微精选

共有18名参与者接受了在第0天和第28天进行的两剂狂犬病疫苗接种方案（图1A和S1）。其中9名参与者被随机分配在第3天开始接受为期5天的抗生素治疗（指定为Abx组，颜色：红色），其余参与者作为对照组（指定为No-Abx组，颜色：蓝色）。研究设计和参与者人口统计学的详细信息在研究参与者部分和补充材料（表S1）中提供。

为了实现宿主微生物群的广泛耗竭，我们使用了包括万古霉素、甲硝唑和新霉素在内的广谱抗生素方案。首先，我们测定了血浆中的抗生素代谢产物。由于万古霉素和新霉素的系统吸收性差，因此在血浆中无法检测到。一名参与者未检测到甲硝唑，因此被排除在后续组分析之外，以提高研究质量和对研究组依从性的清晰度（图S2）。然后，我们评估了抗生素使用对肠道微生物群的影响。在接种疫苗当天，我们观察到接受抗生素的参与者的每克粪便中的细菌细胞数量减少了100倍以上（图1B和S2）。在第1天，即抗生素治疗的最后一天，接受抗生素的组的总细菌含量降至最低点。随后几天内，总细菌含量逐渐恢复到基线水平，到第7天至第30天之间达到基线水平（图1B）。正如预期的那样，对照组的细菌负荷没有显著变化。

肠道细菌的耗竭也导致共生细菌组成的相对丰度发生了显著变化（图1C）。肠杆菌科和链球菌科等低丰度分类群在接种疫苗当天（第0天）、第1天和第3天的抗生素治疗参与者的肠道微生物群中占主导地位，这与我们之前的发现一致。到第7天，8名参与者中有7名的肠杆菌科丰度仍然很高，在随后的180天内，最常见细菌成分的丰度逐渐恢复到抗生素治疗前的水平（图1C）。

优势物种和稀有物种都对共生菌多样性有贡献。为了评估多样性的变化，我们计算了群落丰富度（观察到的物种或操作分类单元）和香农指数用于α多样性分析，以及用于β多样性的布雷-柯蒂斯（Bray-Curtis）不相似性指数。对稀有物种变化敏感的观察到的物种和香农指数在抗生素治疗的最后一天（第1天）降至最低，并显著低于对照组参与者（图1D）。这些变化持续了长达90天(p < 0.05)，甚至在180天时仍可观察到（尽管无统计学意义），表明细菌物种，特别是稀有物种，在抗生素治疗后很长时间内仍从肠道中缺失（图1D）。我们进一步使用主坐标分析（PCoA）可视化个体微生物群落之间的布雷-柯蒂斯不相似性。Abx组和No-Abx组的微生物群落在第0天（接种疫苗当天，也是抗生素治疗的第4天）开始出现差异，在第1天达到峰值，并在随后的6个月内逐渐（尽管不完全）趋于一致（图1E），这与α多样性指标和我们之前的研究一致。

接下来，我们探索了肠道微生物群的显著且持久的变化如何影响对狂犬病疫苗的抗体反应。我们之前的研究表明，抗生素诱导的肠道微生物群耗竭对流感疫苗抗体反应的影响在很大程度上取决于预先存在的免疫力。本研究中的参与者此前未接触过狂犬病疫苗或感染，这使我们能够评估抗生素对疫苗初次免疫反应的影响。

