微精选

● 在田间种植的水稻群体中，根系微生物群与分蘖数的变化相关

● 根系微生物群的多种成员在调控水稻分蘖方面起着因果作用

● 微小杆菌R2567产生一种二肽环（亮氨酸-脯氨酸），它会抑制水稻分蘖

● 二肽环（亮氨酸-脯氨酸）通过与水稻独脚金内酯受体OsD14结合来调控分蘖数 

水稻分蘖是一种受植物遗传和环境因素调控的重要农艺性状。然而，根系微生物群在调节水稻分蘖过程中的作用和机制尚未得到研究。在本研究中，我们检测了在田间条件下种植的182个已完成基因组测序的水稻品种的根系微生物群组成和分蘖数，发现根系微生物群组成与水稻分蘖数之间存在显著相关性。通过使用已培养的细菌分离株，我们证明了在实验室和田间条件下，根系微生物群的多种成员都能够调控水稻分蘖。通过遗传学、生物化学和结构分析表明，由抑制分蘖的微小杆菌R2567产生的环（亮氨酸-脯氨酸）能够与独脚金内酯（SL）受体OsD14结合，从而激活水稻独脚金内酯信号通路，进而调控水稻分蘖。本研究揭示了根系微生物群调控关键农艺性状的机制，为在可持续农业中利用根系微生物群优化作物生长提供了一种可行的策略。 

我们在两块田地（Ⅰ、Ⅱ）中种植了182个进行了基因组测序的水稻品种。这些品种在遗传上具有多样性，且取自美国农业部水稻种质资源种子库的微型核心种质库（表S1A）。对每个品种，我们检测了三到六个样本中的根系微生物群组成，同时记录了相应的水稻分蘖数（图1A；表S1B；具体方法见“STAR方法”）。通过对细菌16S rRNA基因进行扩增子测序，我们从2128个根系样本的78,653,817条高质量序列中获得了18,449个扩增子序列变异体（ASV）（表S1B）。

图1 | 田间种植水稻群体的根系微生物群与分蘖数的变异相关

我们发现，在这两块田地中，根系微生物群都与水稻的分蘖数相关。首先，对182个水稻品种的根系微生物群组成、基因组以及分蘖数进行联合分析后发现，在解释水稻分蘖数的变异方面，根系微生物群与植物基因型同样重要。对来自田地Ⅰ的数据进行线性回归模型分析显示，根系微生物群和水稻基因型分别解释了分蘖数变异的28.2%和26.9%。值得注意的是，根系微生物群与水稻基因型的相互作用解释了分蘖数总变异的21.5%，这占水稻基因型贡献的79.9%（21.5%/26.9%）（图1B、图S1A和图S1B；表S1C；具体方法见“STAR方法”）。这些结果表明，根系微生物群及其与植物基因型的相互作用对水稻分蘖数的变异有相当大的贡献。在田地Ⅱ中也观察到了类似的趋势（图S1C和图S1D；表S1C）。其次，我们发现根系微生物群的结构与分蘖数的变异相关。在田地Ⅰ中，分蘖数与根系微生物群的香农多样性（样本内多样性）显著相关（图1C，p = 5.3×10-10，r = 0.44；表S1D），并且与基于182个品种根系微生物群的Bray-Curtis相异度的主坐标分析（PCoA）第一轴上的β多样性也显著相关（图1D，p = 2.0×10-12，r = 0.49；表S1D）。在田地Ⅱ中也检测到了类似的趋势（图S1E，p = 4.6×10-6，r = 0.33；图S1F，p = 4.5×10-8，r = 0.39；表S1D）。此外，通过对每个品种根系细菌属的相对丰度与水稻分蘖数进行相关性分析，我们发现，在这两块田地中，有七个细菌属与分蘖数呈正相关，五个细菌属与分蘖数呈负相关（图1E和图1F，错误发现率[FDR]校正后的p < 0.05；表S1E）。与分蘖数呈正相关的细菌属有螺旋体属、几丁螺旋菌属、地杆菌属、铁氧化菌属、玫瑰色杆菌属、厌氧粘细菌属和 piscinibacter属，而与分蘖数呈负相关的细菌属有陶厄氏菌属、微小杆菌属、多形单胞菌属、伯克氏菌属和类芽孢杆菌属（图1G和图S1G；表S1E）。综上所述，我们的数据表明，在水稻群体水平上，根系微生物群的结构和特定的细菌属与分蘖数的变化密切相关。

