一、背景及目的：
赖氨酸（Lys）是水稻（Oryza sativa L.）中的第一限制性必需氨基酸，而在以稻米为主的膳食中通常含量不足。赖氨酸缺乏会损害免疫功能，并引发骨质疏松症和高赖氨酸血症等疾病。水稻是世界上一半以上人口的主食，因此通过育种和栽培提高稻米中的赖氨酸含量对于改善饮食质量和公众健康至关重要。
稻米中的氨基酸含量，包括赖氨酸（Lys）含量，不仅因水稻品种而异，同一品种的不同籽粒类型间也存在差异。具体而言，在水稻灌浆期间，较早开花的强势粒（SCs）的谷氨酸、天冬氨酸和总氨基酸（TAAs）含量通常高于较晚开花的弱势粒（ICs）。然而，目前对于不同水稻品种在灌浆期间SCs和ICs中Lys含量的动态变化，以及这些变化与糙米和精米中最终Lys含量的关系知之甚少。
从结构上看，水稻籽粒（不包括内稃和外稃）由三个主要组织层组成：外层（果皮、种皮、珠心层和糊粉层）、中层（外层胚乳）和内层（核心胚乳）。虽然外层富含包括赖氨酸（Lys）在内的氨基酸，但在碾米加工过程中大部分会被去除。中层和内层构成了精米。因此，提高这些内层中赖氨酸的比例，是提高精米营养价值的一个有前景的策略。
氮（N）管理，尤其是生育中期追肥，是调控水稻产量和品质的一项重要措施。总体而言，氮肥在三个生育期进行追肥：穗分化期（促进颖花分化）、雌雄蕊分化期（减少颖花退化）和始穗期（促进籽粒灌浆）。虽然这些施氮措施可以提高稻谷中的蛋白质和总氨基酸含量，但也可能降低精米中的赖氨酸含量。
本研究旨在：探究灌浆期强势粒和弱势粒中赖氨酸（Lys）含量及其合成代谢的动态变化；分析灌浆期不同籽粒组织层中Lys含量与糙米和精米最终Lys含量之间的关联；确定能促进精米中Lys积累的生育中期氮肥管理措施。为研究其生理机制，本文测定了灌浆期参与Lys代谢的四种关键酶的活性，包括天冬氨酸激酶（AK，EC2.7.2.4）、二氢吡啶二羧酸合成酶（DHDPS，EC4.2.1.52）、赖氨酸α –酮戊二酸还原酶（LKR；EC1.5.1.8）和酵母氨酸脱氢酶（SDH，EC1.5.1.9）。研究结果有望为水稻籽粒中Lys的生物合成提供新的见解，并通过改进氮肥管理为提高水稻营养品质提供切实可行的策略。
二、实验设计
表S1 试验田土壤质地和主要性质
试验地点描述2019年、2020年和2021年水稻生长季（5月至10月），在中国江苏省扬州大学的试验农场（北纬32°30′，东经119°25′）开展了两项田间试验。土壤质地和其他主要性质见表S1。试验地点三年间水稻抽穗至成熟期间的日温度、日照时长和降水量见图S1。
表S2 试验1中水稻的播种期、抽穗期和生理成熟期，以及氮、磷、钾的施用量
分别在移栽前（81千克/公顷）、移栽后7天（36千克/公顷）、穗分化始期（31.5千克/公顷）和雌雄蕊分化期（31.5千克/公顷）以尿素形式施用氮肥。在水稻移栽前施用过磷酸钙（P2O513.5%）形式的磷肥和氯化钾（K2O52.0%）形式的钾肥。抽穗期指约50%植株的稻穗从叶鞘中抽出的时期。生理成熟期定义为约90%籽粒达到最大干重的时期。
本实验旨在研究不同水稻品种和不同籽粒层次在灌浆过程中，强势粒和弱势粒中赖氨酸（Lys）含量的动态变化。2019年和2020年，在稻田中种植了6个品种，其中包括3个粳稻自交系：武运粳24、镇稻2号和南粳9108，以及3个籼稻自交系：扬稻6号、南粳11和国际24号。这些品种因其较高的谷物产量和优良品质，已被或正在当地生产中使用。为确保抽穗期和灌浆期相近，根据每个品种的生育期调整了播种日期。供试品种的播种、抽穗和生理成熟日期见表S2。种子播于苗床，25日龄幼苗以每穴2株、穴间距0.30 m×0.13 m的规格移栽至稻田。氮（N）、磷（P）、钾（K）的施用量和施用时间见表S2。除移栽后天数（DAT）31 -35天进行排水外，收获前一周前，田间水位保持在4 -5 cm。采用完全随机区组设计，每个处理设置3次重复。小区面积为6.0 m×5.2 m，小区间以0.80 m宽的通道分隔，塑料薄膜插入土壤深度为0.50 m，以防止水肥流失。