在基线时，所有参与者对狂犬病均为免疫空白，但在初次接种疫苗后产生了狂犬病特异性免疫球蛋白G（IgG）抗体，这些抗体水平在二次免疫后进一步增加（图2A）。值得注意的是，抗生素治疗显著削弱了初次狂犬病特异性IgG反应(p < 0.01)，与对照组相比，在第28天时大约减少了5.9倍。这种降低的抗体反应在第二次免疫后仍然持续，并且在长达180天内仍然明显（图2A）。我们通过快速荧光灶抑制试验（RFFIT）测定了狂犬病病毒中和抗体（表S2）。值得注意的是，狂犬病特异性总IgG滴度与中和抗体强相关（图2B）。我们根据世界卫生组织指南的0.5国际单位每毫升（IU/mL）定义保护性血清转换，发现在第28天和第180天，Abx组中有更多参与者表现出非保护性的中和抗体水平（图2C），这表明受损的总IgG反应转化为降低的中和抗体水平。接下来，我们在每次免疫后测定新分离的外周血单个核细胞（PBMCs）中狂犬病特异性浆细胞的频率。在对照组中，第一次接种剂量在第7天未引起可检测的浆细胞反应（图2D），这与研究表明灭活狂犬病疫苗的免疫原性较弱以及在初次免疫反应中初次接种后第7天通常浆细胞反应较低一致。然而，第二次剂量导致浆细胞反应显著增加。令人惊讶的是，接受抗生素的参与者的这种浆细胞反应受到严重抑制（图2D）。我们还检查了狂犬病特异性记忆B细胞反应（图S3A）。在第90天，Abx组和No-Abx组之间狂犬病特异性记忆B细胞的频率没有显著差异（图S3B）。

高通量免疫球蛋白基因（Ig）测序能够对Ig库进行分析，捕捉克隆进化（如体细胞超突变（SHM）和类别转换重组）的标志，这些标志反映了对感染或疫苗接种的体液反应中的成熟B细胞和幼稚B细胞表型。我们通过批量Ig测序评估了狂犬病疫苗接种前后的Ig库动态变化。正如预期的那样，发生类别转换的Ig亚型（IGHG1、IGHG2、IGHG3、IGHA1和IGHA2）比未发生类别转换的Ig亚型（IGHM和IGHD）具有更高的SHM，这分别反映了成熟和幼稚B细胞表型（图2E）。由于其在Ig库中比例较低，我们检测到的IGHE和IGHG4基因数量较少。与抗生素组相比，对照组中低突变的类别转换IGHG克隆的出现频率更高（图2E）。值得注意的是，在抗生素治疗个体的免疫球蛋白重链可变区（IGHV）基因中，IgG B细胞受体亚型（IGHG1、IGHG2和IGHG3）含有低或无SHM（<1%）的比例在第28天和第35天显著低于对照个体，这表明较少的幼稚B细胞克隆被刺激并转换为这些亚型（图2F）。有趣的是，抗生素组中似乎有更多的（尽管统计学上不显著）高突变IGHM和IGHD克隆（图2E和S3C）。我们进一步通过ELISA检测了狂犬病IgM抗体，发现接受抗生素治疗的参与者在第28天、第35天和第56天产生了统计学上不显著的更高水平的IgM（图S3D）。两组中IGHA区间的Ig库变化较小，低突变IGHA克隆的出现频率相似（图2E和S3E）。

接下来，我们确定肠道微生物群的变化与体液免疫反应之间是否存在关联。抗生素治疗最后一天的细菌负荷与第28天的狂犬病特异性IgG滴度之间存在显著相关性（图S3F）。有趣的是，尽管统计学上不显著，但在第1天观察到的微生物群丰富度与随后体液反应的许多方面相关，例如第7天和第35天低SHM IGHG1克隆的比例、第35天低SHM IGHG2克隆的比例、第35天低SHM IGHG3克隆的比例，最重要的是第56天和第180天的IgG滴度（图S3F）。总之，这些数据表明，细菌负荷和多样性降低的失调微生物群是狂犬病疫苗抗体和B细胞反应不佳的关键驱动因素。

