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在非粘附条件下观察到 rhabdomyosarcoma 细胞系中存在 CIC 结构
尽管在非粘附条件下的上皮细胞中已有广泛报道（1 ），但非上皮细胞中是否会发生侵袭性细胞死亡尚不清楚。因此，我们研究了横纹肌肉瘤细胞在非粘附培养条件下是否表现出侵袭性细胞死亡。为此，我们比较了在粘附和非粘附组织培养板中生长的一系列细胞系中具有 CIC 结构的细胞比例。 Fig. 1 显示了一个典型的 CIC 结构。如图 Fig. 2A 和 B 所示，在 MCF-7 和 RD 细胞系中，非粘附培养条件下的具有 CIC 结构的细胞比例显著高于粘附培养条件（P=0.0297 和 P=0.0098）。然而，在 HT1080 或 ICH-ERMS-1 细胞系中，粘附条件下的具有 CIC 结构的细胞比例较低，并且在非粘附条件下没有显著变化。这些结果表明，CIC 结构不仅可能在上皮细胞中出现，也可能在非上皮细胞中出现。
（A）MCF-7 和（B）RD 细胞培养的 CIC 结构的代表性图像，经苏木精和伊红染色。放大倍数，x100。黑色箭头指示 CIC 现象。CIC，细胞内嵌。
比较在贴壁和非贴壁条件下培养的（A）MCF-7 细胞和（B）肉瘤细胞系中具有 CIC 结构的细胞比例。CIC，细胞内嵌；ns，无显著差异。
抑制 ROCK 信号通路阻断横纹肌肉瘤细胞中 CIC 结构的形成
先前研究 (17 , 18 ) 表明，通过使用 Y27632 抑制 ROCK 可以阻断细胞内吞作用 ( 31 )。为了确定 RD 细胞系中观察到的 CIC 结构是否代表细胞内吞作用，我们评估了在非粘附条件下培养并用 Y27632 处理的 RD 和 MCF-7 细胞中具有 CIC 结构的细胞比例。如图 Fig. 3 所示，与使用 DMSO 载体的培养相比，用 Y27632 处理的 MCF-7 (P=0.0021) 和 RD (P=0.0407) 细胞中具有 CIC 结构的细胞比例显著降低，这表明在非粘附条件下培养的 RD 细胞中观察到的 CIC 结构的出现是由于细胞内吞作用，而在 MCF-7 细胞（阳性对照）中也观察到了这种现象。
Y27632 对（A）MCF-7 和（B）RD 细胞中具有 CIC 结构的细胞比例的影响。DMSO 用作 Y27632 的载体。CIC，细胞内细胞。
为研究横纹肌肉瘤细胞侵袭性细胞内吞的分子机制，我们通过定量 PCR 比较了侵袭性 MCF-7 和 RD 细胞系与非侵袭性 HT1080 和 ICH-ERMS-1 细胞系中钙粘蛋白家族基因成员的表达水平。如图Fig. 4 所示，在 MCF-7 细胞系中，五种钙粘蛋白基因中 E-钙粘蛋白的表达水平最低，ΔCt 值为 2.6。相反，在 RD 细胞系中，神经钙粘蛋白（N-钙粘蛋白）的表达水平在五种钙粘蛋白基因中最低，ΔCt 值为 4.8。然而，与 RD 细胞系相比，HT1080（ΔCt 值为 11.0）和 ICH-ERMS-1（ΔCt 值为 8.8）细胞系中的 N-钙粘蛋白表达水平相对较高（图 Fig. 4 ）。总体而言，这些结果表明 E-钙粘蛋白和 N-钙粘蛋白分别参与了 MCF-7 和 RD 细胞系的侵袭性细胞内吞。
不同钙粘蛋白家族基因成员在指定细胞系中的 mRNA 表达水平。数据以平均ΔCt 值表示，GAPDH 被用作参考基因。较小的ΔCt 值表示较高的 mRNA 表达水平。
总结
总之，本研究首次证明，侵袭性细胞死亡现象——此前被认为仅限于上皮细胞——也可能发生在非上皮细胞中。我们还表明，非上皮细胞侵袭性细胞死亡涉及 N-钙粘蛋白，但不涉及 E-钙粘蛋白，这一侵袭性细胞死亡的发现此前未被报道。
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