可变剪切

真核生物的编码区是不连续的，分为外显子（exon）和内含子（intron），在转录过程中会修剪内含子（intron），拼接外显子（exon）来形成转录产物（mRNA）。

一条未经剪接的preRNA，要将非编码蛋白质的内含子（intron）切除，同一基因中的很多个外显子以不同形式进行随机组合（在剪切的过程中是有可能剪切掉一些外显子的），使一个基因在不同时间、不同环境中能够制造出不同的蛋白质，增加生理状况下系统的复杂性或适应性。这个过程有多种多样的剪切和拼接方式，从而产生不同的剪切异构体（isoform）。

7种可变剪切类型

（参考链接：https://www.jianshu.com/p/c985b9054298）

（1）ES（Exon skipping，外显子跳跃）指一个外显子从初始转录物上被剪切掉。如图A所示，基因发生可变剪接形成两种不同的转录本， 第1种转录本比第2种转录组本多一个外显子，我们将这种外显子称为inclusive exon，inclusive exon两侧的两个外显子称为constitutive exon。
（2）A3SS（alternative 3′ splice site，可变的3’端）：基因发生可变剪接形成两种不同的转录本，它们的3’端剪接位点一致但5’端剪接位点不同， 第二种转录本的5’端外显子有所延长。
（3）A5SS（alternative 5′ splice site，可变的5’端）：基因发生可变剪接形成两种不同的转录本，它们的5’端剪接位点一致但3’端剪接位点不同， 第二种转录本的3’端外显子有所延长。
（4）RI（Retained intron，内含子保留）：基因发生可变剪接形成两种不同的转录本， 第2种转录本由retained Intron与两侧的外显子一起形成新的外显子（内含子没切掉）
（5）ME（Mutually exclusive exons，互斥外显子）：基因发生可变剪接形成两种不同的转录本，两转录本之间相同的外显子称为constitutive exon， 不同的外显子称为inclusive exon，两个inclusive exon不能同时存在与同一转录本中， 只能分别存在于不同转录本中。 这样的可变剪接事件称为Mutually Exclusive Exon。
（6）AP（Alternate promoter，可变启动子）：基因的两个转录本的区别在于第一个外显子不同，这样的可变剪接事件称为Alternative First Exon。
（7）AT（Alternate terminator，可变终止子）：基因的两个转录本的不同之处于最后一个外显子不同，这样的可变剪接事件称为Alternative last exon。

有哪些分析可变剪切的软件

没有之一！全网最全的可变剪切分析软件大全

rMATs软件

rMATS 是一种 RNA 测序数据分析软件，可用于发现基因剪切事件的变化。它的主要功能是从两个或多个不同条件的 RNA 测序数据中，比较同一基因在两个或多个条件下的剪切差异，并鉴定不同的剪切事件类型，包括 Alternative 5′ splice site, Alternative 3′ splice site, Exon skipping, Intron retention 和 Mutually exclusive exons 等。

1、软件安装

命令如下：conda insatall rMATS

检查是否安装成功：python rmats.py -h

出现如下信息就是可以了

2、软件使用

运行demo：

 python  rmats.py --nthread 4 --b1  paste0(output ,'/b1.txt') --b2'  paste0(output ,'/b2.txt') --od  output --tmp output -t paired  --gtf  Mus_musculus.GRCm39.110.gtf --readLength 150 --cstat 0.01

参数解读：

 –cstat 0.01

该参数定义了用于 差异剪接（differential splicing） 的假设检验中的阈值（cutoff）。它表示在零假设（null hypothesis）下，认为两组样本之间的剪接差异显著的最小值。
  • 默认值为 0.0001，对应于 0.01% 的差异。
  • 有效范围是 0 ≤ cutoff < 1。
  • 该参数不适用于配对统计模型（paired stats model）。
–readLength 151  #测序reads的长度
–gtf  dbPath_gtf  #参考基因组gtf文件
-t paired   #双端测序为paired，单端测序则为single
–tmp output #指定了存储 中间输出文件 的目录
–od  output #指定了存储 最终输出文件 的目录
 –nthread 4 #线程数

–b1 b1.txt 输入sample1的txt格式的文件，文件内以逗号分隔重复样本的bam文件名（实验组）

–b2 b2.txt 输入sample2的txt格式的文件，文件内以逗号分隔重复样本的bam文件名（对照组）

xxx表示绝对路径b1.txtxxx/A1.bam,xxx/A2.bam,xxx/A3.bamb2.txtxxx/B1.bam,xxx/B2.bam,xxx/B3.bam
注意：
以BAM作为输入，BAM文件要排序
用hisat2比对后产生sam，用samtools转换成bam，排序
  • samtools sort -@ 8 -o ${samplename}.bam  ${samplename}.sam
  • samtools index -@ 8 ${samplename}.bam
3、结果解读
rMATS的结果文件记录了SE、MXE、A3SS、A5SS、RI、5种可变剪切事件的分布（如图）
其中JC和JCEC的区别在于前者考虑跨越剪切位点的reads，后者不仅考虑前者的reads还考虑到只比对到第一张图中条纹的区域（也就是说没有跨越剪切位点的reads），但是我们一般使用JC的结果就够了（如果只是单纯的比较两组样品间可变剪切的差异的话）。
summary.txt所有AS事件类型的简要摘要。包括总事件计数和重要事件计数。默认情况下，如果FDR<=0.05，则将事件视为重要事件。
我们以MXE.MATS.JC.txt为例：