为了确定抗生素对转录反应的幅度和动力学的影响，我们对疫苗接种前后的血液样本进行了批量RNA测序（RNA-seq）分析（图3A）。我们首先确定了每组在指定天数与参与者自身在抗生素治疗和疫苗接种前的基线时间点相比的差异表达基因（DEGs）。在第1天、第14天和第29天（第二次接种后1天）出现了三个转录反应峰值。这些反应分别对应于初次接种后的先天反应和T细胞反应以及第二次接种后的先天反应（图3B）。有和没有抗生素给药的参与者之间的DEGs的幅度和动力学相似（图3B）。

图3 | 成人接受或未接受抗生素治疗对狂犬病疫苗的血液转录反应

为了探索抗生素给药是否在对狂犬病疫苗接种的反应中诱导了独特的转录特征，我们通过计算相对于初次接种后第0天和二次接种后第28天的标准化富集分数（NESs），使用之前描述的计算方法识别了差异表达的血液转录模块（BTMs）。与干扰素（IFN）/抗病毒感应相关的模块（图3C）在两组中初次和二次接种后第1天均显著诱导，但这些反应迅速减弱。值得注意的是，与抗原呈递、炎症TLR趋化因子、单核细胞和树突状细胞（DC）激活相关的模块在初次接种后被激活。有趣的是，在Abx组中，与炎症TLR趋化因子和单核细胞相关的模块（图3C）在第3天仍然上调。到第7天，所有参与者中出现了与细胞周期相关的特征，表明适应性免疫反应的开始（图3C）。在初次接种后第7天和第14天，与T细胞增殖和激活相关的BTMs在Abx组与对照组之间差异诱导（图3C）。有趣的是，先天免疫特征在疫苗接种后2周仍然显著，并且一些T细胞激活模块在抗生素治疗的个体中选择性地在第14天被激活（图3C）。巧合的是，与“先天”模块相关的第二轮激活，例如IFN/抗病毒感应BTM亚组中与CXCL-10基因相关的M75，在第14天重新出现，并且在抗生素治疗的参与者中优先富集（图3C）。

T细胞反应，特别是T辅助细胞1（Th1）反应，对狂犬病病毒的保护性免疫至关重要。我们通过采用蛋白质组学和体外功能测定来研究这一问题（图4A）。我们使用Olink靶向96炎症小组对所有参与者的158份纵向血浆样本进行了检测（图S4A）。血浆中C-X-C基序趋化因子配体10（CXCL-10）和IFN-γ的循环水平在初次和二次狂犬病疫苗接种后第1天和第29天分别显著增加（图4B）。值得注意的是，IFN-γ的上调在第29天显著增强，这与我们最近对其他病毒疫苗的研究结果一致。进一步分析表明，与第10天相比，抗生素治疗参与者的IFN-γ和CXCL-9（调节Th1极化和激活的关键趋化因子和细胞因子）在第14天的倍数变化显著高于对照组（图4C和S4B），而CXCL-10则没有显著差异（图S4C）。这一观察结果与转录反应的动力学一致，强烈表明抗生素治疗组对狂犬病疫苗的反应倾向于Th1偏向反应。

