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在作者之前的研究中，作者设计并临床验证了多靶点 ddPCR 检测，结合了两到六个突变特异性探针与对应的野生型探针[49]。测定性能不逊于市售测定，LoD、LoB 和测间精度始终优异[49]。然而，这种多靶点检测只能检测每个反应的突变数量有限，且筛查能力受限，因为突变必须事先已知。为克服这些限制，作者建立了 KRAS 卸除 ddPCR 检测法，方法部分详细说明了程序。WT 分子产生双正（HEX + FAM）信号（见图 1，左上角）。如果发生突变引起的不匹配，drop-off 探针的次优杂交会导致 HEX 信号减少。这导致液滴云向仅 FAM 阳性的群体移动，比例与突变分子比例成正比（见图 1，右上+左下角）。完全转变为纯 FAM 阳性群体表明存在 100% VAF 的突变（图 1，右上角），而部分偏移则暗示野生型 DNA 与突变 DNA 的混合（图 1，左下角）展示了 ID Solutions® 商业 KRAS 投放套件在平行实验中获得的结果，供对比。作者的 KRAS 脱离分析法使得在极少的患者样本量下，一次实验中同时检测 KRAS 基因第 2 外显子 2 密码子 12/13 的多个基因组变异（见图 2）。下降检测显示所有测试变异表现均等效，确保涵盖突变的敏感性和特异性一致。
技术验证——使用通用卸除检测筛查KRAS 突变。展示了用 KRAS 滴落检测法检测 KRAS G12 V/D/R/A/C/S 和 G13D 的情况。绿色：KRAS WT 阳性液滴，蓝色：MUT KRAS 液滴，橙色：双正性（WT + MUT）液滴，灰色：空液滴。基于 ddPCR 实验的对照（仅 WT、仅 MUT、WT + MUT、NTC），各个簇是通过 Crystal Miner 软件形成的。在作者的 KRAS 滴落法中，加入了一个橙色簇代表双阳性液滴，表明同一液滴内同时囊含双阳性和仅 FAM 阳性液滴。这种共封导致新簇的形成。FAM，6-carboxyfluorescein;HEX，六氯荧光素;MUT，变种人;NTC，无模板控制;野生型，野生型
由于 Stilla Naica™晶体数字 PCR 系统提供三种不同的荧光团，作者在第二步中加入了第三个 Cy5 标记探针，该探针特异性结合 KRAS G12C。在晶体读取器程序中使用溢出补偿，使得更强的星团形成得以实现，如图 3 所示。包括 KRAS G12C 在内的 KRAS 卸除检测法均采用重组 DNA 进行逐项优化。利用第三个探针在降落设置下，可以同时筛查 KRAS 基因第 2 外显子 12/13 的 KRAS 变异，并特异性识别 KRAS G12C，这是一种在许多实体恶性肿瘤中具有临床相关性和治疗可行性的突变[51]。此外，作者的检测方法能够多重复用其他特定突变，如 TP53 变异，提升了该检测在更广泛情境中的实用性。检测 TP53 或其他单核苷酸变异（SNVs）可以通过捕捉更广泛的突变事件来提高检测的灵敏度，这些事件可能与疾病进展或治疗耐药性有关。
技术验证——带有特定检测的 ddPCR 设置。同时筛查 KRAS 基因在 KRAS 基因第 2 外显子 12/13 的基因组变异，并特异性检测 KRAS G12C。绿色：KRAS WT 阳性液滴，蓝色：MUT KRAS G12/G13 液滴，灰色：空液滴，红色：MUT KRAS G12C 阳性液滴，黄色：双阳性液滴（WT 和 KRAS G12C 突变体）。基于 ddPCR 实验的对照（仅 WT、仅 MUT、WT + MUT、NTC），通过 Crystal Miner 软件确定了荧光通道的各个阈值。绿色线：HEX 负与正液滴的阈值，蓝线：FAM 负与正的液滴阈值，红线：Cy5 阴阳液滴之间的阈值。Cy5，氰素-5;FAM，6-carboxyfluorescein;HEX，六氯荧光素;MUT，变种人;NTC，无模板控制;野生型，野生型
