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3.1. MicroRNA 作为 DLBCL 和非癌性血液疾病患者骨髓样本中的诊断生物标志物
对 DLBCL 患者的 7 个骨髓 （BM） 样本和 NCBD 患者的 6 个 BM 样本进行了 MiRNA 测序分析Figure 1 （ ）。在后续分析中纳入 miRNA 的标准如下：至少一组的中位读数大于 1000，并且比较组之间 miRNA 数量的差异大于两倍。基于这些条件，编制了一份清单，列出了 62 个 miRNA，这些 miRNA 在 BM 样品中 DLBCL 和 NCBD 之间差异表。
对 7 例弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 （DLBCL） 病例和 6 例非癌性血液病 （NCBD） 病例进行分层聚类分析，这些 miRNA 被选中用于研究组中使用 RT-PCR 进行验证。每列说明 miRNA 的表达，每行表示一个核酸标本。黄色：过表达 miRNA;深蓝色：下调 miRNA;绿色：细微变化;红色：一组样本的图形表示。
接下来，作者对有骨髓受累的 DLBCL 患者（n = 18）、无骨髓受累的 DLBCL 患者（n = 52）和非癌性血液疾病（NCBD）患者的骨髓样本中 miRNA-182、-451a、-151a、-148b、-183、-192 和 miRNA-106b 的表达水平进行了比较分析（n= 35）。选择这些 miRNA 是因为它们在 DLBCL 和 NCBD 之间的测序结果比较中显示出统计学上的显着差异 （ Table S3 ），并且已知与 DLBCL 相关 [ 16 ， 17 ， 18 19 ， ]。与 NCBD 患者的骨髓样本相比，在有和没有骨髓受累的 DLBCL 患者的骨髓样本中观察到 miRNA-151a、miRNA-148b 和 miRNA-192 的表达水平显着增加 （p < 0.05） Figure 2 （ ）。因此，可以推断 miRNA-151a、miRNA-148b 和 miRNA-192 在骨髓样本中的表达分析是检测局限性 DLBCL 的潜在诊断方法。
伴有骨髓受累的弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 （DLBCL BM+） 患者 （n = 18）、无弥漫性无骨髓受累大 B 细胞淋巴瘤 （DLBCL BM−） 的患者 （n = 52） 和非癌性血液病 （NCBD） 患者 （n = 35） 的骨髓样本之间 miRNA 表达水平的比较分析。
3.2. DLBCL 或非癌性血液病患者 BM 样本中的诊断遗传生物标志物
根据文献数据，作者选择了 11 种 DLBCL 的假定生物标志物：ASF1B、CD82B、CRISP3、FN1、MEF2B、PD-L1、TIMP1、TOP2A 和 TP53。这些基因是不同肿瘤类型的致癌基因和抑制基因 [ 20 ， 21 ， ， 22 ， 23 24 25 26 27 28 ]。作者希望确定它们是否也在 DLBCL 中表现出异常表达。它们在 DLBCL 中表达的变异表明它们可能是 DLBCL 的生物标志物。
结果发现，与 NCBD 相比，无 BM 受累的 DLBCL 和有 BM 受累的 DLBCL 的PD-L1 mRNA 水平均升高 （p < 0.05）;事实证明，与 NCBD 相比，TIMP1、TOP2A 和 TP53 的 mRNA 水平在无 BM 受累的 DLBCL 和有 BM 受累的 DLBCL 中均降低 （p < 0.05） （ Table 1 ）。
3.3. MiRNA 作为淋巴结 DLBCL 的预后生物标志物及其对生存的影响
回顾性地，作者整理了一组接受标准细胞减灭治疗并完成缓解诱导计划的 DLBCL 患者。该研究纳入了对治疗有反应且无复发生缓解（“预后良好”）或疾病进展但未缓解（“预后不良”）的患者。根据文献资料，作者选择了 miRNA-100、-125a、-125b、-126a、-143、-155、-16、-197、-221、-23a、-26a、-30b、-486、-574、-7、-10b、-146a 和 let7a，其特征是 B 细胞淋巴瘤中表达异常[ 29 ， 30 ]。通过实时 RT-PCR，作者对预后不良（n = 36）和预后良好（n = 7）的 DLBCL 组之间的 miRNA 表达水平进行了比较分析。作者观察到，在预后较差的 DLBCL 患者组与预后良好的 DLBCL 患者组中，miRNA-10b、-100、-125a、-125b、-126、-143、-23a 和 let-7a 的表达水平具有统计学意义的降低 （p < 0.05） Figure 3 （ ）。
弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 （DLBCL） 组之间 miRNA 表达水平的比较分析，预后不利 （n = 36） 和良好 （n = 7）。该图显示了中位数、上四分位数和下四分位数、非异常值范围和显示为圆圈的异常值。
绘制患者的总生存期（OS） 曲线;根据与预后有统计学意义相关的八种 miRNA 中每个 miRNA 的平均表达量，将患者分为高表达组和低表达组 （Figure 4 ）。Kaplan-Meier 生存分析表明，DLBCL 患者 miRNA-125a（p = 0.03）、miRNA-23a（p = 0.05）和 miRNA-100（p = 0.05）的高表达水平与良好的预后和更好的总生存期相关。
DLBCL 患者总生存期分析。（A）miRNA-125a;（B）miRNA-100;（C）miRNA-23a。蓝色和黄色曲线分别表示 miRNA 表达水平高和低的患者。
3.4. 淋巴结中 mRNA 和 miRNA 相互作用网络的分析
接下来，作者对编码 miRNA -10b、-100、-125a、-125b、-126、-143、-23a 和 let-7a 的靶基因进行了生物信息学分析，这些基因与 DLBCL 的预后有统计学意义的相关性。从京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库中，作者获得了参与“癌症通路”、“细胞周期”、“细胞死亡”和“B 细胞受体信号通路”等生物学途径的 miRNA 靶基因的数据。作者使用 MiRNet 数据库总共确定了 90 个靶标。一些靶基因同时受到多种 miRNA 的调节。因此，AKT1 受 miRNA-10b、-100、-125a、-125b、-126、-143 调控;BCL2 受 miRNA-125a、-125b、-126、-143 和 let-7a 调控;MYC 受 miRNA-125a、-23a 和 let-7a 调控;PIK3R1 受 miRNA-126、-143、-23a 和 let-7a 调控;IGF1R 受 miRNA-100、-125b、-143 和 let-7a 调控;KRAS 受 miRNA-126、-143 和 let-7a 调控;EGFR 受 miRNA-125a、-125b 和 let-7a 调控;CDKN1A 受 miRNA-10b、-125a 和 let-7a 调控;XIAP 受 miRNA-10b、-125b、-143 和-23a 调控;STAT3 受 miRNA-125a、-125b、-23a 和 let-7a 调控。使用 miRNet 2.0 资源 （ ） 可视化获得的数据 Figure 5 。MiRNet 是一个 miRNA。
使用 miRnet 2.0 平台靶向分析 miRNA-10b、-100、-125a、-125b、-126、-143、-23a 和 let-7a。红色和绿色菱形分别表示 microRNA 及其靶基因。
总结
尽管寻找 DLBCL 的预后标志物是当代分子生物学的一个相关问题，但获得的数据仍未与 DLBCL 预后评估的常规临床分析相结合。在目前的工作中，作者没有发现所研究的 miRNA 的表达因癌症的 IPI 状态而存在统计学上的显着差异。这一发现可能是因为作者的样本量小。因此，作者的结果很难整合到现有的预后体系中。需要进一步进行涉及大样本量的多中心试验来验证作者的数据 。
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