为了研究根系微生物群与分蘖数之间的因果关系，我们查阅了我们的水稻细菌培养物库，并从与分蘖数相关的五个细菌属中获得了细菌分离物：其中两个属与分蘖数呈正相关（玫瑰色杆菌属和Piscinibacter属），三个属与分蘖数呈负相关（微小杆菌属、伯克氏菌属和多形单胞菌属）。对于每个属，我们随机选择了最多三个与优势扩增子序列变异体（ASV）最为相似的培养细菌分离物（如果可用的分离物少于三个，则选择一到两个细菌分离物；表S2A；具体方法见“STAR方法”），并用这些分离物接种野生型日本晴水稻。

这五个与分蘖相关的细菌属的分离物均能调控水稻的分蘖数。与它们在田间与分蘖数的负相关性一致，在实验室条件下，微小杆菌属的R2567、R1275和R1870，伯克氏菌属的R2488以及多形单胞菌属的R1405与未接种的模拟对照相比，能使水稻分蘖数显著减少13.6%至35.2%（图2A和图2B，错误发现率校正后的p < 0.05，Wilcoxon秩和检验；表S2B；具体方法见“STAR方法”）。相比之下，与模拟对照相比，Piscinibacter属的R1801以及玫瑰色杆菌属的R780和R2188能使水稻分蘖显著增加约11.2%（图2A和图2B，错误发现率校正后的p < 0.05，Wilcoxon秩和检验；表S2B）。我们还在田间条件下，用促进分蘖或抑制分蘖的细菌接种水稻植株。值得注意的是，玫瑰色杆菌属的R780和Piscinibacter属的R1801能显著增加分蘖数，而微小杆菌属的R2567、伯克氏菌属的R2488和多形单胞菌属的R1405在田间能显著抑制分蘖数（图2C和图2D，错误发现率校正后的p < 0.05，Wilcoxon秩和检验；表S2B）。此外，接种细菌后，水稻的穗数和干重也出现了显著的相应增加或减少，这与这些细菌在水稻根系上丰度的增加有关（图2E、图2F和图S1H，错误发现率校正后的p < 0.05，Wilcoxon秩和检验；表S2B和表S2C）。综上所述，这些数据表明，根系微生物群的多种成员在调控水稻分蘖数方面起着因果作用。

图2 | 已培养的根系微生物群成员在调控水稻分蘖数方面起着因果作用

为了深入了解这些根系微生物群成员调控水稻分蘖的潜在机制，我们研究了根系微生物群调控水稻分蘖数的下游遗传途径。我们假设这些细菌可能通过水稻的独脚金内酯（SL）途径来调控水稻分蘖数，因为独脚金内酯是控制水稻分蘖的主要激素。独脚金内酯可被水稻受体矮化基因14（OsD14）识别，并通过降解水稻抑制蛋白矮化基因53（OsD53）来激活信号通路（图3A）。我们观察到，四个调控分蘖的细菌属的丰度受到水稻独脚金内酯途径的调控。在测试的独脚金内酯突变体（d10、d17、d14和d53）中，两个促进分蘖的细菌属（玫瑰色杆菌属和Piscinibacter属）富集，而两个抑制分蘖的细菌属（微小杆菌属和多形单胞菌属）减少（图S2A和图S2B，错误发现率校正后的p < 0.05，Wilcoxon秩和检验；表S3A）。此外，我们通过测量OsD53蛋白水平来检测细菌对水稻独脚金内酯信号通路的影响，OsD53是独脚金内酯信号通路中的关键抑制蛋白，会在独脚金内酯的触发下发生蛋白降解。在三种抑制分蘖的细菌中，微小杆菌R2567在细菌分泌物处理3小时后，使OsD53蛋白水平显著降低了59%，而促进分蘖的细菌玫瑰色杆菌R780使OsD53蛋白水平增加了2.4倍（图3B，错误发现率校正后的p < 0.05，双尾学生t检验；表S3B），这表明微小杆菌R2567和玫瑰色杆菌R780在早期时间点会影响水稻的独脚金内酯信号通路。这些结果支持了这些根系细菌通过独脚金内酯途径调控水稻分蘖的假设。 

