导语

Discov Oncol | LPCAT3 通过介导铁死亡和内质网应激来调节 ccRCC 患者的免疫浸润和预后
结果：

数据检索和预处理
在本研究中，从 UCSC 下载 TCGA 数据库的 ccRCC RNA 测序数据（以及随附的临床信息），并根据以下标准进行提取和总结：（i） 患者被诊断为原发性 ccRCC，（ii） 患者具有注释良好的临床信息，以及 （iii） 患者的 OS 时间≥ 30 天。符合这些标准的患者被纳入后续分析。在当前研究纳入的 580 个样本中，509 个代表 ccRCC 样本和 71 个对照样本。接下来，70% 的 ccRCC 患者被随机提取两次，用作训练和验证数据集。两个弦的临床参数如表1 所示。此外，使用来自 GEO 数据库的两个外部队列 （ GSE53757 和 GSE66270 ） 来验证 LPCAT3 在肿瘤组织和正常组织中的差异表达。本研究的工作流程如图  1 .
本研究的工作流程
LPCAT3 在 ccRCC 患者中高表达，并且与 OS 相关
LPCAT3 的表达分析显示，其在 ccRCC 肿瘤组织中的表达显著高于癌旁正常组织（图 B2 、C）。这些结果与从外部验证数据集 GSE53757 获得的结果一致 GSE66270 （图  2 B、C）。qRT-PCR 分析显示，与癌旁正常组织相比，LPCAT3 在 ccRCC 组织中显著升高（图  2 D）。此外，作者通过免疫组化比较了 LPCAT3 在 ccRCC 组织和癌旁正常组织中的表达。结果显示，与癌旁正常组织相比，LPCAT3 在 ccRCC 组织中的表达显著性高，两组之间的表达差异具有统计学意义（图  2 G、H）。根据 LPCAT3 表达，训练和验证数据集中的样本分为高表达（>median 值）和低表达 （E、F）。研究表明，舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂 （TKI） 是 ccRCC 的一线疗法 [ 32 ]。为了评估 LPCAT3 作为 ccRCC 药物治疗靶点的潜力，作者使用“pRRophetic”软件包来预测训练和验证集中 LPCAT3 高表达和低表达的患者对舒尼替尼、帕唑帕尼和阿昔替尼的敏感性。在训练集中，LPCAT3 高表达的 ccRCC 患者对阿昔替尼（图 S1A）、帕唑帕尼（图 S1B）和舒尼替尼（图 S1C）的药物敏感性更高。在验证集中，LPCAT3 高表达的 ccRCC 患者对阿昔替尼（图 S1D）、帕唑帕尼（图 S1E）和舒尼替尼（图 S1F）的药物敏感性更高。结果表明，LPCAT3 可能代表了 ccRCC 患者的潜在治疗靶点。 作者还通过在线数据库基因表达谱交互式分析（GEPIA） 分析了 LPCAT3 表达在各种肿瘤中对患者生存的影响 [ 33 ]。有趣的是，作者发现 LPCAT3 高表达的结肠癌 （COAD） （图 S2A） 患者预后较好，而 LPCAT3 高表达的急性髓性白血病 （LAML） （图 S2B） 、低级别胶质瘤 （LGG） （图 S2C）、卵巢癌 （OV） （图 S2D） 和眼部黑色素瘤 （UVM） （图 S2E） 患者的预后较差。
LPCAT3 在 ccRCC 患者中高表达，并与总生存期相关。LPCAT3 在 TCGA 的肿瘤样本中显著高表达 （A）。LPCAT3 在来自 GSE66270 （B）和 GSE53757 （C）的外部验证集的肿瘤样本中也显著高表达。LPCAT3 在癌旁组织和肿瘤组织中的 mRNA 水平 （D）。生存曲线显示，在训练集（E）和验证集（F）中 LPCAT3 高表达的 ccRCC 患者预后较好。免疫组化染色显示，与癌旁正常组织 （G）相比，LPCAT3 在 ccRCC 组织中显著高表达，两组间表达差异有统计学意义 （H）
LPCAT3 低表达是 ccRCC 患者的独立预后危险因素
进行单因素和多因素回归分析，分析不同变量对预后的影响。单因素回归分析结果显示，LPCAT3 的表达是 OS 的独立影响因素 （HR = 0.593，p = 0.07）。同样，年龄 （HR = 1.031，p = 0.01）、分级 （HR = 1.894，p < 0.001）、分期 （HR = 1.956，p < 0.001）、T 分期 （HR = 1.967，p < 0.001） 和 M 分期 （HR = 2.053，p < 0.001） 也是 ccRCC 患者的独立预后危险因素（图   3 A）。通过多变量回归分析调整其他因素的影响后，LPCAT3 （HR = 0.663，p = 0.043）、年龄 （ HR = 1.030，p = 0.001） 和分 期 （HR = 1.962，p = 0.002） 的 表达是最终的独立预后因素（图  3 B）。这些结果与从测试数据中获得的结果一致（图  3 C、D）。
