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通过 TCGA 和 GTEx 数据库对 AHCY 在各种泛癌类型的表达水平进行分析。研究结果显示，不同肿瘤类型之间 AHCY 表达存在显著异质性（Figure 1A ）。基于 AHCY 在结直肠癌、前列腺癌和胶质母细胞瘤等恶性肿瘤中的既定意义，作者旨在探索其在 BLCA 中的潜在作用。 Figure 1B 清楚地说明了 BLCA 肿瘤组织中 AHCY 表达的显着上调。值得注意的是，AHCY 的 mRNA 表达在肿瘤组织的优势中表现出明显且一致的调节 （ Figure 1C ）。ROC 曲线分析用于确定肿瘤患者与非肿瘤患者 AHCY 表达阳性检测次数的阈值（AUC=0.882，CI=0.840–0.924）（ Figure 1D ）。此外，AHCY mRNA 在正常细胞系和 BLCA 细胞系中的表达水平均可定量。5637 个细胞中的表达水平表现出统计学上的显着升高，与其他 BLCA 细胞系以及正常膀胱上皮细胞系 SV-HUC-1 （ ）明显不同 Figure 1E 。此外，TCGA 数据集中的 cBioPortal 图谱用于研究 BLCA 患者中 AHCY 基因的 oncoprint 定位 （ Figure 1F ）。
全面概述 AHCY 在多种恶性肿瘤中的表达水平。（A）阐明 AHCY 在多种癌亚型中正常样本和肿瘤样本之间的差异表达模式，包括 ACC（腺样囊性癌）、BLCA（膀胱尿路上皮癌）、BRCA（乳腺浸润性癌）、CESC（包括宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌）、CHOL（胆管癌）、COAD（结肠腺癌）、DLBC（弥漫性大 B 细胞淋巴瘤）、ESCA（食管癌）、 GBM（多形性胶质母细胞瘤）、HNSC（头颈部鳞状细胞癌）、KICH（肾疏色）、KIRC（肾透明细胞癌）、KIRP（肾肾状细胞癌）、LAML（急性髓系白血病）、LGG（脑低级别神经胶质瘤）、LIHC（肝肝细胞癌）、LUAD（肺腺癌）、LUSC（肺鳞状细胞癌）、MESO（间皮瘤）、OV（卵巢浆液性囊腺癌）、PAAD（胰腺癌）、PCPG（嗜铬细胞瘤和副神经节瘤）、 PRAD（前列腺腺癌）、READ（直肠腺癌）、SARC（肉瘤）、SKCM（皮肤皮肤黑色素瘤）、STAD（胃腺癌）、TGCT（睾丸生殖细胞瘤）、THCA（甲状腺癌）、THYM（胸腺瘤）、UCEC（子宫体子宫内膜癌）、UCS（子宫癌肉瘤）和 UVM（葡萄膜黑色素瘤）。（B）检查 BLCA 和邻近正常组织中的 AHCY 表达水平。（C）通过 qRT-PCR 在 SV-HUC-1 和多种 BLCA 细胞系中进行 AHCY mRNA 表达水平的定量。（D）检查 AHCY 在 BLCA 和相应正常组织中的表达模式。 （E） cBioPortal OncoPrint 图谱全面说明了 BLCA 患者中 AHCY 基因组改变的分布情况。（F） cBioPortal OncoPrint 图谱全面说明了 BLCA 患者中 AHCY 基因组改变的分布情况。*、**和***表示 p<0.05、p<0.01 和 p< 0.001。
BLCA 患者 AHCY 表达水平与临床病理特征的相关性
使用 TCGA 数据库检查 BLCA 患者临床参数与 AHCY 表达水平之间的关系。这些临床参数包括性别、年龄、病理 T 分期、病理 N 分期、病理 M 分期、病理分期、体重、亚型、组织学分级、OS 事件、DSS 事件和 PFI 事件 （Figure 2A–G ）。研究发现，AHCY 的表达与亚型（ Figure 2H ）、组织学分级（ Figure 2I ）、OS 事件（ Figure 2J ）、DSS 事件（ Figure 2K ）和 PFI 事件（ ）高度相关 Figure 2L 。这些结果强调了 AHCY 表达与 BLCA 的众多临床特征之间的相关性。
AHCY 在不同临床特征患者肿瘤组织中的表达水平。性别（A）、年龄（B）、病理 T 分期（C）、病理 N 分期（D）、病理 M 分期（E）、病理分期（F）、体重（G）、亚型（H）、组织分级（I）、OS 事件（J）、DSS 事件（K）、PFI 事件（L）和 AHCY 之间的关系。*、**和***表示 p<0.05、p<0.01 和 p< 0.001。
为了阐明 AHCY 表达对患者生存的影响，BLCA 患者根据各自的 AHCY 表达水平分为两组。初始组包括表现出高水平 AHCY 表达的前 50% 样本，而后一组包括表现较低的 50%，表现出低表达水平。随后，以 AHCY 的平均表达值为关键参考点，进行生存分析。利用 Kaplan-Meier 生存分析技术，作者发现 AHCY 表达升高与 BLCA 患者的有害结果有关。
