文献名称：A Distinguished Roadmap of Fibroblast Senescence in Predicting Immunotherapy Response and Prognosis Across Human Cancers
文献来源:Advanced Science
摘要
肿瘤对免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICI）的耐药性可能与细胞衰老存在复杂关联。本研究通过全面的泛癌单细胞测序分析发现，在肿瘤相关细胞群体中，成纤维细胞的细胞衰老水平最为显著。为阐明这一现象，构建成纤维细胞衰老相关转录组特征（fibroblast senescence-associated transcriptomic signature, FSS），该特征与促肿瘤发生信号通路及导致肿瘤进展的免疫失调存在强相关性。借助 FSS，机器学习框架在预测 ICI 治疗反应和生存结局方面展现出极高准确性，在验证集、测试集和院内队列中均获得了优异的曲线下面积（area under curve, AUC）值。值得注意的是，在不同癌症亚型中，FSS 的预测稳健性始终优于已有的特征指标。通过对 17 个 CRISPR/Cas9 文库的整合分析，CDC6 被鉴定为泛癌 ICI 治疗反应和预后分层的关键生物标志物。机制层面的实验证据表明，肿瘤细胞中的 CDC6 可通过分泌转化生长因子 -β1（TGF-β1）和诱导氧化应激来调控成纤维细胞衰老，进而重编程肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）并影响 ICI 治疗反应。这些发现凸显了以成纤维细胞衰老为靶点的转化潜力，为开发新型治疗策略以减轻免疫耐药、增强抗肿瘤疗效提供了新思路。
引言
细胞衰老是指二倍体细胞发生细胞周期稳定停滞并丧失增殖能力的一种状态。该过程作为一种保护机制，可抵御基因组不稳定性，减少DNA损伤的积累。致癌应激——如癌基因异常激活或抑癌基因缺失——亦可诱导肿瘤细胞进入衰老状态。早期研究将衰老视为抑制肿瘤发展的屏障，体现了其潜在的抗癌作用。然而，越来越多的证据表明衰老细胞也可表现出促肿瘤效应，例如促进癌细胞增殖、诱导血管生成及抑制抗肿瘤免疫。鉴于衰老已被确认为癌症的标志之一，识别衰老细胞成为预防肿瘤进展和推进癌症个体化治疗的关键策略。
癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）是肿瘤微环境中的重要基质成分，在细胞来源、表型及功能上具有高度异质性。大量研究证实，CAFs通过多种分子机制参与肿瘤发生和发展的多个阶段。在肿瘤微环境中，CAFs通过分泌细胞因子、趋化因子、生长因子和外泌体，与肿瘤细胞及其他基质成分进行双向信号交流，不仅促进肿瘤增殖，还参与调控免疫逃逸。此外，CAFs还能通过分泌基质金属蛋白酶（MMPs）和合成新的细胞外基质（ECM）成分，重塑肿瘤基质，为肿瘤侵袭和血管生成提供支持。多项研究表明，在多种癌症类型中，衰老的成纤维细胞具有促进肿瘤发生和发展的能力。因此，深入探讨CAFs在癌症发生及免疫治疗中的具体作用和分子机制，具有重要的科学和临床意义。
在精准肿瘤学中，准确预测患者生存结局和治疗反应是制定个体化治疗策略的基础。基于CAFs在肿瘤发生中的核心作用，本研究提出假说：衰老CAFs对实体瘤进展具有重要推动作用，并可影响免疫治疗疗效。因此，靶向成纤维细胞衰老过程可能为预测患者生存和免疫治疗反应提供新思路。
本研究首先基于40个泛癌单细胞转录组数据集（涵盖17种癌症类型、406例患者和881,332个细胞），系统表征了CAFs的衰老状态，并据此构建了成纤维细胞衰老相关转录组特征（FSS）。为评估FSS在预测免疫检查点抑制剂（ICI）治疗反应方面的价值，研究团队在14个泛癌批量RNA-seq数据集（共1052例接受ICI治疗的患者）中应用了10种机器学习算法进行验证。进一步，利用SurvBenchmark框架中的15种生存分析专用机器学习方法，结合TCGA中30种癌症的转录组数据，评估了FSS在生存预测中的效能。最后，通过分析17个CRISPR/Cas9功能筛选队列，筛选出FSS中最具潜力的靶基因CDC6，并在胰腺癌模型中进行了实验验证。
