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IGF2BP2 的表达与胰腺癌中谷氨酰胺代谢相关基因 SLC1A5 呈正相关，并预测胰腺癌患者的预后不良
重编程的能量代谢是肿瘤的一个重要特征，而肿瘤中常见的代谢变化之一是谷氨酰胺代谢的增加。谷氨酰胺作为血液中最丰富的循环氨基酸，在肿瘤细胞的生长和增殖中发挥着独特的营养作用[9 , 25 , 26 ]。首先，为了定义胰腺癌中谷氨酰胺代谢的水平，作者获取了一份包含 41 个谷氨酰胺代谢相关基因的列表，并通过计算癌症基因组图谱（TCGA）胰腺导管腺癌（PDAC）数据库中的水平，计算了谷氨酰胺代谢特征（Gln 特征）的评分。将肿瘤分为 Gln 特征高组和 Gln 特征低组，生存分析显示 Gln 特征与较差的总生存期（OS）显著相关（图 1 A）。
IGF2BP2 与 SLC1A5 呈正相关，并与胰腺癌的预后不良相关。A. 基于 TCGA-PDAC 队列中谷氨酰胺评分的 Kaplan-Meier 生存分析（P < 0.0001，对数秩检验）。B. 胰腺癌患者谷氨酰胺水平的 ROC 曲线和 AUC。（ROC = 受试者工作特征。AUC = 曲线下面积）。C. TCGA 数据库中 IGF2BP2 mRNA 表达与谷氨酰胺代谢相关基因之间的相关性。D. GEPIA 数据库中 IGF2BP2 mRNA 表达与 SLC1A5 mRNA 表达之间的相关性。E. GEPIA 数据库显示胰腺癌组织（T）和正常胰腺组织中 IGF2BP2 和 SLC1A5 的表达。F. GEPIA 数据库显示不同 IGF2BP2 和 SLC1A5 表达水平的胰腺癌患者的总生存期。G. 人胰腺癌中 IGF2BP2 和 SLC1A5 的免疫组化染色。标尺，2000 μm 20 μm。H. 免疫组化评分统计分析。I。基于免疫评分的 IGF2BP2 和 SLC1A5 表达相关性。J。KPC 小鼠胰腺组织的免疫组化染色。标尺，50 μm。K。通过 Western blot 检测非恶性 hTERT-HPNE（HPNE）细胞和胰腺癌细胞系（PaTu8988，Mia-PaCa2，SW1990，PANC-1，CFPAC，Aspc-1）中 IGF2BP2 和 SLC1A5 的蛋白表达。L。通过 CCK8 法分析 HPNE 细胞、PANC-1 细胞和 PaTu 8988 细胞在有或无谷氨酰胺条件下的活力。*P <0.05，****P <0.0001
ROC 曲线和曲线下面积（3 年 AUC=0.690，5 年 AUC=0.910）进一步表明，该评分是胰腺癌患者预后的良好预测指标（图1 B）。这些结果表明，与肿瘤谷氨酰胺代谢活性较低的患者相比，肿瘤谷氨酰胺代谢活性较高的患者生存率较差。
RNA m6A 修饰对肿瘤代谢至关重要。随后，作者尝试探究胰腺癌内源性谷氨酰胺代谢与 m6A 修饰相关基因之间是否存在关联。作者对 m6A 修饰基因与评分进行了相关性分析，发现 IGF2BP2 的相关性最为显著。进一步分析表明，IGF2BP2 与谷氨酰胺代谢相关基因 SLC1A5 密切相关（图 1 C）。GEPIA 数据库的数据挖掘也显示 IGF2BP2 的表达与 SLC1A5 呈正相关（图 1 D），进一步证实 IGF2BP2 与 SLC1A5 密切相关。这些结果支持了 IGF2BP2 可能参与介导肿瘤细胞摄取谷氨酰胺的观点。