ID: 序号

GenelD: 可变剪接事件所在基因编号

geneSymbol: 可变剪接事件所在基因名称

chr: 可变剪接事件所在染色体

strand: 可变剪接事件所在染色体链的方向

1stExonStart_0base: 第一个可变剪接事件跳跃外显子的起始位置，以0开始计数

1stExonEnd: 第一个可变剪接事件跳跃外显子的终止位置

2ndExonStart_0base:第二个可变剪接事件跳跃外显子的起始位置，以0开始计数

2ndExonEnd: 第二个可变剪接事件跳跃外显子的终止位置

upstreamES: 可变剪接事件跳跃外显子的上游exon起始位置

upstreamEE: 可变剪接事件跳跃外显子的上游exon终止位置

downstreamES: 可变剪接事件跳跃外显子的下游exon起始位置

downstreamEE: 可变剪接事件跳跃外显子的下游exon终止位置

ID: 序号

分子生物学：什么是可变剪切，如何使用rmats软件分析AS

IJC_SAMPLE_1: 样本一在inclusion junction（IJC）下的count数，重复样本的结果以逗号分隔

SJC_SAMPLE_1: 样本一在skipping junction（SJC）下的count数，重复样本的结果以逗号分隔

IJC_SAMPLE_2: 样本二在inclusion junction（IJC）下的count数，重复样本的结果以逗号分隔

SJC_SAMPLE_2: 样本二在skipping junction（SJC）下的count数，重复样本的结果以逗号分隔

IncFormLen: 可变剪接事件Exon Inclusion Isoform的有效长度

SkipFormLen: 可变剪接事件Exon Skipping Isoform的有效长度

PValue: 两组样本间可变剪接事件表达差异显著性p值

FDR: 可变剪接事件表达差异显著性FDR值

IncLevel1: 处理组可变剪接事件Exon Inclusion Isoform在两个Isoform总表达量的比值

IncLevel2: 对照组可变剪接事件Exon Inclusion Isoform在两个Isoform总表达量的比值

IncLevelDifference: IncLevel1与IncLevel2的差值

（参考：rMATS分析可变剪接详细流程）

4、可视化-rmats2sashimiplot

命令如下：Conda insatall rmats2sashimiplot

检查是否安装成功：rmats2sashimiplot -h

出现如下信息就是可以了
运行demo：
rmats2sashimiplot --b1 xxx/A1.bam,xxx/A2.bam,xxx/A3.bam --b2 xxx/B1.bam,xxx/B2.bam,xxx/B3.bam  -t SE -e SE.MATS.JC.txt --l1 treat_name --l2 con_name  --exon_s 1 --intron_s 5 -o output
参数解读：

–b1和–b2：经过排序且有索引的bam文件

-t：rmats输出的可变剪接类型，5种类型分别是SE、 RI 、A3SS、 A5SS 和MXE

-e：对应-t所选参数的文件，这里是SE.MATS.JC.txt

–l1和–l2：输出对照组和实验组对应的名字，该参数可自定义

–o：结果输出的文件夹

可视化结果：

解读：
上
这是一个位置信息的展示（染色体号：位置信息：±链）
中
有6个样本，以其中一个样本为例

（1）右上角的：NBPF19 1_5dyn-1是sample ID

（2）左侧的RPKM是表达量情况

（3）图中曲线连接的地方代表剪切位点，对于inclusion  isoform而言，有两处剪切位点，exon1-exon2, exon2-exon3 之间的内含子需要被剪切，对于skipping isoform而言，只有1处剪切位点，即exon1-exon3，曲线旁边的数字代表检测到的比对到该区域的reads数目，示意如下

比如这张图中exon skipping isoform（外显子跳跃）的reads为 86、198、479
再举一个例子
比如这张图中样本A-1的exon Inclusion Isoform的reads数分别为176和159，exon skipping isoform的reads为2

（4）lnclevel是exon inclusion level，是Exon Inclusion Isoform在总（Exon Inclusion Isoform + Exon Skipping Isoform）所占比例

lnclevel的计算公式如下：
ψ = (I/lI)/[(S/lS) + (I/II)]

其中：

  1. I是指mapping到exon inclusion isoform的reads数
  2. S指mapping到exon skipping isoform的reads数
  3. II指exon inclusion isoform的有效长度
  4. IS 指exon skipping isoform的有效长度

（这部分不详细讲了，参考：https://www.jianshu.com/p/9c0f837fcab4）

下

根据GTF文件推算的可变剪切类型

通过这个图可以与上面7种可变剪切类型的示意图进行比对，发现这是第五种ME（互斥外显子）

#artContent h1{font-size:16px;font-weight: 400;}#artContent p img{float:none !important;}#artContent table{width:100% !important;}