我们发现微小杆菌R2567和玫瑰色杆菌R780以不同的方式调控独脚金内酯（SL）途径。首先，我们分析了它们对水稻中独脚金内酯生物合成的影响。微小杆菌R2567和玫瑰色杆菌R780均未产生可检测水平的4-脱氧奥罗班醇（4DO），这是水稻中的一种主要独脚金内酯（表S3B；具体方法见“STAR方法”）。接种微小杆菌R2567不影响水稻中4DO的水平，而玫瑰色杆菌R780显著降低了水稻中4DO的水平（图3C，错误发现率校正后的p < 0.05，双尾学生t检验；表S3B；具体方法见“STAR方法”）。这两种细菌都降低了另外两种水稻独脚金内酯，即奥罗班醇和4-氧代-卡劳内酯甲酯（4-oxo-MeCLA；图3D和图3E；表S3B）的水平，使用浓缩的细菌提取物也观察到了类似的效果（图S2C–S2E；表S3B）。独脚金内酯水平的降低与独脚金内酯生物合成基因的表达趋势一致（图S2F；表S3C）。这些结果表明，与玫瑰色杆菌R780不同，微小杆菌R2567对独脚金内酯生物合成的影响可能是由于通过降解OsD53激活独脚金内酯信号传导而产生的负反馈调节。接下来，我们检测了这两种细菌对野生型植株、独脚金内酯生物合成突变体d27和独脚金内酯受体突变体d14中水稻分蘖数的影响。玫瑰色杆菌R780促进分蘖的作用在d27和d14突变体中消失了（图3F，错误发现率校正后的p < 0.05，Wilcoxon秩和检验；表S3D），这表明它对分蘖的影响在很大程度上依赖于完整的独脚金内酯生物合成和信号传导。有趣的是，微小杆菌R2567抑制分蘖的作用在野生型和d27突变体中相似，但在d14突变体中显著减弱（图3G，错误发现率校正后的p < 0.05，Wilcoxon秩和检验；表S3D）。这些结果表明，微小杆菌R2567抑制分蘖的作用依赖于水稻独脚金内酯受体OsD14，这表明微小杆菌R2567可能产生了未知的分子来激活水稻的独脚金内酯信号传导。

为了研究微小杆菌R2567是否产生调控独脚金内酯（SL）信号传导从而影响分蘖数的分子，我们用从微小杆菌R2567培养物中提取的乙酸乙酯级分和合成的独脚金内酯类似物rac-GR24处理水稻幼苗（具体方法见“STAR方法”）。3小时后，在rac-GR24处理下观察到了OsD53蛋白的降解，在用微小杆菌R2567提取物处理后也检测到了类似但程度较小的效果（图S3A），这表明微小杆菌R2567产生的分子触发了OsD53蛋白的降解。为了分离并确认这种功能分子，我们对微小杆菌R2567培养物的乙酸乙酯提取物进行了生物活性导向的分离（具体方法见“STAR方法”）。经过反复的硅胶和半制备型高压液相色谱（HPLC）纯化，从诱导OsD53降解的级分（F3-1）中分离出一种生物活性化合物，命名为S6（图S3B–S3D；具体方法见“STAR方法”）。当对化合物S6进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析时，观察到一个主要峰，其精确质量为m/z 211.1440（[M + H]+，C₁₁H₁₉N₂O₂的计算值为211.1446）。通过¹³C核磁共振（NMR）光谱检测到11个碳信号，明确确定S6的分子式为C₁₁H₁₈N₂O₂。对S6的一维和二维NMR光谱的详细分析揭示了以下特征性二肽信号：两个羰基–C=O信号（δC 172.8和168.9 ppm）、一个与酰胺氮相连的–CH信号（δH 4.25和4.12 ppm）以及一个–CH₂信号（δH 3.51 ppm）（图S3E–S3G）。结合对其余脂肪族信号（包括两个异丙基–CH₃信号、三个–CH₂信号和一个–CH信号）的二维NMR相关分析，明确确定S6的结构为L-亮氨酸和L-脯氨酸的环二肽，即环（亮氨酸-脯氨酸）（图4A和图S3H–S3K；表S4A）。通过将其LC-MS保留时间、质谱以及NMR数据与市售的标准品进行比较，进一步确认了该化合物的身份（图S3L）。有趣的是，我们发现水稻会刺激微小杆菌R2567产生环（亮氨酸-脯氨酸）（图S4A，校正后的p < 0.05，方差分析和Tukey诚实显著差异检验[ANOVA和Tukey HSD]；表S4B），并且该化合物会从根部运输到腋芽以诱导OsD53降解（图S4B和图S4C，错误发现率校正后的p < 0.05，双尾学生t检验；表S4B和表S4C）。靶向代谢物分析显示，在水稻组织中未检测到环（亮氨酸-脯氨酸）（图S4D）。