作者采用生物信息学方法研究了 IGF2BP2 和 SLC1A5 在人类胰腺癌中的作用。基于 GEPIA 生物信息学工具，IGF2BP2 和 SLC1A5 在胰腺癌组织中的表达较正常组织上调（图 1 E）。随后，GEPIA 数据库和 Kaplan-Meier Plotter 生物信息学工具均显示，IGF2BP2 或 SLC1A5 表达高的患者总生存期（OS）比表达低的患者差（图 1 F）。此外，GEPIA 生物信息学工具验证了胰腺癌患者中，IGF2BP2 或 SLC1A5 mRNA 水平升高的患者无病生存期（DFS）更差。
然后，为了进一步揭示胰腺癌中 IGF2BP2 和 SLC1A5 的上调，作者检测了人胰腺癌组织中 IGF2BP2 和 SLC1A5 的表达。与上述研究结果一致，在恶性转化过程中观察到的 IGF2BP2 和 SLC1A5 的特异性免疫反应性在从 PanIN 病变到胰腺癌中显著增加（图 1 G 和 H）。此外，免疫组化评分的相关性分析再次证实了胰腺癌组织中 IGF2BP2 和 SLC1A5 表达的阳性相关性（图 1 I）。这些观察结果在广泛使用的 KPC 模型中得到了进一步证实。与正常胰腺导管细胞相比，癌细胞中的 IGF2BP2 和 SLC1A5 表达增加（图 1 J）。同时，与非恶性 hTERT-HPNE（以下简称 HPNE）细胞相比，胰腺癌细胞系的 IGF2BP2 和 SLC1A5 表达普遍增加（图 1 K）。此外，CCK8 实验进一步表明，谷氨酰胺缺乏显著抑制了胰腺癌细胞的生长（图 1 L）。 综合来看，这些发现表明 IGF2BP2 与谷氨酰胺代谢基因 SLC1A5 的表达密切相关，该基因在胰腺癌中上调，其上调预测了胰腺癌患者的预后不良。
IGF2BP2 通过调节谷氨酰胺代谢促进体外和体内的肿瘤增殖
为评估 IGF2BP2 在胰腺癌中的生物学作用，作者利用 CRISPR-Cas9 系统构建了 IGF2BP2 敲除（KO）细胞，并检测了 IGF2BP2-KO PANC-1 细胞和 IGF2BP2-KO PaTu 8988 细胞中的 IGF2BP2 蛋白水平（图 2 A）。CCK8 和集落形成实验结果显示，IGF2BP2 敲除显著抑制了 PANC-1 和 PaTu 8988 细胞的增殖和集落形成（图 2 B 和 C）。为进一步验证 IGF2BP2 是否促进肿瘤体内进展，作者将 PANC-1 细胞皮下注射到裸鼠体内。与对照组（PANC-1 细胞）相比，IGF2BP2-KO 转染的皮下肿瘤生长受到抑制（图 2 D）。同时，IGF2BP2-KO 小鼠的平均肿瘤体积和重量在处死时明显低于对照组小鼠（图 2 E 和 F）。此外，IGF2BP2-KO 转染的皮下肿瘤增殖显著降低，这体现在 Panc-1-IGF2BP2-KO 细胞来源的异种移植肿瘤中 Ki67 蛋白水平较低（图 2 G）。 作者通过 CCK8 和 ELISA 实验进一步发现，IGF2BP2 的缺失会导致胰腺癌细胞谷氨酰胺摄取水平的降低（图 2 H 和 I），这会影响肿瘤细胞的增殖能力。这些观察结果表明，IGF2BP2 通过调节谷氨酰胺代谢，在体外和体内促进胰腺癌的生长。
IGF2BP2 促进胰腺癌的增殖和谷氨酰胺摄取。A. 通过蛋白质印迹法检测胰腺癌细胞系中 IGF2BP2 的蛋白水平。B. 通过 CCK8 法分析敲除 IGF2BP2 的 PANC-1 细胞和 PaTu 8988 细胞的活力。C. 代表性集落形成实验图像和集落数量分析。D. 接种 42 天后皮下注射转染 KO-IGF2BP2 和 KO-NC 的 PANC-1 细胞的代表性异种移植肿瘤。E. 每周记录肿瘤体积（n = 5）。F. PANC-1 细胞异种移植肿瘤的重量（n = 5）。G. 肿瘤切片的 Ki67 增殖免疫组化（IHC）染色。标尺，50 μm。H. 在有或无谷氨酰胺存在的情况下，通过 CCK8 法分析敲除 IGF2BP2 的 PANC-1 细胞和 PaTu 8988 细胞的活力。I. 通过 ELISA 检测细胞内谷氨酰胺水平。 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001, ns: 无统计学显著性
