近年来，CRISPR基因编辑技术结合肿瘤-免疫细胞共培养模型，为癌症免疫治疗的靶点发现提供了全新视角。通过模拟肿瘤微环境中的细胞互作，科学家们能够系统性解析免疫逃逸机制，并筛选出关键调控基因。小源带你了解最新研究进展：
1.肿瘤–免疫共培养模型
在CRISPR筛选中，共培养系统通常包含以下要素：细胞类型选择，肿瘤细胞（如肺癌、黑色素瘤细胞系）与免疫细胞（如T细胞、NK细胞）共培养，模拟体内免疫攻击场景[1]。基因编辑策略，通过CRISPR敲除肿瘤细胞或免疫细胞中的候选基因库，结合高通量测序技术筛选影响免疫杀伤的关键基因。功能评估指标，包括T细胞活化标志物（如CD69、IFN-γ分泌）、肿瘤细胞杀伤效率及免疫检查点分子（如PD-L1、MHC-I）的动态变化。
图1 CRISPR筛选当前或潜在可以靶向的细胞类型
2. 免疫逃逸文库筛选案例全析
在肿瘤细胞系中应用CRISPR筛选技术，为全面且高效地研究大量基因提供了有力手段，进而得以在深入探究的信号网络中精准识别关键调控因子。这些信号网络涉及一系列至关重要的生物学过程，如抗原呈递、干扰素-γ（IFN-γ）信号传导、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）信号传导、自然杀伤（NK）细胞毒性敏感性以及巨噬细胞募集等。通过以下案例进行深度剖析：
案例1
靶细胞：小鼠结肠癌细胞（MC38）
效应细胞：PmelT细胞
文库名称：小鼠全基因组敲除文库
压力筛选条件：对于T细胞处理组，以效应细胞：靶细胞（E:T）比例为0.3:1和1:1加入培养的PmelT细胞处理16小时。对于非T细胞处理组，加入等量的T细胞生长培养基，检测对T细胞介导的细胞毒性的体外敏感性或抗性。
结果：研究揭示了两种不同的免疫抵抗调节器，并展示了它们作为治疗靶点提高免疫疗法疗效的潜力。在这些调节器中，PRMT1和RIPK1分别被确定为一种双重免疫抵抗调节器和一种细胞毒性抵抗调节器。尽管不同类型的免疫疗法之间的影响程度有所不同，但基因靶向PRMT1和RIPK1能使肿瘤对T细胞杀伤和抗PD-1/OX40治疗更为敏感[2]。
图2 CRISPR/ cas9的筛选肿瘤内在因子调节对T细胞介导杀伤的敏感性。
案例2
靶细胞：人黑色素瘤细胞（Mel624）
效应细胞：病人的NY-ESO-1细胞
文库名称：人全基因组敲除文库
压力筛选条件：NY-ESO-1T细胞（效应细胞与靶细胞[E:T]比例为1:3），对照组在相同的密度和条件下培养，但没有T细胞。共培养阶段维持了12小时之后移除T细胞，恢复48小时，NY-ESO-1T细胞裂解了约76%的肿瘤细胞，存活的细胞进行sgRNA的富集分析。第二次筛选，将E:T比例提高到1:2，T细胞杀死了约90%的库转导的Mel624细胞。
结果：研究者通过肿瘤细胞对NY-ESO-1+CD8+T细胞的体外敏感性进行CRISPR筛选来发现癌细胞中调节EFT的成熟基因和新基因。发现APLNR通过调节靶细胞中的JAK-STAT信号传导来调节T细胞抗肿瘤反应的新作用，APLNR的缺失抑制JAK-STAT通路，从而削弱IFN-γ应答和对基于T细胞的免疫疗法的敏感性；APLNR与JAK1相互作用增强IFNy应答，APLNR可以进一步提高肿瘤血管对IFNy的敏感性，从而提高T细胞的抗肿瘤功效[3]。
图3 2CT–CRISPR 检测系统选择压力和共培养时间的优化
案例3
靶细胞：胰腺细胞系HupT3和KP4_MSLN
效应细胞：MSLNCAR-T细胞
文库名称：人全基因组敲除文库
压力筛选条件：共培养条件取决于t细胞供体、肿瘤细胞类型和平板格式，T细胞与肿瘤细胞的E:T比分别为4,2,1，使用等量的T细胞和肿瘤细胞培养基，共培养允许进行24-72小时，用流式细胞术或荧光素酶法对存活的靶细胞进行定量。
结果：为探究肿瘤内在耐药模式，研究者使用表达间皮素（MSLN）的胰腺癌细胞进行CRISPR筛选，然后与靶向MSLN的CART细胞共培养，研究MSLN-CAR-T细胞的体外敏感性，发现抗原依赖性和抗原非依赖性的耐药模式。抑制参与GPI锚生物合成途径的基因增加胰腺肿瘤细胞对MSLNCAR-T细胞疗法的抗性。参与死亡受体途径的基因使胰腺导管腺癌对CAR-T细胞介导的细胞毒性敏感。TFAP4缺失促进p65（NF-kB转录因子）活性[4]。
图4 胰腺导管腺癌中的全基因组 CRISPR-Cas9 筛选研究
案例4
靶细胞：人慢性粒细胞白血病细胞系K562
效应细胞：健康人外周血提取的NK细胞
文库名称：人全基因组敲除文库
压力筛选条件：将K562文库细胞与IL-2激活的NK细胞以E/T比例0.3:1共培养并监测K562细胞的存活率，过程中可添加NK细胞，直至K562细胞的存活率仅为10%，去除死细胞和NK细胞，回收存活的K562细胞。在筛选压力较低的实验组中，回收的K562细胞在完全培养基中培养48小时后再提取基因组DNA。在筛选压力较高的实验组中，再次通过两轮与NK细胞共培养进行筛选。对照K562细胞在相同的培养条件下培养，不接触NK细胞。其中实验组进行了两次技术重复。
结果：研究者使用K562细胞进行CRISPR筛选NK细胞杀伤作用敏感性的基因，在与NK细胞共孵育后存活下来的K562细胞中，编码天然细胞毒性受体NKp30配体的NCR3LG1的缺失保护K562细胞免受NK细胞的杀伤。相比之下，调节抗原呈递和干扰素-γ信号通路的基因的缺失增加了K562细胞的易感性，加入IFN-γ中和抗体增加了K562细胞对NK细胞杀伤作用的敏感性[5]。
图5 K562 细胞中的全基因组敏感性 CRISPR 筛选
3. 展望
CRISPR 筛选技术借助 CRISPR – Cas9 系统对基因表达进行编辑，从而实现对基因功能的系统性和可扩展性的探究。在癌症免疫治疗领域，该技术已助力
发现能够调控肿瘤发生发展、免疫反应性以及免疫干预有效性的基因、生物标志物和信号通路。未来，针对CRISPR编辑的CAR-T细胞联合免疫检查点抑制剂这些联合疗法有望突破现有治疗瓶颈！
参考文献：
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development of cancer immunotherapy strategies[J]. Molecular
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[2] Hou
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intrinsic immune regulators[J]. Journal for immunotherapy of cancer,
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[3] Patel
S J, Sanjana N E, Kishton R J, et al. Identification of essential genes
for cancer immunotherapy[J]. Nature, 2017, 548(7669): 537-542.
[4] Hagel
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resistance to chimeric antigen receptor T-cell therapy in pancreatic
cancer[J]. Cancer research, 2023, 83(4): 613-625.
[5] Zhuang
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resistance to NK cells induced by NK-derived IFN-γ[J]. Frontiers in
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