每个品种选取约600个生长一致、抽穗期相同的稻穗并进行标记。记录部分标记稻穗的开花日期。从开花期到最终收获，每隔3天从每个小区采集10 -12个标记稻穗。从采集的稻穗中收集强势粒（标记稻穗上部一次枝梗上的籽粒）和弱势粒（标记稻穗下部二次枝梗上的籽粒），并手动去除颖壳和胚。将约五分之一采集的籽粒烘干称重，其余用液氮冷冻，用于测定氨基酸含量和赖氨酸合成代谢关键酶的活性。
根据初步观察，自交系的强势粒灌浆期间赖氨酸（Lys）含量的峰值增长率（PIR）出现在花后9 -12天（DPA），而杂交种的弱势粒则出现在花后18 -24天。因此，选取这些天的籽粒来测定不同组织层中氨基酸含量以及Lys合成代谢关键酶的活性。将冷冻的籽粒切片并分离成不同的组织层。使用高速氨基酸分析仪测定了强势粒、弱势粒以及颖果各层中赖氨酸（Lys）和其他氨基酸的含量。
实验2中的材料、设计
本实验旨在研究灌浆期籽粒及籽粒不同层次中赖氨酸（Lys）含量对中期氮肥管理的响应。2020年和2021年，在田间种植了两个水稻品种，分别为南梗9108（粳稻）和扬稻6号（籼稻）。播种日期、秧苗种植密度、磷钾肥的施用量和施用时间以及水分管理均与实验1相同。
该实验采用2 ×4析因设计，包括两个水稻品种和四种中期氮肥追施处理，形成8种处理组合。每个处理采用完全随机区组设计，设置三个重复小区。小区面积为6.00 m ×5.20 m。四种氮肥追施处理包括中期不施氮肥（N0）、穗分化始期施氮肥（N1）、雌雄蕊分化期施氮肥（N2）和始穗期施氮肥（N3）。N1、N2或 N3处理的施氮量为63.0 kg ha⁻¹，以尿素形式施用。在进行中期氮肥追施处理之前，四种氮肥处理均在移栽前一天以81 kg ha⁻¹ 的用量施用尿素，移栽后七天以36 kg ha⁻¹ 的用量施用尿素。N0（对照）处理的总施氮量为117 kg ha⁻¹，N1、N2 和 N3处理的总施氮量为180 kg ha⁻¹。
三、结果与分析
图1 不同水稻品种灌浆期强势粒和弱势粒赖氨酸含量的增加情况
强势粒和弱势粒赖氨酸含量随时间的变化在籽粒灌浆过程中，强势粒和弱势粒的赖氨酸含量（µg·粒⁻¹）增加均呈“S”形。强势粒的赖氨酸含量高于弱势粒，且增加速度更快。强势粒赖氨酸含量的峰值增长率（PIR）出现时间早于弱势粒（分别为花后9 -12天和18 -24天），且数值更高（图2A – D）。然而，赖氨酸含量的峰值增长率，尤其是弱势粒的，因水稻品种而异。
图2 不同水稻品种灌浆期强势粒（A、B）和弱势粒（C、D）赖氨酸含量的增加率
表1 成熟期糙米和精米中的赖氨酸含量（µg·籽粒-1）和浓度（mg·g-1干重）
在成熟时，对于所有品种而言，无论是糙米还是精米，强势粒的赖氨酸含量（µg·籽粒⁻¹）和浓度（mg·g⁻¹干重）均高于弱势粒，不过强势粒和弱势粒之间的赖氨酸浓度差异并非总是显著（表1）赖氨酸含量峰值增长率较高的品种，其糙米和精米在成熟时的赖氨酸含量和浓度也较高。与弱势粒相比，强势粒精米中赖氨酸含量占比也高于糙米。
图3 不同水稻品种籽粒不同层次的赖氨酸含量
在籽粒灌浆期间赖氨酸含量的峰值增长率（PIR）时，颖果外层的赖氨酸含量在强势粒和弱势粒之间以及不同水稻品种之间均无显著差异，但在中层和内层，强势粒与弱势粒之间以及不同品种之间存在差异（图3A、B）。一般来说，强势粒中层和内层的赖氨酸含量高于弱势粒，品种ZD -2和NJ -11中层和内层的赖氨酸含量高于品种NJ -9108和IR -24。