这种现象在总生存期和无进展生存期方面尤为明显（Figure 3A 和 B ）。在接下来的分析中，对不同临床病理状态的 BLCA 患者进行了亚组评估。确定 AHCY 表达升高与 BLCA 的不良预后表现出显着相关性，渗透到各个人口统计学和临床亚组。这包括那些患有 T3 期肿瘤、高级别肿瘤、淋巴结阳性状态 N2、BMI 超过 25 以及非状肿瘤形态的个体 （ Figure 3C–G ）。
AHCY 表达与膀胱癌预后的相关性。（A 和 B） AHCY 表达水平与 BLCA 患者总生存期 （OS） 和无进展生存期 （PFS） 之间的关系。（C-G）AHCY 表达对不同患者亚组预后的影响，包括病理 T 分期、组织分级、病理 N 分期、BMI 和亚型。
AHCY 表达升高是 BLCA 总生存期的一个明显危险因素
通过单因素和多因素 Cox 比例风险回归分析评估 BLCA 的预后。审查的自变量包括性别、病理性 N 分期、亚型、年龄、病理性 T 分期、病理性 M 分期和 AHCY 表达。值得注意的是，分析表明，AHCY 的高表达成为 BLCA 患者总生存期的重要预测因子。此外，单变量和多变量分析都一致强调病理性 N 分期是 BLCA 患者总生存期的有效预后因素。此外，单因素分析将亚型、年龄、病理 T 分期和病理 M 分期确定为关键预后因素 。
随后，通过结合独立的预后标志物构建列线图，包括病理性 N 分期、病理性 T 分期、病理性 M 分期、亚型、年龄和 AHCY。六种临床病理特征（病理性 N 分期、病理性 T 分期、病理性 M 分期、亚型、年龄和 AHCY）与 1 年、3 年和 5 年间隔的 OS 生存率之间的关联 （Figure 4A ）。1 年、3 年和 5 年间隔的校准曲线表明作者的研究结果与预测值之间的一致性，因此表明基于 AHCY 的列线图具有合理的性能水平 Figure 4B （ ）。c 指数值为 0.651 表明预测的准确度适中。
预测折线图的构建。（A）用于预测 OS 1、3 和 5 年的列线图。（B）1 年、3 年和 5 年修正曲线。
采用 Limma 软件工具对低 AHCY 和高 AHCY 条件进行差异表达分析。选择了 714 个差异基因的精选队列，遵循 |logFC|>1 和具有统计学意义的调整后 p 值 （Figure 5A ）。该队列由 402 个被鉴定为上调的基因和 312 个被鉴定为下调的基因组成。随后，作者检查了 TCGA BLCA 数据集中与 AHCY 表达相关的共表达基因。作者选择了 2236 个 Spearman 相关系数超过 0.3 且 p 值低于 0.05 的基因。 Figure 5B 描绘了表现出最明显正相关性的 35 个基因。分析揭示了与 AHCY 共表达的基因在 817 个生物过程、238 个细胞成分、184 个分子功能和 43 个 KEGG 途径的广泛而多样的范围内错综复杂地参与其中。GO 术语表明这些基因与广泛的生物过程有关。此外，这些基因有助于线粒体内膜功能、单链 DNA 结合和核糖核蛋白复合物结合 （ Figure 5C–E ）。这些基因与肌萎缩侧索硬化症、剪接体、细胞周期调节、核质转运和蛋白酶体等关键途径有关 （ Figure 5F ）。与 AHCY 共表达富集研究相关的综合 GO 术语和 KEGG 通路数据简要总结在 Supplementary materials 中。
AHCY 相关基因的功能聚类和相互作用网络分析。（A）说明差异表达基因的火山图。（ 二 ）热图描绘了 BLCA 中与 AHCY 呈正相关的前 35 个基因。（C）与 AHCY 共表达的基因的生物过程（BP）富集分析。（D）与 AHCY 共表达基因的细胞成分（CC）富集分析。（E）与 AHCY 共表达基因的分子功能（MF）富集分析。（F）KEGG 通路内 AHCY 共表达基因的富集分析。表示 p < 0.001。
BLCA 中 AHCY 表达水平与 m6A 修饰的关系