为评估检测敏感性（LoD），作者评估了已知分析物浓度较低的样品的重复样品，并按照 《材料与方法 》中所述的程序计算了检测敏感性。KRAS 脱落检测的最小计算 LoD 为 0.57 份/μL。分析了 20 个 KRAS WT 样本，LoB 为 0.13 拷贝/μL。超过该阈值时，样本被视为真阳性。总体来看，WT 拷贝数/μL 与假阳性率无相关性），KRAS 脱落分析的稀释线性性表现良好。一旦用重组 DNA 建立并优化了该下降法，技术上用作者已建立的 PDAC 患者队列中的 cfDNA 样本验证，这些样本中已知有突变 VAFs。
为此，单靶点检测针对 Naica™晶体数字 PCR 系统进行了优化。优化后，使用 KRAS 单靶点测定法评估通用单靶点与 KRAS 卸除测定之间的跨测准确性，这是技术验证的关键组成部分（见图 4）。为此，同时分析 ctDNA 阳性患者样本，并在图 4B 中绘制 VAFs，显示单靶点与 dropoff 测定之间显著相关性（r2 = 0.9096）。对 ID Solutions® 商业 KRAS 试剂盒的间测精度进行了比较，比较了单靶点测定和通用掉落法（见图 4）。在 12 个样本中（100%）测试中，KRAS 脱落检测正确识别了 KRAS 突变，这一点通过组织 NGS 突变分析和相应单靶点检测得到确认（见图 4）。总体而言，只需 1–5 ng 的输入 DNA，就足以可靠地检测 ddPCR 的变异，作者目标是每个 ddPCR 反应至少使用 10 ng 的总 DNA（相当于人类 DNA 的 3000 个基因组当量）。
技术验证——KRAS ddPCR 卸除检测的跨检测精度。胰腺癌患者的 cfDNA 样本采用了不同检测方法进行分析。（A）卸除测定（左列）与对应的单靶点测定（右列）与 ID Solutions® 的商业 KRAS 套件（中列）的比较。商业试剂盒显示 HEX 通道中存在明显的亚克隆群体，作为双正（WT + MUT）液滴云区域（绿色）内的第二个群体可见，这很可能是由于第 6 号染色体同源区域的非靶向扩增所致。样本 283 的分析显示，通过滴落法更准确地估算 VAF 和 KRAS 野生型等位基因频率。绿色：KRAS WT 阳性液滴，蓝色：MUT KRAS 液滴，橙色：双正性（WT + MUT）液滴，灰色：空液滴。绿色线：HEX 负与正液滴之间的阈值，蓝色线：FAM 负与正的液滴之间的阈值。（b）变异等位基因频率（VAFs）相互绘制。cfDNA，游离细胞 DNA;FAM，6-carboxyfluorescein;HEX，六氯荧光素;MUT，变种人;野生型，野生型
在使用 ID Solutions® 的 KRAS 套件进行 cfDNA 分析时，HEX 通道中观察到一个亚克隆，且该亚克隆与输入 DNA 量成比例增加（见图 4，中间部分）。这一现象很可能源于 KRAS 扩增体与人类 6 号染色体（GRCh38.p14）之间高序列同源性（124 个碱基对中的 118 个碱基对的 95%相同性）。当扩增子过短时，引物和探针可能部分结合于 6 号染色体，形成亚克隆，这些克隆在二维液滴图中表现为不同的亚群，尤其是在双阳性（HEX + FAM）液滴云区域。在 cfDNA 输入量较高的样本中，这一问题更为明显，可能导致等位基因频率估计不准确。在作者的研究中，将使用商业 KRAS 滴滤试剂盒获得的等位基因频率与单靶点检测法和自家设计的滴答测定相比，这一局限性尤为明显，后者的相关值分别较低（r² = 0.0903 和 r² = 0.1893;图 4B）。