结果
肿瘤微环境中细胞的衰老图谱
本研究提出，CAFs衰老相关的转录组变化可作为预测癌症患者生存结局及ICI治疗反应的可靠生物标志物。为了验证，研究团队对40个泛癌scRNA-seq数据集（共计881,332个细胞）进行分析。以CellAge数据库（https://genomics./cells）中的基因为衰老评估指标，通过基因集变异分析（GSVA）发现，在40种癌症类型中，CAFs的GSVA评分均高于肿瘤微环境中的恶性细胞及其他细胞类型（如B细胞、NK/T细胞和内皮细胞）。针对乳腺癌（GSE148673）、胆管癌（GSE125449）和结直肠癌（GSE146771）的亚组分析进一步显示，CAFs衰老评分显著高于其他细胞。
基于泛癌 scRNA-seq 分析构建 FSS与免疫抑制性
衰老细胞具有独特的表型特征，能够通过分泌生物活性分子调控周围细胞状态。为探究衰老CAFs与其他细胞间的通讯关系，研究团队依据衰老评分中位数将CAFs划分为高衰老组（HS-CAF）和低衰老组（LS-CAF）。细胞通讯分析显示，与LS-CAF相比，HS-CAF与肿瘤微环境中其他细胞（尤其是免疫细胞亚群）的相互作用显著增强。以上结果表明，CAFs的衰老不仅增强了其与免疫细胞的互作强度，还在塑造抑制性肿瘤微环境中发挥核心作用。
鉴于衰老CAFs与抑制性肿瘤微环境的显著关联，研究团队提出，反映CAFs衰老水平的转录组特征（FSS）或可用于预测ICI治疗效果。基于40个scRNA-seq数据集，研究构建了FSS特征。首先，通过Spearman相关性分析筛选与衰老评分呈正相关（R > 0，FDR < 0.05）的基因（定义为FSₓ），并识别在成纤维细胞中差异上调的基因（定义为FSᵧ）。取每个数据集中FSₓ与FSᵧ的交集，得到该数据集特异的衰老相关成纤维细胞上调基因FSₙ。随后，计算每个基因在全部40个数据集中Spearman R值的几何均值，并将几何均值大于0.25的109个基因汇总为最终FSS特征。同时为解析FSS的生物学功能，研究进行了GO和KEGG富集分析。结果显示，FSS显著富集于细胞周期、基因重塑、癌症相关通路及ICI相关通路等，与既往研究中衰老成纤维细胞黏附特性增强的结论相一致。
进一步利用MCPcounter R包评估免疫细胞丰度，发现FSS评分高的肿瘤中，CD8⁺T细胞、NK细胞和巨噬细胞等抗肿瘤免疫细胞的浸润水平显著降低。为探究高FSS评分是否与免疫抑制通路相关，研究分析了FSS与HALLMARK基因集的相关性，结果显示TGF-β信号、凋亡、Notch信号和缺氧等通路在高FSS患者中显著上调。
研究还对比了FSS与肿瘤突变负荷（TMB）的关系。根据FSS和TMB的中位数将TCGA泛癌患者分为8个亚组：高/低FSS（HF/LF）、高/低TMB（HT/LT），以及它们的组合（HFHT、HFLT、LFHT、LFLT）。已知高FSS预示ICI疗效不佳，而高TMB预示较好疗效。分析发现，HF和LT亚组中细胞毒性淋巴细胞浸润减少；LFHT亚组浸润水平最高，HFLT亚组最低。因此，高FSS联合低TMB（HFLT）可能导致肿瘤微环境中细胞毒性淋巴细胞严重缺失，而低FSS联合高TMB（LFHT）则富集大量细胞毒性淋巴细胞。HFHT和LFLT亚组因同时存在免疫抑制和免疫正常因素，其特征更为复杂。综上，肿瘤免疫状态从强至弱依次为：LFHT > LFLT > HFHT > HFLT。这表明低FSS评分患者通常表现出更强的抗肿瘤免疫能力。
基于 FSS 预测 ICI 治疗反应
为评估FSS预测免疫检查点抑制剂（ICI）治疗反应的潜力，根据14个已公开发表的ICI治疗队列，涵盖抗PD-(L)1、抗CTLA-4单药或联合治疗方案，并整合了完整的转录组数据与临床疗效信息。首先，将其中6个数据集（包括肾癌Braun队列n=181、尿路上皮癌Mariathasan队列n=348、皮肤黑色素瘤Liu队列n=121、Gide队列n=73、Riaz队列n=49及PUCH队列n=49）合并，共纳入821例患者。采用sva R包校正批次效应后，按8:2比例随机划分为训练集（n=657）和验证集（n=164）。