然后，我们研究了环（亮氨酸-脯氨酸）在促进OsD53降解方面的作用，以及它在实验室和田间条件下调控水稻分蘖数的能力。首先，用市售的环（亮氨酸-脯氨酸）处理会诱导水稻中OsD53的降解，其趋势与使用rac-GR24以及水稻内源性独脚金内酯奥罗班醇时所观察到的相似（图4B、4C和图S4E，错误发现率校正后的p < 0.05，双尾学生t检验；表S4C）。与细菌诱导的OsD53降解情况一致（图3B），在微小杆菌R2567中检测到了环（亮氨酸-脯氨酸），而在其他四个与分蘖相关的细菌中未检测到（图S4F）。此外，我们分析了来自水稻群体中26个丰富的根系微生物群属的87个菌株。来自其他五个属的六个菌株也产生环（亮氨酸-脯氨酸），但其产生水平比微小杆菌R2567低3至27倍（图S4G，校正后的p < 0.05，方差分析和Tukey诚实显著差异检验；表S4B）。有趣的是，我们发现环（亮氨酸-脯氨酸）和rac-GR24会抑制微小杆菌R2567的运动性，并促进其生物膜的形成（图S4H和图S4I，错误发现率校正后的p < 0.05，Wilcoxon秩和检验；表S4D），而这些是细菌在根系定殖过程中的重要过程。接下来，我们检测了环（亮氨酸-脯氨酸）对分蘖发育的影响。在实验室条件下，环（亮氨酸-脯氨酸）处理显著减少了野生型日本晴水稻的分蘖数。在处理开始12天后，分蘖数的减少变得明显，与未处理的对照组相比平均减少了50%（图4D和图4E，错误发现率校正后的p < 0.05，Wilcoxon秩和检验；表S4E）。此外，环（亮氨酸-脯氨酸）对根系发育的影响与rac-GR24类似，它显著促进了主根的伸长，减少了冠根的数量，并抑制了水稻幼苗中带有次级侧根的侧根的增殖（图S4J和图S4K，错误发现率校正后的p < 0.05，Wilcoxon秩和检验；表S4F）。在田间试验中，环（亮氨酸-脯氨酸）抑制了日本晴水稻的分蘖（图4F，错误发现率校正后的p < 0.05，Wilcoxon秩和检验；表S4E），并且在其他水稻品种中也观察到了其抑制分蘖的作用，包括籼稻品种9311、aus稻品种NC1/536和粳稻品种Karabaschak，效果与rac-GR24相当（图4G–4I，错误发现率校正后的p < 0.05，Wilcoxon秩和检验；表S4E）。综上所述，微小杆菌R2567产生的环（亮氨酸-脯氨酸）激活了独脚金内酯信号通路，并抑制了水稻的分蘖发育。 