IGF2BP2 以 m6A 依赖的方式维持 SLC1A5 mRNA 的稳定性
最近，IGF2BP2 作为 m6A 阅读器，影响 m6A 修饰 mRNA 的稳定性和翻译[27 ]。为验证 SLC1A5 是 IGF2BP2 的潜在靶点，在胰腺癌细胞中敲除 IGF2BP2，作者的结果显示，IGF2BP2 敲除后，SLC1A5 的蛋白和 mRNA 表达水平均显著抑制（图 3 A 和 B）。与蛋白和 mRNA 水平下降一致，在 IGF2BP2 敲除后观察到 SLC1A5 mRNA 半衰期缩短（图 3 C）。
IGF2BP2 以 m6A 依赖的方式调控 SLC1A5 的表达。A. 通过蛋白质印迹法检测 IGF2BP2 敲除后胰腺癌细胞系中 SLC1A5 的蛋白水平。B. 通过 RT-PCR 检测 IGF2BP2 敲除后胰腺癌细胞系中 SLC1A5 的 mRNA 水平。C. 检测 IGF2BP2 敲除或有 IGF2BP2 的 PANC-1 细胞和 PaTu 8988 细胞中 SLC1A5 的 mRNA 半衰期（t1/2）。D. MeRIP-seq 分析显示 PANC-1 细胞系中有多个 m6A 峰。E. MeRIP-seq 分析鉴定了 m6A 基序。F. 基于 MeRIP-seq 的 IGV 可视化揭示了 SLC1A5 mRNA 中显著的 m6A 修饰位点。G. SRAMP 在线软件预测了 SLC1A5 mRNA 的 m6A 修饰位点。H. 展示了用于验证 SLC1A5 mRNA 上 m6A 修饰的 MeRIP-qPCR 引物设计的示意图。引物#1 是潜在的 m6A 位点，而引物#2 是非 m6A 位点。I. MeRIP-qPCR 通过引物#1 和#2 验证了 m6A 修饰。J. 通过 RIP 实验检测了 IGF2BP2 与 SLC1A5 mRNA 之间的相互作用。 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001
为了全面分析由 IGF2BP2 介导的 m6A 修饰基因，作者在 IGF2BP2 敲除或有 IGF2BP2 的 PANC-1 细胞中进行了 MeRIP-seq。MeRIP-seq 显示 PANC-1 细胞有 11,499 个独特峰，而 IGF2BP2 敲除后有 686 个独特峰（图 3 D）。此外，通过分析测序数据，作者发现 GGAC 是 IGF2BP2-KO 细胞和对照组 PANC-1 细胞中 m6A 峰最富集的基序，与先前报道一致[ 28 ]（图 3 E）。此外，从作者的 MeRIP-seq 数据中，作者证实 SLC1A5 mRNA 中的 m6A 丰度在 IGF2BP2 敲除后降低（图 3 F）。这些数据共同暗示了一种 m6A 依赖的调控机制。