利用caret R包，研究团队运用10种机器学习算法进行建模，并通过5次重复的10折交叉验证（CV）优化模型参数。为提升模型稳健性，使用不同随机种子对模型进行5次训练。最终，梯度提升机（GBM）模型在验证集中表现出最高的预测效能（AUC = 0.86），被确定为最优模型。进一步在独立测试集（n=190）和院内队列（n=41）中验证，GBM模型仍保持较高且稳定的预测能力，AUC分别达到0.79和0.77。
根据模型预测评分将患者划分为高风险组（预测无反应，NR）和低风险组（预测有反应，R），并进行生存分析。Kaplan-Meier曲线显示，在验证集、测试集及院内队列中，低风险组患者的总生存期（OS）均显著优于高风险组。
为进一步综合评价FSS的预测价值，研究将其与多个已发表的泛癌预测特征（包括IFNG_sig、Tcell_sig、Cytotoxic_sig、PDL1_sig、CAF_sig和NLRP3_sig）进行比较。结果显示，尽管部分特征在个别队列中表现良好，但FSS在皮肤黑色素瘤（SKCM）、胶质母细胞瘤（GBM）、尿路上皮癌（UC）、胃癌（GC）及非小细胞肺癌（NSCLC）等多个癌种的ICI队列中均表现出更优且稳定的预测性能。例如，Cytotoxic_sig在胃癌Kim队列中AUC为0.77，但在其他队列中波动较大（0.29–0.66）；而FSS在所有测试队列中均保持一致的高预测力。
基于 FSS 的生存预后预测
为提升FSS在泛癌层面的生存预测性能，研究基于SurvBenchmark框架，采用15种专用于生存分析的机器学习算法，构建了FSS相关的预后模型。将TCGA泛癌患者按8:2比例划分为训练集（n=7865）与验证集（n=1950），利用训练集建立模型并在验证集中评估其性能，包括AUC、时间依赖性AUC及C指数。结果显示，多任务逻辑回归差异表达模型（MTLR_DE）表现最优。该模型通过排序法筛选特征，基于中位生存期比较不同预后患者的基因表达差异，最终选定10个关键基因（CDC6、PITX1、TGFBI、CHEK1、CEBPB、IFI16、CD82、PGR、PEBP1和RBL2）用于建模。
采用MTLR R包计算每位患者的个体风险评分，模型在验证集、测试集及院内队列中均显示出良好的判别能力，A值持续较高。高风险组患者在各队列中的总生存期（OS）均显著缩短，与TCGA多数癌种中的数据趋势一致。
为进一步提高预测准确性，将FSS风险评分与美国癌症联合委员会（AJCC）分期整合，构建了临床列线图。校准曲线显示，诊断后5年内预测生存概率与实际观察值高度一致，表明该列线图具有可靠的预测性能。综上所述，基于FSS的预后模型在泛癌环境中表现出稳健且优异的生存预测能力。
通过 CRISPR/Cas9 筛选确定 FSS 中的潜在靶点
为促进FSS的临床转化，研究团队进一步筛选与ICI治疗反应相关的潜在靶点。基于7项CRISPR/Cas9研究中的17个数据集，对22505个基因按敲除后的免疫效应进行z值排序，将排名靠前的基因归类为免疫耐药基因。这些基因在敲除后可能增强抗肿瘤免疫，而排名靠后的基因则可能起抑制作用。
研究比较了FSS与已知免疫耐药特征（TcellExc_sig、ImmuneCells_sig、IMS_sig、CAF_sig和CRMA_sig）中这类基因的富集程度。结果显示，FSS中排名前10%的基因比例显著高于其他特征，其中15个基因在多个CRISPR/Cas9数据集中显著富集（Fisher精确检验，p < 0.01），提示其为潜在的免疫治疗靶点。
为筛选同时具备预后预测价值的靶点，研究将上述15个基因与FSS预后模型中的10个关键基因取交集，最终鉴定出CDC6为核心候选基因。在22个泛癌队列中，86%（19/22）的队列显示肿瘤组织中CDC6 mRNA表达显著高于正常组织，且其高表达与患者总生存期缩短显著相关。人类蛋白质图谱（HPA）的免疫组化结果进一步证实，CDC6蛋白在肾、肝、胰腺及皮肤来源的肿瘤组织中表达上调。
胰腺癌（PC）细胞中 CDC6 下调可增强免疫治疗反应