Th1细胞促进对局部炎症或感染的细胞介导反应，而Tfh细胞是体液免疫反应的关键调节因子。Tfh细胞和Th1细胞有一个共同的前体阶段。然而，Tfh细胞和Th1细胞的分化路径存在重叠，CD4+ T细胞会选择其中一种命运，而牺牲另一种。我们假设，抗生素治疗参与者的Th1细胞反应上调是通过降低Tfh细胞的频率来平衡的。为了验证这一点，我们对PBMCs进行体外刺激，并结合细胞因子细胞内染色（ICS）分析和激活诱导标记（AIM）分析来测量Tfh细胞和Th1细胞的反应。通过测量CD40L+ CD4+ T细胞分泌的白细胞介素-2（IL-2）、IFN-γ、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-4和IL-21，以及OX40+ CD137+ CD4+ T细胞、OX40+ CD40L+ CD4+ T细胞和CXCR5+ OX40+ CD40L+ CD4+ T细胞的频率，来评估狂犬病特异性CD4+ T细胞反应。值得注意的是，在初次接种后第14天，抗生素治疗参与者的狂犬病特异性IFN-γ分泌CD4+ T细胞的频率显著更高。然而，IL-2、TNF-α、IL-4和IL-21分泌CD4+ T细胞的频率和动力学与对照组参与者相当。值得注意的是，对照组参与者的狂犬病特异性T滤泡细胞（cTfh）的频率略高，而抗生素治疗参与者的狂犬病特异性IFN-γ分泌CD4+ T细胞与狂犬病特异性cTfh细胞的比值更高。事实上，我们观察到第28天的IgG滴度与第14天的Th1/cTfh比值之间存在强相关性(p = 0.0054, r = -0.6598)。这支持了我们的假设，即抗生素治疗组对狂犬病疫苗的T细胞反应倾向于Th1表型。这些发现表明，抗生素治疗后早期先天激活和炎症的调节导致平衡倾向于Th1细胞生成，减少Tfh反应，从而导致对初次疫苗接种的抗体反应减弱。

代谢是调节免疫细胞功能的中心过程，疫苗接种已被证明可以调节循环代谢物的水平。我们在第-10天、第0天、第1天、第3天、第7天、第14天、第28天、第29天、第35天和第56天收集的176份血浆样本中对代谢组进行了分析（图5A）。在该队列的所有血浆样本中，我们共鉴定出1186种代谢物，这些代谢物被分类为与氨基酸代谢（17.37%）、碳水化合物（1.94%）、辅因子和维生素（3.04%）、能量（1.01%）、脂质（34.82%）、核苷酸（2.70%）、肽（2.45%）、外源性物质（16.19%）以及其他部分鉴定的（1.77%）和未知分子（18.72%）相关类别（图5A）。在抗生素治疗组的血浆样本中检测到甲硝唑，其在第0天和第1天达到峰值，并在第7天被清除（图5B）。参与者之间甲硝唑的浓度和动力学存在差异，反映了人类代谢的异质性，并部分解释了抗生素诱导的肠道微生物群耗竭的差异（图5B）。正如预期的那样，由于万古霉素和新霉素的系统吸收性低，因此在血液中无法检测到。

狂犬病疫苗接种本身对血浆中代谢物的量并没有产生强烈的影响，这从随时间变化的差异丰度的微小变化中可以看出（图5C）。有趣的是，抗生素治疗加上初次接种对代谢物差异丰度的量和动力学产生了深远的影响（图5C）。我们对两组从第-10天到第14天的差异丰度代谢物峰的倍数变化值(p < 0.01)进行了轨迹主成分分析（PCA），发现抗生素治疗的参与者相对于对照组表现出显著改变的代谢轨迹（图5D）。

为了进一步了解亚通路和超级通路水平上的代谢组变化，我们基于Metabolon的特征注释表进行了富集分析。我们识别了与氨基酸、辅因子和维生素、脂质、能量、碳水化合物、核苷酸、肽、外源性物质以及其他尚未完全鉴定的特征相关的代谢通路（图S6A）。抗生素治疗对氨基酸和脂质超级通路的影响最为显著。与脂肪酸代谢相关的酰基肉碱化合物增加，而酰基胆碱化合物在抗生素治疗后的前两周内减少（图5E）。例如，3-甲基戊二酰肉碱（3MG）是一种酰基肉碱化合物，已被报道为线粒体功能障碍的生物标志物，其在抗生素治疗组中的血浆浓度更高（图S6B）。我们还观察到，与色氨酸代谢和次级胆汁酸代谢相关的代谢通路在抗生素治疗后减少（图5E）。

