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作者首先评估了 qNGS 方法，该方法通过用 DNA 标准品加标正常血浆制备的复溶样品。
QS1、QS2 和 QS3 的平均测序深度分别为 1016X、1112X 和 991X（Q1–Q3：820–1160X、939–1250X、827–1112X）。其参考位点的测序深度平均分别为 1840X、1302X 和 1415X。感兴趣变异株的测序深度平均为 2391X（Q1–Q3：1903–2792X）。
总体而言，qNGS 准确定量了所有 13 个变体的浓度，具有出色的线性（r2 = 0.98; Figure 2 ），尽管与预期值相比存在轻微的相对偏差（斜率 = 0.81）。
合成样品中变体的 qNGS 量化相对于其预期值的线性。正常血浆加标含有 NGS panel 检测到的 13 种变异的标准品。制备 8 个样品，每个 DNA 提取物使用 qNGS 方法分析 3 次。数据点用十字表示，每个变体的平均浓度显示为白色方块。显示了线性回归。
随着血浆中变异浓度的增加，测定的重复性重现性（Figure 3 ） 得到改善，观察到的变异系数 （CV） 范围从丰度最低的变异体（EGFR c.2369C > T;预期血浆浓度 = 123 拷贝/mL）的 34.3% 到最丰度变异体的 10.6%（CTNNB1 c.98C > A;预期血浆浓度 = 4006 拷贝/mL）。
qNGS 重现性取决于 ctDNA 浓度。正常血浆加标含有 NGS panel 检测到的 13 种变异的标准品。制备 8 个样品，每个 DNA 提取物使用 qNGS 方法分析 3 次。测量每个变体的变异系数并与其浓度进行比较。
接下来，作者使用 qNGS 对癌症患者的血浆样本评估了 ctDNA 定量。通过混合来自癌症患者的三个血浆样本来制备阳性样本，每个样本都因不同的突变而呈阳性：EGFR 外显子 19 缺失 （c.2235_2249del）、EGFR p.L858R （c.2573T > G） 和 BRAF p.V600E （c.1799T > A）。创建了八个混合样本，并通过 qNGS 和 dPCR 对体细胞变异进行定量。定量结果表明，两种方法之间存在高度线性相关性（r2 = 0.981; Figure 4 ）。
相对于 dPCR 定量，合并 NSCLC 患者样本中 qNGS 变体定量的线性。通过不同比例混合来自 EGFR 外显子 19 缺失（c.2235_2249del）、EGFR p.L858R（c.2573T > G）和 BRAF p.V600E（c.1799T > A）突变阳性的癌症患者的 3 个血浆样本，制备了 8 个样本。通过 qNGS 和 dPCR 定量体细胞变异。显示了线性回归。
此外，作者还分析了肿瘤中已知 EGFR 外显子 19 缺失的 NSCLC 患者的 8 个血浆样本。这种改变之前已在相应的游离 DNA 中被发现。同样，定量显示 qNGS 和 dPCR 之间存在高度线性关系（r2 = 0.991; Figure 5 ）。
相对于 dPCR 定量，NSCLC 患者样本中 EGFR 变体的 qNGS 定量的线性。使用 qNGS 和 dPCR 检测了肿瘤中已知 EGFR 外显子 19 缺失的 NSCLC 患者的 8 份血浆样本。显示了线性回归。
为了说明 qNGS 在监测治疗反应中的应用，作者分析了从参加 ELUCID（基于循环肿瘤 DNA 的转移性肺肿瘤治疗反应早期评估）临床试验 （ClinicalTrials.gov） 的四名患者在基线和治疗三周后收集的血浆样本 NCT03926260 。这项非对照前瞻性试点研究旨在评估 ctDNA 动力学在监测转移性 NSCLC 治疗反应方面的预后价值。主要目的是确定基线和第 3 周之间 ctDNA 浓度的变化是否可以预测晚期或转移性 NSCLC 患者对一线治疗的放射学反应，无论使用何种具体治疗。
患者 02-035 为 77 岁男性，左上叶肿瘤，转移至脑部和淋巴结。他的肿瘤携带EGFR p.L861Q （p.Leu861Gln;c.2582T > A） 和 TP53 （c.993 + 1G > A） 突变。在他的基线血浆样本中都可以检测到这两种突变（w0; Figure 6 A）. 接受奥希替尼治疗后，三周后两种突变的浓度均显着下降。第一次放射学评估显示部分反应。
非小细胞肺癌患者 ctDNA 的早期动力学。使用 qNGS 测试了在基线（w0）和治疗三周后（w3）从参加 ELUCID 试验的四名患者（（A-D，详见文中）收集的血浆样本。显示了检测到的变异的浓度。
患者 02-021 为 71 岁男性，右下叶肿瘤，淋巴结转移，肿瘤中携带重排ALK 基因和 TP53 p.C242F（p.Cys242Phe;c.725G > T）突变。虽然在基线时在他的血浆样本中检测到了 TP53 突变，但作者的 NGS 面板无法检测到 ALK 融合。接受阿来替尼一线治疗后，在第 3 周 （ Figure 6 B） 时，他的血浆中不再检测到 TP53 突变。第一次 CT 评估显示部分反应。
患者 02-031 为 60 岁女性，左下叶肿瘤，皮肤和脑转移。她的肿瘤携带TP53 p.R273C （p.Arg273Cys;c.817C > T） 突变，在治疗前在低浓度下检测到 （ Figure 6 C）。在使用帕博利珠单抗进行三周的免疫治疗后，血浆中 TP53 突变的浓度与基线相比增加了约 10 倍。不幸的是，患者病情迅速恶化，在第一次 CT 扫描前就去世了。
患者 01-041 为 62 岁男性，右下叶有肿瘤，转移至淋巴结和肾上腺。他的肿瘤携带KRAS p.G13D （p.Gly13Asp;c.38G > A） 和两个 TP53 （p.Pro278Ser;c.832C > T 和 p.Gln331*;c.991C > T） 突变，所有这些都在他的基线血浆中检测到 （ Figure 6 D）。在接受化疗（卡铂+培美曲塞）和免疫治疗（派姆单抗）的联合治疗后，患者在第一次影像学评估中表现出部分反应。血浆分析显示，在第 3 周时，所有三种突变的浓度均显着降低。
总结
作者开发了一种通过 NGS 对 ctDNA 进行绝对定量的创新方法，克服了非肿瘤循环 DNA 变异的局限性。作者的概念验证使用来自一小群患者的样本进行了演示，显示了该方法在广泛临床应用方面的潜力。该技术现在被用于分析来自整个 ELUCID 试验队列（100 名患者）的血浆样本，为评估早期 ctDNA 动力学是否可以作为治疗反应的可靠预测因子提供了一个独特的机会，无论治疗方式如何。通过消除对单个肿瘤基因型的依赖，作者的方法提供了一种更加标准化和全面的 ctDNA 监测方法，可以显着增强临床实践中的非侵入性肿瘤监测和反应评估。
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