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为了探讨 AURKA 和 TRIM28 在癌症中的表达，作者使用 TIMER 数据库分析了它们的表达水平，发现在 HNSCC 数据集中，AURKA 和 TRIM28 在肿瘤组织中的表达分别高于正常组织（图 1 A 和 B）。接下来，作者使用 GEPIA 分析了 AURKA 表达与 TRIM28 表达之间的相关性。BioGRID 和 Cytoscape 数据库显示 10 个蛋白 （TRIM28、GMNN、NDN、PML、CHUK、BRCA1、XPO1、CCNE1、TRRAP 和 NCOR2） 是 AURKA 调节细胞周期转录因子 E2F4 的相关蛋白（图 1 C）。
TRIM28 在不同癌症类型的 HNSCC 癌组织中表达较高，包括 HNSCC 癌和 AURKA 正相关 TRIM28。A、B 使用 TIMER Gene_DE 模块在 TCGA 癌症类型中肿瘤组织和癌旁正常组织之间 AURKA 和 TRIM28 mRNA 表达的差异。基因表达水平的分布使用箱形图显示。C Ten 蛋白是 AURKA 调节细胞周期转录因子 E2F4 的相关蛋白
TRIM28 在 LSCC 中高表达，并与 TNM 分期相关
如图 1 所示。2 A 并显示 B TRIM28 在 LSCC 中高表达于 GEO （ GSE59102 ） 和 TCGA-LSCC 数据集中的正常组织。通过使用 GEPIA 数据库，结果表明，与正常组织相比，TRIM28 在 HNSCC 中也高表达（图 2 C）。为了进一步探究 TRIM28 与 LSCC 的相关性，UALCAN 数据库的结果表明，TRIM28 的高表达与 TNM 分期相关（图 2 D 和 E ）。
TRIM28 mRNA 表达与 LSCC 患者预后的关系。TRIM28 高表达和低表达的 Kaplan-Meier 生存曲线比较。A、B 在 GEO （ GSE59102 ） 和 TCGA-LSCC 数据集中，TRIM28 在 LSCC 组织中的表达显著高于正常组织。C TCGA 的 HNSCC 数据集中肿瘤组织与癌旁正常组织之间 TRIM28 mRNA 差异表达的 GEPIA 分析。D TRIM28 在不同 N 阶段的表达。E TRIM28 在不同肿瘤分级中的表达
代谢过程是富集 TRIM28 相关基因的最显著的 GO 生物过程
通过使用 HNSCC 中的链接组学数据库，作者发现 249 个基因与 TRIM28 呈正相关，53 个基因与 TRIM28 呈负相关（图 3 然后，作者使用 Metascape 分析了 TRIM28 和 302 相关基因的主要富集基因本体论 （GO） 生物过程。它们主要集中在代谢过程、细胞过程、对刺激的反应上（图 3 B）。在通过功能聚类分析确定的蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 网络中也看到了类似的效果（图 3 C 和 D）。
TRIM28 相关基因的 GO 和 PPI 分析。A 在 HNSCC 队列中通过 Pearson 相关性分析鉴定的与 TRIM28 高度相关的基因。B 所有 302 个基因的主要 GO 生物学过程与 TRIM28 相关。C 由功能聚类分析确定的 PPI 网络。不同的颜色代表不同的功能集群。D 由功能聚类分析确定的 PPI 网络。不同的颜色代表不同的 P 值
为了探讨 TRIM28 在促进 LSCC 转移中的作用，研究了 TRIM28 在喉肿瘤和非肿瘤组织之间的表达。qRT-PCR 结果表明，肿瘤组织中 TRIM28 的 mRNA 水平明显高于非肿瘤组织（**P < 0.01，图4 A， B ）。此外，30 个 LSCC 组织中有 22 个被归类为 TRIM28 蛋白强表达，而 8 个 LSCC 组织和 30 个相邻正常组织被归类为 TRIM28 蛋白弱表达。TRIM28 的典型免疫染色如图 4 C 所示 。此外，检测 LSCC 细胞系 （Hep2 、 TU686 、 TU212 细胞） 中 TRIM28 的 mRNA 和蛋白水平。结果表明，TU686 和 TU212 细胞中 TRIM28 的 mRNA 和蛋白水平较高，而 Hep2 细胞中则较低（图 4 D-F）。所有观察结果均表明，TRIM28 在 LSCC 组织和细胞中高表达。