基于微小杆菌R2567抑制分蘖的作用依赖于独脚金内酯受体OsD14这一观察结果，我们假设环（亮氨酸-脯氨酸）可能直接作用于OsD14。对接分析预测环（亮氨酸-脯氨酸）与OsD14之间存在潜在的相互作用。微尺度热泳（MST）数据显示，环（亮氨酸-脯氨酸）以微摩尔级别的亲和力与OsD14结合，其解离常数（Kd）为2.56微摩尔。这与rac-GR24与OsD14结合的Kd值（2.15微摩尔）相似（图5A和图5B；表S5A）。生物层干涉测量（BLI）分析的独立测量结果（Kd为2.65微摩尔）和吉西莫内酯绿（YLG）水解分析（IC50值为2.94微摩尔）进一步支持了这种相互作用（图S5A–S5D；表S5B和表S5C；具体方法见“STAR方法”）。这些结果支持了环（亮氨酸-脯氨酸）直接与OsD14相互作用的假设。此外，环（亮氨酸-脯氨酸）不与OsKAI2结合，OsKAI2是一种与OsD14结构相似的受体（图S5E和图S5F；表S5A），并且不会诱导OsKAI2下游的基因表达（图S5G，错误发现率校正后的p < 0.05，Wilcoxon秩和检验；表S5D）。 

为了进一步研究环（亮氨酸-脯氨酸）与OsD14的结合机制，我们确定了OsD14与环（亮氨酸-脯氨酸）复合物的1.4埃晶体结构（表S5E）。高分辨率的电子密度图使我们能够明确识别出OsD14的典型配体结合腔中的环（亮氨酸-脯氨酸）（图5C、图S5H和图S5I）。环（亮氨酸-脯氨酸）通过疏水和/或范德华相互作用，与缬氨酸194以及几个芳香族残基（包括苯丙氨酸186、色氨酸205、酪氨酸209和苯丙氨酸245）配位。环（亮氨酸-脯氨酸）的两个羰基氧分别与色氨酸205和丝氨酸270形成氢键。此外，OsD14配体结合腔入口处的亮氨酸212和缬氨酸269与环（亮氨酸-脯氨酸）的亮氨酸侧链形成疏水相互作用（图5D）。值得注意的是，OsD14中这些与环（亮氨酸-脯氨酸）配位的残基（亮氨酸212除外）也参与了与rac-GR24的结合，特别是与ABC环部分的结合（图5D、图S5I和图S5J）。我们对每个与环（亮氨酸-脯氨酸）配位的残基进行了点突变，并将这些突变体用于微尺度热泳（MST）分析。V194K、W205F、Y209K、V269D和S270A突变体均无法与环（亮氨酸-脯氨酸）结合（图5E；表S5A）。将苯丙氨酸186或苯丙氨酸245突变为带电荷的残基会使OsD14不溶，因此我们使用可获得的突变体F186A和F245A进行MST分析。这两个突变体以及L212D突变体对环（亮氨酸-脯氨酸）的结合亲和力降低（图5E；表S5A）。有趣的是，所有这些突变体对与环（亮氨酸-脯氨酸）相互作用的影响与其对与rac-GR24相互作用的影响相同（图S5K；表S5A）。这些结果提供了有力的证据，表明环（亮氨酸-脯氨酸）以与独脚金内酯类似物rac-GR24一致的方式直接与独脚金内酯受体OsD14结合。

最后，我们评估了OsD14在环（亮氨酸-脯氨酸）对OsD53降解和分蘖发育影响中的重要性。环（亮氨酸-脯氨酸）处理显著降低了野生型水稻中OsD53蛋白的水平，但对d14突变体几乎没有影响（图5F，错误发现率校正后的p < 0.05，双尾学生t检验；表S5F），这表明OsD14对于环（亮氨酸-脯氨酸）诱导的OsD53降解至关重要。此外，环（亮氨酸-脯氨酸）处理在实验室和田间条件下均降低了野生型水稻的分蘖数，但对d14突变体没有影响，这与其对OsD53降解的影响一致（图5G和图5H，错误发现率校正后的p < 0.05，Wilcoxon秩和检验；表S5F）。环（亮氨酸-脯氨酸）对分蘖的抑制作用在独脚金内酯生物合成突变体中也存在（图S5L，错误发现率校正后的p < 0.05，Wilcoxon秩和检验；表S5F）。综上所述，这些数据表明，来自根系细菌微小杆菌R2567的环（亮氨酸-脯氨酸）通过直接与独脚金内酯受体OsD14相互作用来调控水稻的分蘖数。