此外，作者基于 m6A-seq 数据和 SRAMP 的预测，预测了高置信度的 m6A 修饰位点，以确定 SLC1A5 在胰腺癌中的 m6A 修饰机制（图 3 G）。之后，作者在非常高的置信度 m6A 修饰位点（SLC1A5 # 1）和非 m6A 修饰位点（SLC1A5 # 2）分别设计了引物（图 3 H），并利用甲基化 RNA 免疫沉淀（MeRIP）评估相对 m6A 丰度变化。MeRIP 实验表明，在 IGF2BP2 敲除后，SLC1A5 的 m6A 丰度在修饰位点显著降低，而非 m6A 修饰位点基本未变（图 3 I）。此外，作者使用 IGF2BP2 特异性抗体在 RNA 免疫沉淀（RIP）实验中证实了 IGF2BP2 与 SLC1A5 mRNA 在 PANC-1 和 PaTu 8988 细胞中的相互作用（图 3 J）。综合这些数据，证实 IGF2BP2 通过 m6A 依赖的方式调控 SLC1A5 表达。
SLC1A5 通过激活 mTORC1 信号通路促进胰腺癌增殖
SLC1A5 是一种氨基酸转运蛋白，在肿瘤中经常过表达，并增强谷氨酰胺代谢[29 ]。通过功能缺失实验评估了 IGF2BP2 靶基因 SLC1A5 在胰腺癌中的作用。作者在胰腺癌细胞中敲低 SLC1A5 的表达，并通过 RT-PCR 分析验证了敲低效率（图 4 A）。CCK8 实验表明，与对照相比，SLC1A5 的耗竭显著抑制了胰腺癌细胞的增殖（图 4 B）。此外，当 SLC1A5 被敲低时，胰腺癌细胞的集落形成能力显著受到抑制（图 4 C）。综上所述，上述数据模拟了 IGF2BP2 敲除的效果。
SLC1A5 通过激活 mTORC1 通路促进胰腺癌细胞增殖和谷氨酰胺摄取。A. RT-PCR 检测 PANC-1 和 PaTu 8988 细胞中 SLC1A5 的 mRNA 水平。B. CCK8 法分析敲低 SLC1A5 前后 PANC-1 细胞和 PaTu 8988 细胞的活力。C. 克隆形成试验的代表性图像及克隆数量分析。D. Western blot 检测 SLC1A5 耗竭对 mTORC1 信号通路的影响。E. ELISA 检测细胞内谷氨酰胺水平。**P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001
近年来，研究发现氨基酸对哺乳动物靶标雷帕霉素复合物 1（mTORC1）的激活至关重要，其中特别对谷氨酰胺的减少敏感[30 – 32 ]，因此作者推测 SLC1A5 可能通过激活 mTORC1 信号通路促进胰腺癌细胞的增殖。因此，作者接下来解析了 SLC1A5 在胰腺癌中对 mTORC1 信号通路的作用。作者的实验结果表明，敲低 SLC1A5 抑制了 mTORC1 通路激活，这体现在 mTOR、核糖体蛋白 S6 激酶β-1（S6K1）和真核翻译起始因子 4E 结合蛋白 1（4E-BP1）的磷酸化水平降低（图 4 D）。此外，添加谷氨酰胺逆转了这些结果。此外，作者发现敲低 SLC1A5 可能减少胰腺癌细胞对谷氨酰胺的摄取（图 4 E）。作者接下来解析了 IGF2BP2 在 mTORC1 信号通路中的作用，结果表明 IGF2BP2 的敲除使 mTORC1 通路失活（D-E）。 综合来看，作者的数据显示 SLC1A5 与 mTORC1 信号通路在胰腺癌中存在独特的分子关联。
上述数据共同证明，IGF2BP2 通过调节谷氨酰胺代谢途径，对促进胰腺癌细胞生长至关重要。考虑到谷氨酰胺裂解在胰腺癌中的关键作用，作者测试了 IGF2BP2 是否可以作为胰腺癌治疗的潜在靶点。