TRIM28 在人 LSCC 组织和细胞中过表达。A、B 通过 qRT-PCR 定量 30 对 LSCC 组织和邻近非肿瘤喉组织中 TRIM28 mRNA 的表达。数据显示为 2 − ∆Ct （**P < 0.01）。C LSCC 组织中 TRIM28 的 IHC 染色（放大倍数：× 10）。D TRIM28 弱染色患者预后显著良性，P = 0.0056。E 通过 qRT-PCR 定量 LSCC 细胞系中 TRIM28 mRNA 的表达水平。F Western Blot 检测 LSCC 细胞系中 TRIM28 蛋白表达水平。LSCC 细胞中的 G 蛋白比率
AURKA 可能调节 LSCC 细胞中的 TRIM28
考虑到 TRIM28 与 LSCC 的发生和发展密切相关，Co-IP 测定表明 AURKA 可以与 TRIM28 相互作用。当 AURKA 的表达被敲低时，TRIM28 的表达降低（图5 C）， D 而当 TRIM28 的表达被敲低时，AURKA 的表达没有改变（图 5 E， F ），这表明 AURKA 可以调节 LSCC 细胞中的 TRIM28。
AURKA 调节 LSCC 细胞中的 TRIM28。A、BCo-IP 检测显示 AURKA 与 TRIM28 相互作用。C TU686/si-AURKA 和 TU212/si-AURKA 细胞中 AURKA 和 TRIM28 的表达降低。D 细胞中的蛋白质比例。E TRIM28 在 TU686/si-TRIM28 和 TU212/si-TRIM28 细胞中的表达降低。F 细胞中的蛋白质比例
TRIM28 促进 AURKA 诱导的休眠激活效应
为了进一步研究 TRIM28 在恢复休眠 LSCC 细胞中发挥的重要作用，进行了生物细胞学实验。结果显示，与对照组相比，TU686/si-TRIM28 和 TU212/si-TRIM28 细胞具有较低的增殖能力（TU686/si-NC 和 TU212/si-NC 细胞，*P < 0.05，**P < 0.01，图 1 所示。6 A， B ）。此外，集落形成测定结果显示，TU686/si-NC （401 ± 55.5） 和 TU212/si-NC 细胞 （677 ± 110.0） 的集落数量多于 TU686/si-TRIM28 （156 ± 46.5） 和 TU212/si-TRIM28 细胞 （285 ± 56.0，*P < 0.05，图 6 C， D ）。由于流式细胞术显示 TU686/si-TRIM28 和 TU212/si-TRIM28 细胞中 G0/G1 细胞的百分比显着升高（*P < 0.05，图 6 E， F ）。 如图 6 G 和 H 所示，与休眠相关的蛋白质也发生了改变。E2F4 和 P130 的表达显著增加，P107 的表达在 TU686/si-nc 和 TU212/si-nc 细胞中明显降低。最后，Co-IP 测定表明 E2F4-P130 复合物在静止细胞中独特，在 TU686/si-TRIM28 细胞 （FGI i 6 中） J 表达。所有结果表明，TRIM28 可能促进 LSCC 中 AURKA 诱导的休眠激活效应。
TRIM28 促进 AURKA 诱导的休眠激活效应。A、B 敲低 TRIM28 降低了 TU686 和 TU212 细胞的细胞增殖 （*P < 0.05， **P < 0.01）。C、D 敲低 TRIM28 诱导 TU686 和 TU212 细胞的克隆形成 （*P < 0.05）。E、FTU686/si-TRIM28 和 TU212/si-TRIM28 细胞中 G0/G1 细胞的百分比显著升高 （*P < 0.05）。G Western Blot 检测休眠相关蛋白。TU686/si-TRIM28 和 TU212/si-TRIM28 细胞中 E2F4 和 P130 的表达升高，E2F4 和 P130 的表达降低。H 细胞中的蛋白质比率。 我、JCo-IP 检测 E2F4-P130 复合物
此外，通过尾静脉注射将细胞接种到裸鼠体内。接种 4 周后，与 TU686/si-nc 细胞 （4 ± 1.5） 和 TU212/si-nc 细胞 （4 ± 1.7，*P < 0.05，图 4 相比，TRIM28 表达较低的 TU686/si-TRIM28 （1.0 ± 1.0）、TU212/si-TRIM28 细胞 （0.7 ± 0.6） 表现出较少的肺转移频率。7 A-D）。以上观察均表明，TRIM28 促进了裸鼠 LSCC 的转移。