为进一步临床验证KRAS 脱落检测法，作者从接受辅助或姑息性全身治疗的胃肠癌患者血浆样本中提取了 cfDNA。KRAS 滴落检测在 36 个检测为 ctDNA 阳性的患者样本中，正确识别出 KRAS SNV，诊断灵敏度达到 97.22%。通过常规 NGS 分析得知 KRAS 突变状态，并通过相应的单靶点检测确认了 ctDNA 阳性。此外，检测结果正确检测出所有九个 KRAS WT 样本， 诊断特异性达到 100%。这些结果表明该检测在区分 KRAS 突变与 KRAS WT 样本方面具有高度准确性，是临床诊断的可靠工具。值得注意的是，ctDNA 动力学反映了个体患者的疾病进程，如两例指标病例所示（图 5）。
临床验证——通过突变KRAS cfDNA 动力学预测临床反应。在缓和系统治疗期间，使用 KRAS ddPCR 卸除法分析了三位不同胰腺癌患者的 cfDNA 样本。样本 1 为开始全身治疗前采集的基线样本。（A）姑息治疗一线治疗期间肿瘤进展。（B）处理反应通过减少突变拷贝/μl 数表示。（C）cfDNA 中特异性 KRAS G12C 检测示例。绿色：KRAS WT 阳性液滴，蓝色：MUT KRAS 液滴，橙色：双正性（WT + MUT）液滴，灰色：空液滴。绿色线：HEX 负与正液滴之间的阈值，红线：Cy5 负与正的水滴之间的阈值。cfDNA，游离细胞 DNA;Cy5，氰素-5;FAM，6-carboxyfluorescein;HEX，六氯荧光素;MUT，变种人;野生型，野生型
总共分析了 45 个患者样本，采用了 drop-off 测定法和各自的单靶点检测法，以验证正负比例一致性。分析样本的 VAFs 范围为 0.0%至 33.81%，且全过程间测精度极佳（r² = 0.9835）。作者的检测结果总体一致度为 97.78%。
具有可检测 ctDNA 的患者样本相比无可测量 ctDNA 的患者样本，整体生存率（OS）有所下降（风险比（HR）= 3.1（P = 0.0602）），如图 6 左上角所示。观察到较长的 OS（HR = 4.4（P = 0.0039））较长，检测到的 ctDNA 量随时间可测量减少或稳定，相较于 ctDNA 负荷增加的患者样本，如图 6 所示。同样，图 6 显示了同一患者的手术室，取决于肿瘤标志物 CA19-9 的存在（HR = 0.032，P = 0.237）。 CA 19 − 9 动态稳定至递减的患者闭塞率较长，而肿瘤标志物增加的患者则持续时间较长（HR = 3.97，P = 0.0072 ）。这些发现凸显了监测多种生物标志物（如 ctDNA 和 CA19-9）的潜在价值，以获得更全面的治疗反应和预后理解。总之，作者开发并初步临床验证了一种针对癌症患者 cfDNA 分析量身打造的 KRAS 热点 ddPCR 检测法，具有广泛的临床和转化研究应用价值。
临床验证——接受全身治疗的胃肠癌患者的总体生存期（OS）分析。左上角：通过KRAS 突变 cfDNA 阳性（ctDNA 阳性）分层的胃肠癌患者胃肠癌患者 OS 的 Kaplan-Meier 估计。右上角：Kaplan-Meier 对胃肠癌患者 OS 的估计，按 KRAS 突变 cfDNA 在系统治疗期间变化分层：ctDNA 减少/稳定与增加。左下角：Kaplan-Meier 估计胃肠癌患者经系统治疗期间 CA 19−9 阳性率。右下角：Kaplan-Meier 估计胃肠癌患者胃肠癌患者 OS，按 CA 19 − 9 系统治疗期间的变化分层：CA 19 − 9 减少/稳定与增加。
总结
作者建立了并临床验证了一种新型通用适用的 KRAS 脱离 ddPCR 检测法，用于识别和定量血浆 CFFDNA 中的突变 KRAS，显示出特异性提升且保持高灵敏度。由此产生的检测系统可靠、经济且易于在任何研究和诊断机构中实施。
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