图4 不同水稻品种的籽粒不同层次中赖氨酸生物合成关键酶的活性
参与赖氨酸生物合成的关键酶天冬氨酸激酶（AK）和二氢吡啶二羧酸合成酶（DHDPS）的峰值活性在强势粒中高于弱势粒。无论是强势粒还是弱势粒，赖氨酸含量峰值增长率较高，且颖果中层或内层赖氨酸含量较高的品种，其AK和DHDPS的活性也较高。颖果外层中这两种酶的活性在强势粒和弱势粒之间以及不同水稻品种之间没有显著差异。
表2不同施氮处理下水稻灌浆期籽粒中赖氨酸积累峰值增长率及峰值增长率时的赖氨酸含量
N0、N1、N2 和 N3分别表示生育中期不额外施氮、穗分化始期施氮、雌雄蕊分化期施氮和抽穗始期施氮。
与 N0（生育中期不施氮）相比，生育中期追施氮肥处理（N1、N2 和 N3）显著提高了强势粒和弱势粒的赖氨酸含量峰值增长率和赖氨酸含量，在弱势粒中效果更显著。两个供试品种表现出相似的响应。
图5 不同孕穗期施氮（N）处理下水稻颖果不同层次的赖氨酸含量
与 N0处理相比，N1 和 N2显著提高了外层、中层和内层的赖氨酸含量，而 N3提高了外层和中层的赖氨酸含量。内层的赖氨酸含量在 N0 和 N3之间没有显著差异，且N3处理下的含量低于 N1或 N2处理。然而，与其他任何氮肥处理相比，N3显著降低了精米中赖氨酸含量占糙米中赖氨酸含量的比例，这与灌浆期颖果内层较低的赖氨酸含量一致。
表3 不同生育中期施氮处理下糙米和精米成熟时的赖氨酸含量与浓度
三种追施氮肥处理均显著提高了成熟期糙米和精米中的赖氨酸含量和浓度。总氨基酸（TAA）含量也呈现出类似的模式，包括峰值增长率及其在颖果不同层次的分布，以及成熟期糙米和精米中的 TAA含量。由于2020年和2021年灌浆期的气候条件相似，两个研究年份中，生育中期追施氮肥处理对成熟期糙米和精米中赖氨酸和 TAA含量及浓度的影响，以及对精米中赖氨酸含量占糙米中赖氨酸含量比例的影响均无显著差异。
图6 不同孕穗中期施氮处理下水稻籽粒不同层次中赖氨酸生物合成关键酶的活性
与不施氮（N0）相比，施氮处理（N1和N2）显著提高了强势粒和弱势粒整个籽粒以及外、中、内各层中AK和DHDPS的峰值活性，且弱势粒的增幅更为明显。在所有处理中，高氮处理（N3）使颖果外层这两种酶的活性达到最高，但与N1或N2处理相比，其内层酶活性较低。
图7 不同孕穗期施氮处理下，水稻颖果不同部位赖氨酸分解代谢关键酶的活性
强势粒和弱势粒之间，以及不同施氮处理之间，整个颖果及其各层的琥珀酸脱氢酶（SDH）峰值活性均无显著差异。与不施氮处理（N0）相比，三个生育中期追氮处理（N1、N2和N3）提高了整个籽粒及其各层的赖氨酸酮戊二酸还原酶（LKR）峰值活性，且外层的增加幅度更大。然而，在同一类型籽粒的同一层中，三个追氮处理间的LKR活性差异不明显。
四、总结：
与弱势粒相比，强势粒在籽粒灌浆过程中赖氨酸（Lys）含量的峰值增长率（PIR）出现更早且更高，同时籽粒中层和内层的赖氨酸积累量也更高；然而，这些模式在不同水稻品种间存在很大差异。强势粒以及籽粒中层和内层较高的赖氨酸含量主要归因于赖氨酸生物合成的增强，而非分解代谢活性的降低。赖氨酸含量的峰值增长率与成熟籽粒中的赖氨酸含量密切相关，籽粒中层和内层的赖氨酸积累与成熟精米中的赖氨酸含量呈正相关。这些发现表明，在籽粒灌浆期间提高峰值增长率并增强内层的赖氨酸积累是一种有效的策略，用于提高水稻的营养品质。重要的是，在穗分化始期或雌雄蕊分化期施用氮肥，能显著提高这些层次（尤其是弱势粒）的峰值增长率和赖氨酸生物合成，最终使收获时精米中的赖氨酸含量增加。