LPCAT3 低表达是 ccRCC 患者的独立预后危险因素。单变量 （A）和多变量（B）回归的森林图显示，LPCAT3 在训练集中的低表达 （n = 356） 是 ccRCC 患者的独立危险因素。单变量 （C）和多变量（D）回归的森林图分别显示，LPCAT3 在验证集 （n = 356） 中的低表达是 ccRCC 患者的独立危险因素
铁死亡通路在 LPCAT3 高表达的 ccRCC 患者中上调
根据 LPCAT3 的表达，将患者分为 LPCAT3 高表达组和低表达组。为了表征两组之间生物学功能的差异，进行了 GSEA 分析。该分析的结果见表 S2 和表 S3。生物过程 （BP）、分子功能 （MF） 和细胞成分 （CC） 的前十个基因本体论 （GO） 术语在条形图中可视化. 两个不同组的差异表达基因 （DEG） 响应氧水平、肠道吸收、二羧酸代谢过程、外源性转运、刷状边界膜、过氧化物酶体基质、微体腔、碳水化合物衍生物跨膜转运蛋白活性、NAD 结合、氧化还原酶活性，作用于醛或羰基供体。KEGG 通路结果显示，两个不同组的 DEGs 显著富集于缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、丙酮酸代谢和脂肪酸降解途径中（图4 B）。有趣的是，在 LPCAT3 高表达的患者中，铁死亡通路显著上调（图  4 C）。此外，在 LPCAT3 高表达的患者中观察到 ERS（图  4 D）。
LPCAT3 高表达患者的铁死亡通路和 ERS 相关通路显著上调。A 表示基因本体论 （GO） 功能注释中富集的前 10 个 BP 项目、CC 项目和 MF 项目。B 表示富集度前 30 个 KEGG 术语。GSEA 分析显示，铁死亡 （C）和 ERS 调控相关通路 （D）在 LPCAT3 高表达患者中显著过表达
LPCAT3 与铁死亡和 ERS 相关因素相关
进行 Pearson 相关性分析以探讨 LPCAT3 与铁死亡相关因素之间的相关性。结果表明，LPCAT3 与铁死亡相关基因显著相关，包括 ACSL4 （R = 0.466，p < 0.001）、NCOA4 （R = 0.722，p < 0.001）、PC BP1 （R = 0.57，p < 0.001）、PCBP2 （R = 0.546，p < 0.001）、TRFC （R = 0.486，p < 0.001） 和 SLC3A2 （R = 0.264，p < 0.001） （图  5 A-B）。 结果表明，LPCAT3 与铁死亡相关基因显著相关，包括 ACSL4 （R = 0.466，p < 0.001）、NCOA4 （R = 0.722，p < 0.001）、PCBP1 （R = 0.57，p < 0.001）、PCBP2 （R = 0.546，p < 0.001）、TRFC （R = 0.486，p < 0.001）、和 SLC3A2 （R = 0.264，p < 0.001） （图   5 A-B）。此外，作者进一步探讨了 LPCAT3 和铁 sis 通过 FerrDB 数据库 [ 34 ]。结果表明，铁死亡是一个多作用调节过程，受驱动器和抑制器调节，LPCAT3 作为铁死亡的驱动因素（图 S3）。此外，先前的研究表明，已发现 LPCAT3 与人类和小鼠的铁死亡有关 [ 23 ， 35 ]。 However，需要进一步探索其更微观的分子细胞调控关系。同样，探讨了 LPCAT3 与 ERS 相关因素之间的相关性
LPCAT3 的表达与铁死亡相关因子和 ERS 相关因子显著相关。气泡图 （A）和相关热图（B）表明 LPCAT3 与铁死亡相关因子的表达显著相关。同样，气泡图 （C）和相关热图（D）表明 LPCAT3 与 ERS 相关因子的表达显著相关
ERS 和细胞凋亡在 LPCAT3 高表达的 ccRCC 患者中被激活
比较两组中的关键 ERS 基因，以进一步了解 ccRCC 患者的 ERS 过程。大多数关键 ERS 基因在训练集（图 B6 ）和验证集（图  6 C）的高表达组中均高度表达，表明 ERS 在这些患者中被激活。研究表明，ERS 促进肿瘤细胞凋亡。因此，作者检测了两组中细胞凋亡相关因子的表达。结果表明，在训练集（图  6 B）和验证集（图  6 D）中，LPCAT3 高表达患者的细胞凋亡相关因子（例如 BCL2、CASP8、CASP9、FAS 和 TP53）的表达水平均显著增加。因此，可以合理地断言，铁死亡相关基因 LPCAT3 的高表达通过激活 ERS 然后增加肿瘤细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用。