为研究 IGF2BP2 对细胞放射增敏的影响，作者进行了 CCK8 实验和集落形成实验，结果显示，虽然敲除 IGF2BP2 或 6GY 照射单独处理可以抑制细胞增殖，但两者联合处理比单独处理显示出更显著的抑制作用（图 5 A 和 B）。此外，作者建立了异种移植小鼠模型以验证 IGF2BP2 在体内的相同作用。与细胞实验结果一致，接受 6GY 照射的 IGF2BP2 敲除细胞在小鼠体内显著抑制了肿瘤生长，这体现在与对照组相比肿瘤体积和重量的显著抑制（图 5 C 和 D）。
敲除 IGF2BP2 增强了胰腺癌细胞对放疗和化疗的敏感性。A. 通过 CCK8 法分析在 6 Gy 放疗和 0 Gy 放疗条件下，PANC-1 细胞和 PaTu 8988 细胞有无 IGF2BP2 敲除的细胞活力。B. 指示的集落形成试验代表性图像和集落数分析。C. 6 Gy 放疗对皮下 PANC-1 细胞有无 IGF2BP2 敲除异种移植生长的影响。D. PANC-1 细胞异种移植的肿瘤重量（n = 5）。E. PANC-1 和 PaTu 8988 细胞有无 IGF2BP2 敲除，用不同浓度的吉西他滨处理 48 h，然后通过 CCK8 法测量细胞活力。F. 吉西他滨处理对皮下 PANC-1 细胞有无 IGF2BP2 敲除异种移植生长的影响。G. PANC-1 细胞异种移植的肿瘤重量（n = 5）。
目前，吉西他滨仍然是胰腺癌治疗的一线药物，但其化疗耐药性给治疗带来了显著阻力。因此，提高对吉西他滨的敏感性可能有助于增强治疗效果并改善胰腺癌的预后。作者假设敲除 IGF2BP2 与吉西他滨联合使用可能在胰腺癌治疗中取得更好的效果。为此，作者用吉西他滨处理了敲除或未敲除 IGF2BP2 的 PANC-1 和 PaTu 8988 细胞。正如预期，联合治疗对胰腺癌细胞生长的抑制作用更为显著（图 5 E）。
为确定 IGF2BP2 是否在体内介导胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性方面发挥作用，作者建立了带有或不带有 IGF2BP2 敲除的 PANC-1 细胞的皮下异种移植肿瘤模型，随后每周进行两次腹腔注射吉西他滨。与对照相比，靶向 IGF2BP2 或单独给予吉西他滨均能轻微减小肿瘤大小和重量。此外，联合治疗对 PANC-1 异种移植肿瘤生长的抑制作用更为显著（图 5 F 和 G）。作者的数据共同表明，敲除 IGF2BP2 不仅可以提高胰腺癌的放射敏感性，还可以提高胰腺癌的化疗敏感性，为提高胰腺癌的治疗效果提供了新的方向。
总之，作者的研究确定了 m6A 结合蛋白 IGF2BP2 在胰腺癌发病过程中调控谷氨酰胺代谢的关键作用，并强调 IGF2BP2 通过 m6A-SLC1A5-mTORC1 轴促进肿瘤进展。靶向 IGF2BP2 可能破坏这些通路，从而减缓肿瘤进展。然而，RNA 修饰普遍存在，因此靶向 m6A 机制可能会影响正常细胞过程，需要开发高选择性抑制剂。此外，m6A 修饰的作用可能因癌症类型而异，利用单细胞 RNA 测序和空间转录组学来针对特定肿瘤条件定制疗法。未来工作中，作者可以尝试在胰腺癌细胞系异种移植模型中测试 IGF2BP2 或 SLC1A5 靶向策略，然后在更大规模的中心患者队列中验证它们，以进一步探索 IGF2BP2 和 SLC1A5 作为生物标志物或治疗靶点的临床价值。此外，作者未来的研究可以探索外部因素是否调节 IGF2BP2-m6A-SLC1A5-mTORC1 轴[ 54 ]。对这篇文章的思路感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！生信分析定制服务
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