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本研究采用的方法已在Figure 1 中展示为流程图。
3.2 差异表达基因筛选与加权基因共表达网络分析构建
EOCRC 和 LOCRC 基因表达矩阵和临床数据从 TCGA 数据库下载。作者使用|log2FC| > 2.5, P < 0.01的标准筛选差异表达基因（DEGs）。在EOCRC中鉴定出1,411个DEGs，在LOCRC中鉴定出3,434个DEGs（ Figures 2A,B ）。通过针对EOCRC和LOCRC的个体化WGCNA分析，评估这些DEGs与临床特征之间的关联，软阈值分别设置为4和7，以确保网络构建的生物学意义（ Figures 2C,D ）。在分析中选择了M和N作为临床特征，以识别与转移相关的基因模块。作者发现EOCRC中青色模块与M呈正相关，相关系数为0.25。在LOCRC中，蓝色和灰色模块与N呈正相关，黄色模块与M呈正相关，相关系数分别为0.12、0.12和0.11。根据这些发现，选择了与M和N显著相关的模块进行进一步分析（ Figures 2E,F ）。
差异表达基因筛选和加权基因共表达网络分析构建。(A) EOCRC 中差异表达基因的火山图。(B) LOCRC 中差异表达基因的火山图。(C) EOCRC 中软阈值β = 4。(D) LOCRC 中软阈值β = 7。(E) 热图展示了 EOCRC 中模块与临床特征的关系。(F) 热图描绘了 LOCRC 中模块与临床特征的关系。关键词：DEGs：差异表达基因；EOCRC：早发性结直肠癌；LOCRC：晚发性结直肠癌。
作者使用维恩图来识别与 EOCRC 转移特异性相关的 44 个基因（ Figure 3A ）。作者对这些基因进行了功能分析，以更深入地了解它们的生物学作用和作用机制。DO 分析结果表明，这些基因主要与路易体痴呆和情绪障碍相关（ Figure 3B ）。生物学过程（BP）主要与突触组织和膜电位调控相关，细胞组分（CC）与神经元胞体和突触后膜相关，分子功能（MF）主要与离子通道活性相关（ Figure 3C ）。KEGG 分析表明，这些基因主要参与神经活性配体-受体相互作用和钙信号通路（ Figure 3D ）。
筛选关键模块 DEGs 和功能分析。(A) 显示仅与 EOCRC 转移相关的特征基因的维恩图。(B) DO 分析。(C) GO 分析。(D) KEGG 分析。关键词：DEGs：差异表达基因；EOCRC：早发性结直肠癌；DO：疾病本体；GO：基因本体（GO）；KEGG：京都基因与基因组百科全书。
作者采用两种方法来突出与 EOCRC 转移相关的特征基因。SVM-RFE 技术识别出 19 个基因，而 LASSO 回归分析筛选出 5 个基因。( Figures 4A,B )。作者使用维恩图对两种方法的筛选结果进行交集分析，最终选择了四个特征基因：LINC02268、 AC092652.1 、GRIK1 和 PMP2 ( Figure 4C )。作者绘制了它们的 ROC 曲线，并计算了曲线下面积（AUC）值，分别为 0.995、0.995、1.000 和 0.997。这些高 AUC 值表明这些基因作为疾病特征基因具有很高的准确性，可能成为有效的诊断生物标志物。( Figure 4D )。
基于机器学习的特征基因筛选及后续验证。(A) 通过 SVM-RFE 算法验证生物标志物特征基因的表达。(B) 通过 LASSO 算法进行特征选择调整。(C) 两种机器学习算法的维恩图。(D) 四个特征基因的 ROC 曲线。关键词：ROC：受试者工作特征曲线；SVM-RFE：支持向量机-递归特征消除；LASSO：最小绝对收缩和选择算子。