TRIM28 诱导裸鼠 LSCC 的转移。A、C 将 TU686/si-TRIM28、TU212/si-TRIM28、TU686/si-nc 和 TU212/si-nc 细胞接种到裸鼠体内，28 天后观察肺结节 （N = 5/组）。肺结节的 H&E 染色 （100 ×）。B、D 通过 TU686/si-TRIM28、TU212/si-TRIM28、TU686/si-nc 和 TU212/si-nc 细胞的 H&E 染色定量肺组织和结节 （*P < 0.05）
在 LSCC 中，AURKA 诱导的休眠激活效应是通过激活 Akt 信号通路介导的
AKT 信号通路在癌症的迁移和侵袭中起着至关重要的作用 [7 – 11 ]。作者认为 TRIM28 可能介导 AKT 信号通路以促进 LSCC 转移。为了更好地说明 AKT 在 LSCC 中的重要作用，使用 AKT 抑制剂特瑞瑞滨 [ 12 ] 处理 TU686 和 TU212 细胞 （TU686/特瑞瑞滨和 TU212/特瑞瑞滨细胞）。如图 5 A 和 B 所示，TRIM28 和 p-AKT 水平较低，TU686/si-TRIM28 和 TU212/si-TRIM28 细胞中的 AKT 水平没有改变。TU686/Triciribine 和 TU212/Triciribine 细胞中 p-AKT 水平较低，而 TRIM28 和 AKT 水平没有变化，这表明 Akt 是 TRIM28 的下游分子（图 8 C、 D ）。
Akt 信号通路在 LSCC 中 AURKA 诱导的休眠激活作用中起重要作用。A TU686/si-TRIM28 和 TU212/si-TRIM28 细胞中 TRIM28 和 p-Akt 的表达降低，Akt 的表达未改变。B 细胞中的蛋白质比例。C TU686/Triciribine 和 TU212/Triciribine 细胞中 p-Akt 的表达降低，TRIM28 和 Akt 的表达未改变。D 细胞中的蛋白质比例
Akt 表达的下调可减少 LSCC 细胞增殖、迁移和侵袭
此外，进行生物细胞学实验以进一步确定 AKT 在 LSCC 转移中的作用。结果显示，与对照组相比，TU686/特瑞瑞立滨和 TU212/特瑞瑞滨细胞增殖较低（TU686/亲本和 TU212/亲本细胞，*P < 0.05，**P < 0.01，图 3。9 在伤口愈合试验中，与 TU686/亲本细胞和 TU212/亲本细胞相比，TU686/特瑞瑞滨和 TU212/特瑞瑞滨细胞在 48 小时时运动能力较低（*P < 0.05，图 9 B）。此外，集落形成测定的结果显示，TU686/特瑞瑞滨 （459 ± 84.5） 和 TU212/特瑞瑞滨细胞 （453 ± 77.7） 的菌落数量少于 TU686/亲本 （758 ± 111.6） 和 TU212/亲代细胞 （861 ± 114.3，*P < 0.05，**P < 0.01，图 9 C， D ）。此外，与 TU686/亲本 （123 ± 8.5） 和 TU212/亲本细胞 （85 ± 9.3） 相比，通过 transwell 腔室迁移的 TU686/曲西立滨 （78 ± 11.0） 和 TU212/曲立滨细胞 （45 ± 10.5） 通过 transwell 室迁移的频率低于 TU686/亲本 （86 ± 7.6） 和 TU212/亲本细胞 （52 ± 11.8）、 TU686/曲瑞立滨 （52 ± 4.2） 和 TU212/曲瑞立滨细胞 （24 ± 6.7） *P < 0.05，**P < 0.01，图 9 E-H）。所有结果表明，AKT 信号通路可能促进 TRIM28 诱导的休眠激活效应。
Akt 表达的下调可降低 LSCC 细胞增殖、迁移和侵袭。A 敲低 Akt 降低了细胞增殖 （*P < 0.05， **P < 0.01）。B Akt 的敲低减少了细胞运动 （*P < 0.05）。C、DAkt 的敲低诱导了 TU686 和 TU212 细胞的克隆形成 （*P < 0.05）。E-H 敲低 Akt 诱导 TU686 和 TU212 细胞的迁移和侵袭能力 （*P < 0.05， **P < 0.01）
总结
综上所述，AURKA 介导 TRIM28 通过 Akt 信号通路复活休眠的 LSCC 细胞，促进 LSCC 转移，靶向 AURKA 和 TRIM28 可能为 LSCC 提供潜在的治疗策略。
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