通过液相色谱-质谱联用（LC-MS），我们确认了次级胆汁酸，特别是胆酸（DCA）、甘胆酸（GDCA）、石胆酸（LCA）和甘石胆酸（GLCA），在接种后第一周减少（图5F），而初级胆汁酸未受影响（图5G）。次级胆汁酸水平的降低通过TGR5（Takeda G蛋白偶联受体5）-cAMP（环磷酸腺苷）-PKA（蛋白激酶A）轴增加炎症水平，和/或通过调节Th17细胞与调节性T细胞（Treg）之间的平衡来实现。与之相符的是，我们在抗生素治疗个体的PBMCs中观察到Th17细胞的频率更高（图S5D）。总的来说，这些数据表明抗生素治疗扰乱了血液代谢组，特别是在氨基酸和脂质代谢方面。

为了进一步探索抗生素诱导的肠道微生物群变化与血液转录组和代谢组之间的关系，并研究这些变化如何影响对疫苗接种的免疫反应，我们构建了多尺度、多因素反应网络（MMRN）分析，如之前所述。为了识别抗生素诱导的变化之间的关系，我们可视化了每个群落中第0天与筛选时间点的变化之间的关联（图6A）。除了其他联系外，我们观察到包含激活蛋白1（AP-1）和核受体超家族4A（NR4A）信号转录模块的基因群落GN9与包含许多次级胆汁酸的代谢群落MT9之间存在关联，这与我们之前的观察结果一致。

为了研究抗生素治疗参与者在狂犬病疫苗接种后T细胞反应偏向和抗体产生受损的潜在分子机制，我们接下来通过将所有特征与第0天与筛选时间点的细菌负荷变化、第14天的Th1/cTfh比值以及第28天的抗狂犬病IgG滴度相关联，并进行富集测试以识别富含与细菌负荷和/或免疫指标高度相关的特征的群落，从而“查询”这一网络。有趣的是，包含许多炎症信号和树突状细胞激活模块的GN3（图6B）与Th1/cTfh比值的关联最强（图6A），这表明抗生素治疗诱导的炎症状态可能使疫苗诱导的T细胞启动过程倾向于Th1表型，导致在生发中心中T细胞（例如Tfh）提供帮助无效，进而导致抗体反应受损。然而，这并不排除其他免疫途径，通过这些途径，肠道微生物群可能独立于GN3和Th1偏向调节抗体反应。与GN3相连的群落包括包含许多脂质分子（特别是脂肪酸）的代谢物群落MT4和MT1（图6C），这些分子在炎症信号传导中发挥重要作用。

少数与Th1/cTfh比值呈正相关且与抗体反应呈负相关的特征显著富集的群落之一是GN10，该群落由参与能量代谢（包括电子传递链和核苷酸合成）以及细胞分裂过程的转录模块组成（图6B）。该群落还与几个代谢物群落（包括MT0）有很强的联系，MT0包含多种氨基酸及其衍生物（图6C），以及包含脂质的群落MT4，这两个群落都与抗生素驱动的总体细菌负荷变化显著相关。这些发现提出了这样一种可能性：T细胞极化偏向和随后的抗体反应受损也可能部分是由于免疫细胞（可能是在抗原呈递细胞内或T细胞本身）的代谢改变，这是由于关键微生物群调节的代谢物的可用性发生了变化。

在可能驱动观察到的表型的微生物方面，细菌群落BC8不仅与炎症/树突状细胞激活模块GN3有显著关联，还与第14天的Th1/cTfh比值和第28天的抗体反应都有关联。BC8主要由芽孢杆菌（图6D）组成，包括多种链球菌。已有研究表明，当与人树突状细胞共培养时，几种链球菌菌株可诱导强烈的IL-12反应，IL-12是Th1极化的关键介质。抗生素治疗后链球菌科的相对丰度增加（图1C），因此其存在可能导致先天细胞反应改变以及随后的T细胞启动。

总的来说，这些发现表明，微生物群在疫苗接种前的基础状态下系统地调节宿主转录组和代谢组，进而影响先天激活、炎症和T细胞反应，最终影响对疫苗的抗体反应。