ERS 和细胞凋亡在 LPCAT3 高表达的 ccRCC 患者中被激活。在训练集 （n = 356） 中，LPCAT3 高表达的患者通常 ERS 关键基因 （A）的表达增加，细胞凋亡相关基因的表达增加（B）。同样，在验证集（n = 356） 中，ERS 基因 （C）和细胞凋亡相关基因（D）在 LPCAT3 高表达的患者中也高表达
基于 LPCAT3 表达的 ccRCC 患者免疫浸润
肿瘤免疫与铁死亡之间存在复杂的串扰，因此，对两组患者进行 CIBERSORT 分析，以重建 ccRCC 患者免疫细胞的比例。结果表明，与 LPCAT3 表达低的患者相比，LPCAT3 高表达患者的 M1 巨噬细胞 （p < 0.05）、M2 巨噬细胞 （p < 0.001）、单核细胞 （p < 0.05） 和中性粒细胞 （p < 0.001） 的比例增加，并且 proportio 降低。记忆 B 细胞 （p < 0.05）、CD8+ T 细胞 （p < 0.05）、滤泡辅助性 T 细胞 （p < 0.01）、调节性 T 细胞 （Tregs）（p < 0.001）、活化记忆 CD4+ T 细胞 （p < 0.05） 和活化的自然杀伤 （NK） 细胞 （p < 0.001） 的 n 个（图  7 A）。结果表明，与 LPCAT3 低表达的患者相比，LPCAT3 高表达患者的 M1 巨噬细胞比例增加 （p < 0.05），M2 马 作者发现 LPCAT3 的表达与多种免疫细胞显著相关（图  7 B）;例如，它与 M2 巨噬细胞呈正相关 （R = 0.294，p < 0.001），与 Tregs 呈负相关 （R = -0.225，p < 0.001），活化的 NK 细胞 （R = – 0.223，p % 3C 0.001）、CD8+ T 细胞 （R = -0.141， p = 0.001）、滤泡辅助性 T 细胞 （R = -0.200， p < 0.001） 和活化记忆 CD4+ T 细胞 （R = -0.108， p = 0.014） （图  7 C-H）。例如，它与 M2 巨噬细胞呈正相关 （R = 0.294， p < 0.001），与 Tregs 呈负相关 （R = -0.225， p < 0.001）， 活化的 NK 细胞 （R = -0.223， p < 0.001）， CD8+ T 细胞 （R = -0.141， p = 0.001）， 滤泡辅助性 T 细胞 （R = -0.200， p < 0.001） 和活化的记忆 CD4+ T 细胞 （R = -0.108， p = 0.014） （图  7 C-H）。此外，作者进行 ed TCGA 数据库中 ccRCC 患者的 TIMER 免疫浸润分析（图 S4A），
ccRCC 患者的免疫浸润分析。箱线图显示了两组患者 （A）中 22 个免疫细胞浸润的比例。气泡图显示了 LPCAT3 与各种免疫细胞之间的相关性 （B）。气泡的大小表示相关性的绝对值，气泡的颜色表示 p 值。散点图表明 LPCAT3 的表达与 M2 巨噬细胞、T 细胞调节 （Tregs）、活化的 NK 细胞、CD8+ T 细胞、滤泡辅助性 T 细胞和活化的记忆 CD4+ T 细胞 （C-H） 的比例显著相关
考虑到 LPCAT3 的表达与多种免疫细胞的浸润显著相关，作者推断 LPCAT3 在 ccRCC 的免疫调节中起重要作用，是一个潜在的免疫治疗靶点。因此，作者进一步分析了 LPCAT3 与免疫检查点基因表达的相关性，结果显示 LPCAT3 与包括 PD1 在内的多种免疫检查点基因的表达显著相关（图 S5A-B）。作者检测了两组细胞凋亡相关因子的表达。结果显示，在训练集（图 S5C）和验证集（图 S5D）中，LPCAT3 高表达患者免疫检查点基因（如 PD1、CD86、HAVCR2、ICOLSG、LAIR1、PBRM1 和 LIGLEC7）的表达水平均显著增加。同时，研究表明，STAMBPL1 抑制协同增强 PD1 阻断和舒尼替尼的抗肿瘤作用 [ 36 ]，因此作者推测 LPCAT3 可能与免疫检查点基因存在复杂的串扰，这可能是新型免疫抑制剂的潜在靶点。

总结

综上所述，LPCAT3 在 ccRCC 患者中高表达，其表达与患者更好的预后和免疫细胞浸润相关。通过免疫浸润和关键基因表达的分析，作者探索并初步提出 LPCAT3 通过促进 ROS 形成促进 ccRCC 中的铁死亡。LPCAT3 还参与 ERS 以促进 ccRCC 中的细胞死亡。多种机制调节 ccRCC 的发生和发展，改善 ccRCC 患者的 OS （图8 ）。这些发现对 ccRCC 患者的管理具有许多潜在的预后和治疗意义。尽管作者的研究表明 LPCAT3 在 ccRCC 患者预后中的调节机制，但确切的机制仍有待实验探索和验证。