为探究CDC6在抗肿瘤免疫中的作用机制，构建由CD8⁺T细胞、CD14⁺单核细胞来源巨噬细胞与胰腺癌类器官组成的共培养体系。在类器官中敲低CDC6后，其mRNA和蛋白表达均显著下降，同时经典衰老标志物p16的表达也降低，提示CDC6沉默可能缓解肿瘤微环境中的成纤维细胞衰老。形态学与细胞增殖（CTG）检测结果显示，sh-CDC6类器官的生长能力明显受损。免疫组化分析进一步表明，sh-CDC6组中PD-L1与Ki-67的表达均显著低于对照组。
在共培养体系中，qRT-PCR分析显示，与sh-CDC6类器官共育的免疫细胞中免疫检查点相关基因表达上调，同时M2型巨噬细胞标志物表达下降、M1型标志物表达升高，表明巨噬细胞向抗肿瘤表型极化。流式细胞术结果验证了这一现象：sh-CDC6组中CD8⁺T细胞的活化和增殖水平增强，M1型巨噬细胞比例也显著高于sh-NC组。
为在体内验证CDC6的功能，研究利用KPC细胞构建C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型，并施以抗IgG或抗PD1抗体治疗。结果显示，CDC6缺陷肿瘤对抗PD1治疗的敏感性显著提高，肿瘤体积明显缩小。肿瘤组织免疫组化显示，CDC6缺陷瘤体中免疫细胞浸润增加，增殖指数降低。以上结果表明，CDC6在调控肿瘤免疫微环境中发挥关键作用，抑制CDC6可增强胰腺癌对免疫治疗的应答。
肿瘤细胞来源的 CDC6 通过 TGF-β1 分泌和氧化应激驱动成纤维细胞衰老
为阐明CDC6在成纤维细胞衰老中的作用，研究建立了肿瘤细胞-成纤维细胞共培养体系。结果显示，在胰腺癌（PC）细胞中过表达CDC6可显著诱导共培养成纤维细胞发生衰老，具体表现为：SA-β-Gal活性升高、p16⁺细胞比例增加以及衰老相关分泌表型（SASP）因子表达上调。
基于前期发现——TGF-β信号通路在FSS相关通路中排名第一，且为MTLR_DE模型中的关键通路，研究进一步探讨了TGF-β1在CDC6介导衰老过程中的作用。ELISA及细胞内检测表明，CDC6过表达导致肿瘤细胞内和培养基中TGF-β1水平显著上升，并激活共养成纤维细胞中的TGF-β–SMAD2/3信号通路，进而促进纤维化与衰老。使用TGF-β通路抑制剂LY2109761可完全阻断CDC6诱导的成纤维细胞衰老，表明该过程依赖于TGF-β1信号传导。
鉴于CDC6已知参与应激诱导的衰老，研究评估了氧化应激在其中的作用。在共培养体系中加入抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）后，CDC6过表达所引起的SASP因子表达上升和SA-β-Gal⁺细胞比例增加均被显著抑制。最后，在胰腺癌原位小鼠模型中证实，CDC6高表达与更严重的成纤维细胞衰老及较差的ICI治疗反应相关。这些结果提示，CDC6通过调控TGF-β1表达及氧化应激水平，诱导成纤维细胞衰老，进而影响免疫治疗应答。
由于目前尚无商业化的CDC6抑制剂，研究采用基于结构的高通量虚拟筛选（HTVS）方法，对23100种化合物进行了初步筛选。通过标准精度（SP）和超高精度（XP）两级分子对接分析，筛选出结合潜力较高的候选化合物。其中，β-D-N(4)-羟基胞苷（NHC）-二磷酸（三铵盐）表现出对CDC6蛋白表达最显著的抑制能力。
该化合物通过9个氢键和5个盐桥与CDC6蛋白发生特异性相互作用。其磷酸氧原子作为氢键受体，与GLY205（1.9 Å）、GLY207（2.2 Å）、LYS208（2.5 Å）、THR209（2.1 Å）、ALA210（1.7 Å）及ARG388（1.5 Å）形成6个氢键；两个羟基作为氢键供体，分别与THR166（1.9 Å）和TYR346（1.7 Å）结合；一个氨基氢原子作为供体，与PRO173形成键长为2.1 Å的氢键。此外，化合物与LYS208形成2个盐桥，与ARG388形成3个盐桥，进一步增强了结合稳定性
结论
综上，本研究为肿瘤衰老的潜在分子机制提供了新见解，强调了成纤维细胞衰老相关转录组特征（FSS）在预测患者生存及免疫检查点抑制剂（ICI）治疗反应中的临床意义。在已鉴定的靶点中，CDC6 作为成纤维细胞衰老的关键调控因子，通过 TGF-β 信号通路和氧化应激驱动成纤维细胞衰老。这些发现凸显了以 CDC6 及其下游效应为靶点的潜力，为提高精准肿瘤学中的治疗效果提供了新方向。