作者进一步分析了 EOCRC 样本与对照组样本之间免疫浸润的差异。在激活 B 细胞、激活 CD8 T 细胞、效应记忆 CD4 T 细胞、效应记忆 CD8 T 细胞、γδ T 细胞、未成熟 B 细胞、记忆 B 细胞、T 滤泡辅助细胞、I 型 T 辅助细胞、CD56bright 自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤 T 细胞和中性粒细胞中观察到显著差异（ Figure 5A ）。这些结果表明 EOCRC 肿瘤微环境中免疫细胞的组成和功能状态发生了显著改变，提示免疫细胞可能在 EOCRC 的发生和发展中发挥作用。作者利用 ssGSEA 算法评估了 EOCRC 中四个特征基因与免疫细胞之间的关系。作者发现这四个特征基因与激活 B 细胞、嗜酸性粒细胞、未成熟 B 细胞、肥大细胞和中性粒细胞密切相关，提示它们可能通过免疫微环境调节在疾病进展中发挥推定作用（ Figure 5B ）。 此外，免疫检查点分析记录了这四种特征基因与免疫相关基因之间存在正相关关系（ Figure 5C ）。
特征基因的免疫分析和免疫检查点分析。(A) 在 EOCRC 患者样本和健康个体之间观察到免疫浸润的差异。(B) 四个特征基因与 28 种免疫细胞的关联性。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。(C) 四个特征基因与免疫检查点基因的关联性。关键：DEGs：差异表达基因；EOCRC：早发性结直肠癌。
3.6 PMP2 在早发性结直肠癌中表达不足，并抑制细胞侵袭和迁移
作者选择 PMP2 进行后续实验，因为目前没有关于 PMP2 与 CRC 相关性的报道。作者从北方战区总医院获得了 49 对 EOCRC 和邻近正常组织。qRT-PCR 结果显示，与正常样本相比，EOCRC 组织中 PMP2 水平显著降低（ Figure 6A ）。随后，作者使用 IHC 分析了三对 EOCRC 和邻近正常样本中 PMP2 的表达水平，发现 PMP2 在 EOCRC 中表达下调（ Figure 6B ）。接下来，作者使用三种不同的 siRNA 敲低 HCT116 细胞中的 PMP2，以验证 siRNA 敲低效率。qRT-PCR 结果显示，与 siNC 组相比，转染 siPMP2#1/2/3 的 HCT116 细胞中 PMP2 表达显著降低（ Figure 6C ）。此外，降低的 PMP2 表达显著增强了 HCT116 和 LOVO 细胞的迁移和侵袭能力，优于 siNC 组（ Figures 6D,E ）。这些结果表明，PMP2 敲低显著增强了 HCT116 和 LOVO 细胞的迁移和侵袭能力。综上所述，作者的研究结果表明，PMP2 在 EOCRC 肿瘤发生过程中发挥抑制肿瘤转移的作用。
PMP2 在 EOCRC 中表达不足，并抑制 EOCRC 的侵袭和迁移。(A) 比较 EOCRC 组织与邻近非肿瘤黏膜中 PMP2 mRNA 水平的差异。*p < 0.05。(B) 比较 EOCRC 组织与邻近非肿瘤黏膜中 PMP2 蛋白水平的差异。(C) 使用 qRT-PCR 检测 HCT116 细胞中 siPMP2#1、siPMP2#2 和 siPMP2#3 的转染效率。*p < 0.05，***p < 0.001。(D) 评估 PMP2 敲低后 HCT116 和 LOVO 细胞的迁移能力。(E) 评估 PMP2 敲低后 HCT116 和 LOVO 细胞的侵袭能力。**P < 0.01，***P < 0.001。关键：EOCRC：早发性结直肠癌。
在这项研究中，作者通过整合 WGCNA、LASSO 和 SVM-RFE 方法，能够识别出与 EOCRC 转移相关的四个特征基因。作者还验证了 PMP2 的下调可能与 EOCRC 患者的预后不良相关。作者的研究证实了 PMP2 在 EOCRC 中分子水平和蛋白水平上的低表达。该研究还通过迁移和侵袭实验表明 PMP2 抑制 EOCRC 的转移。这项研究为未来探索 EOCRC 转移机制和开发新型诊断生物标志物提供了有趣的视角。对这篇文章的思路感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！生信分析定制服务
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