加1 mL蒸馏水摇匀，过夜浸泡12 h。后将其放入均质仪中匀浆，以3 500 r/min离心5 min，取上清液用乳酸试剂盒进行检测（试剂盒购于南京生物建成工程研究所）。

计算公式为：乳酸含量

（mmol/L）＝（A测定-A空白）/（A标准-A空白）×C标准×N 

式中：N为样本前处理稀释倍数。

1.2.9 发酵样品pH测定

称取10 g发酵样品，加入90 mL蒸馏水，振荡1 h，充分混匀，使用STARTER 3100台式pH计测得上清液pH。

1.3 数据统计与分析

试验数据利用Excel软件整理，使用SPSS Statistics 26.0进行one-way ANOVA，多重比较用Duncan’s法，差异显著用P＜0.05表示，差异不显著用P＞0.05表示。结果用平均值±标准差表示。并通过TOPSIS综合评分法进行排名。

2.1 发酵菌种的筛选

不同菌种组合对饲料成分的影响见表1。

由表1可知，LR单菌组乳酸含量显著高于其他菌种组合（P＜0.05），LR单菌和LR+LP+PA+SC组酸溶蛋白含量显著高于其他菌种组合（P＜0.05），LR+BS+SC组和LR+LP+BS+SC组总酸含量显著高于其他菌种组合（P＜0.05）。

不同菌种组合饲料发酵品质的综合评价见表2。

针对上述14个组合，将表1所测得的总酸、乳酸和酸溶蛋白含量分别按照0.3、0.3、0.4的权重进行TOPSIS综合评分法分析。结果表明，LR发酵效果最佳，PA发酵效果次之，BS发酵效果最差。根据表2可以得出饲料发酵品质评分排序：LR＞PA＞LR+LP+PA+BS＞LR+LP+PA+SC＞LR+LP+PA+SC+BS＞LP＞PA+BS+SC＞LP+BS+SC＞PA+LP+BS+SC＞LR+PA+BS+SC＞LR+BS+SC＞LR+LP+BS+SC＞SC＞BS。

2.2 菌液接种量优化

不同接菌量对饲料成分的影响见表3。

由表3可知，接菌量6%组总酸和乳酸含量均显著高于4%和8%组（P＜0.05），接菌量8%组总酸和乳酸含量也均显著高于4%组（P＜0.05）。

添加不同接菌量饲料发酵品质的综合评价见表4。

针对上述3个组合，将表3所测得的乳酸、总酸、pH分别按照0.4、0.3、0.3的权重进行TOPSIS综合评分法分析。由表4可知，LR接种量为6%时发酵效果最佳，LR接种量为8%时发酵效果次之，LR接种量为4%时发酵效果最差。根据表4可以得出饲料发酵品质评分排序：LR（6%）＞LR（8%）＞LR（4%）。

2.3 复合酶添加量优化

添加不同含量复合酶饲料发酵品质的评见表表5。

由表5可知，复合酶添加量为0.036%时，酸溶蛋白含量显著高于0.018%组和0.054%组（P＜0.05）。

3.1 发酵菌种的筛选

发酵饲料中的酸溶蛋白含量能够反映大分子蛋白降解为小分子蛋白的程度，常用该指标来评估饲料中的小肽含量。酸溶蛋白含量越高，说明饲料中的大分子蛋白更容易被微生物分解利用，饲料发酵效果越好。在发酵过程中，乳酸菌能够产生乳酸和其他挥发性脂肪酸等有机酸，能有效维持肠道菌群平衡，减少病原菌微生物的滋生，并调节胃肠道功能。因此，本试验以酸溶蛋白含量、乳酸和总酸为指标，筛选出最佳菌种。王通等研究表明，随着温度的逐渐上升，发酵豆粕中的酸溶蛋白含量会经历一个先增后减的过程。当温度达到37℃时，酸溶蛋白的含量会达到一个峰值。丛珊滋等研究选用鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌两种乳酸菌为发酵菌株，随着接种量的增加，总酸含量起初呈现持续上升的趋势，但随后逐渐趋于稳定。然而，当接种量超过5%时，总酸含量却出现了轻微的下降趋势。赵华修等研究表明，对于猪而言，蔗糖是愉悦且纯正的甜味，所以饲料中甜味剂的甜度越趋近于蔗糖的甜感，其甜度越好。在基础日粮中增加3%的蔗糖，能有效地在仔猪断奶后的一个星期内提升其食欲，进而增加其每日采食量和全期窝增重。在水分不足时，菌种与原料、水分接触不均，导致原料发酵不充分。菌株在干燥环境下生长缓慢，代谢能力减弱，可溶性蛋白含量降低。水分过高则使培养基黏稠，溶氧量降低，影响微生物生长繁殖。所以本试验初始发酵条件定为4%菌液接种量、3%蔗糖添加量、50%蒸馏水添加量，混合均匀后置于37℃恒温箱培养，发酵48 h。通过TOPSIS综合评分法分析，发现LR单菌配合发酵仔猪料效果最佳。理论上，多菌株混合发酵能够利用不同菌株各自的发酵特性，达到协同增效的效果。然而，在实际操作中，不同试验条件、不同菌株之间可能会产生拮抗作用，从而影响发酵效果。王微等研究表明，将酵母菌、芽孢杆菌和乳酸菌均放在YPD培养基培养生长，其中植物乳杆菌与枯草芽孢杆菌之间存在拮抗关系。李可义研究表明，在其试验条件下，芽孢杆菌对乳酸菌起促进作用，而酵母菌在前期对乳酸菌表现出一定的协同作用，后期却又存在拮抗作用。

3.2 菌液接种量优化

设置菌液接种量梯度依次为4%、6%、8%，对其进一步优化。乳酸菌在发酵过程中会产生大量有机酸，时间越长作用越明显，这导致其pH下降。pH体现了饲料发酵时的酸碱平衡，pH过高或过低，可能会影响动物的消化吸收能力。因此选择乳酸、总酸和pH作为评估指标，对其进行TOPSIS综合评分法分析。结果表明：LR接种量为6%时发酵效果最佳。张立东等研究选用平菇菌糖饲料为原料，以枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌为发酵菌种，确定最佳菌液接种量为16%。郭依萍等研究选用玉米副产品型饲料为原料，以植物乳杆菌和酿酒酵母作为发酵菌种，确定最佳菌液接种量为12%。本试验研究结果与前人的报道存在差异，造成这一现象的原因有很多，发酵原料和菌种的选择、发酵条件的变化，以及贮存环境的差异都有可能对最终结果产生影响。

3.3 复合酶添加量优化

多项试验表明，添加酶制剂对改善饲料品质有明显作用。郭依萍等研究表明，菌酶协同发酵可以显著提高玉米副产品型饲料中营养成分含量，可以有效提高粗脂肪和粗蛋白质含量，并降低粗纤维含量。何玮等研究表明，纤维素酶与乳酸菌制剂混合发酵，有效提升了青贮饲料的干物质与粗蛋白含量。李玮等研究表明，在基础日粮中加入复合酶制剂，可显著促进断奶仔猪的生长，优化其对饲料营养的消化过程，进而提升营养物质的吸收效率。因此在课题组前期的研究基础上进一步改进，设置了三个梯度，依次为0.018%、0.036%、0.054%，针对酸溶蛋白指标评定发酵饲料效果，发现复合酶添加量为0.036%时配合发酵仔猪饲料效果最优。