与 AHCY 相关基因的功能富集的主要重点与生物活性有关，包括 rRNA 加工、ncRNA 加工和核糖体生物发生。M6A RNA 甲基化对于 RNA 合成至关重要。因此，作者假设 AHCY 表达的程度可能与 m6A 的改变有关。随后，进行了一项检查，以阐明 BLCA 中 AHCY 表达水平与与 m6A 修饰有关的 20 个基因之间的相关性。AHCY 的表达与 m6A 修饰途径中的重要基因呈正相关，包括 YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2、WTAP、RBM15、RBM15B、HNRNPC、METTL14、METTL3、IGF2BP2、RBMX、HNRNPA2B1、VIRMA、FTO 和 ALKBH5（ Figure 6A 和 B ）。分析表明，AHCY 的表达与 YTHDF1、YTHDF3、RBM15、HNRNPC、RBMX、HNRNPA2B1、VIRMA 和 ALKBH5 等多种基因显著相关。作者发现 BLCA 中基因 ZC3H13、IGF2BP2、IGF2BP3 和 ALKBH5 的高表达可导致预后不良 （ Figure 6C ）。
BLCA 中 AHCY 表达与 m6A 相关基因之间的相互作用。（A）进行了一项分析，以阐明 AHCY 与 TCGA BLCA 队列中一组 20 个 m6A 相关基因之间的相关性。（B）散点图说明了 AHCY 表达与 m6A 相关基因水平之间的复杂动态。（C）评价 ZC3H13、IGF2BP2、IGF2BP3 和 ALKBH5 在 BLCA 中的预后意义。*、**和***表示 p<0.05、p<0.01 和 p< 0.001。
利用 TCGA 数据库，作者的研究揭示了 BLCA 患者中 AHCY 的表达与 Th2 细胞和 Tgd 细胞的存在之间存在正相关关系。相反，AHCY 和 pDC，肥大细胞，iDC 和 DC 的表达之间呈负相关 Figure 7A （ ）。进一步研究，作者发现 AHCY 表达与 Th2 细胞浸润之间存在正相关关系，如 Figure 7B 中生动地说明，以及与 Tgd 细胞，如 Figure 7C 中所示。值得注意的是，AHCY 表达高和低的患者之间 Th2 细胞和 Tgd 细胞的浸润水平存在差异 （ Figure 7D–F ）。值得注意的是，这些数据表明 AHCY 与 Th2 细胞和 Tgd 细胞保持着深刻的相关性，强调了其在调节 BLCA 内免疫动力学方面的潜在作用。
BLCA 中 AHCY 表达与免疫浸润的相关性分析。（A）BLCA 患者 AHCY 与免疫浸润细胞的关系。（B）通过散点图 AHCY 表达与 Th2 细胞浸润水平之间的相关性。（C）通过散点图 AHCY 表达与 Tgd 细胞浸润水平之间的相关性。（D）AHCY 高表达和低表达患者免疫细胞分布的差异。（E 和 F）高 AHCY 表达和低 AHCY 表达队列之间 Th2 细胞和 Tgd 细胞浸润水平的差异。*、**和***表示 p<0.05、p<0.01 和 p< 0.001。
敲低 AHCY 抑制 BLCA 细胞的增殖、迁移和侵袭
AHCY 在 BLCA 细胞（5637 个细胞）中的强表达在之前的 q-PCR 研究中得到证实，因此作者选择了 5637 个细胞进行验证 （ Figure 1D ）。qPCR 结果表明，si-AHCY-2#表现出更高的敲低效率（ Figure 8A ）。随后的细胞研究利用了这种 si-RNA。结果表明，靶向抑制 AHCY 导致 5637 个细胞的增殖能力减弱 （ Figure 8B ）。此外，AHCY 的抑制导致这些细胞的克隆形成潜力降低 Figure 8C （ ）。同时，观察到 5637 个细胞的划痕愈合率在 AHCY 敲除后发生衰减（ Figure 8D ）。此外，AHCY 的沉默与 5637 个细胞的迁移和侵袭能力显着降低有关 （ Figure 8E ）。此外，作者发现 AHCY 敲低后 ZC3H13、IGF2BP2、IGF2BP3 和 ALKBH5 的 mRNA 水平均不同程度地降低 （ Figure 8F ）。
在体外验证了 AHCY 对膀胱癌增殖、迁移、侵袭和抗凋亡的影响。（A）qPCR 比较敲低组和对照组的 AHCY mRNA 含量。（ 二 ）5637 个 si-AHCY 细胞和 si-NC 细胞的增殖能力。（C）将 5637 个细胞的集落形成与 si-AHCY 或 si-NC 进行比较。（D）比较 si-NC 组和 si-AHCY 组在 0 h 和 24 h 内 5637 个细胞的迁移效率（200um 为等级）。（E）采用 Transwell 法（100um）检测 5637 个细胞的侵袭能力。（F）敲低 AHCY 后 BLCA 中 ZC3H13、IGF2BP2、IGF2BP3 和 ALKBH5 的相对 mRNA 表达。*、**和***表示 p<0.05、p<0.01 和 p< 0.001
总结
这项调查代表了对 AHCY 在 BLCA 中的预后意义的首次调查。作者的研究结果表明，AHCY 是预测 BLCA 患者治疗结果和预后的潜在生物标志物 。
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