|
3.1. 靶向 miR-21 和 miR-373 的 ASOs 的优化和选择
根据 OligoWalk 服务器（Table 3 ）提供的 ASO 评分和热力学数据，分别鉴定出 AUCUCAUGGCAACACCAGU 和 AAGUGCUUCGAUUUUGGGG 作为靶向 miR-21 和 miR-373 的最佳 ASOs。
3.2. 识别和选择与 miR-21 和 miR-373 相关的基因
使用 miRDB 服务器，为每个 miRNA 生成了一个相关基因列表（Supplementary Table 1 ）。最终，STK38L 和 PCDH19 被选择用于 hsa-miR-21–3p，而 YOD1 和 PRDM11 被选择用于 hsa-miR-21–5p。对于 hsa-miR-373–3p，选择了 CROT 和 LATS2，而 ZNF845 和 ZC3H6 被选择用于 hsa-miR-373–5p。
3.3. 对比分析不同研究组中 miR-21、miR-373 及相关基因的表达水平
Fig. 1 图 A 和图 B 分别显示了不同研究组中 miR-21 和 miR-373 的表达水平。与其它组相比，暴露于 NL-ASOmiR-21 或 NL-ASOmiR-373 的 HTB-9 细胞中 miR-21 和 miR-373 的表达水平显著降低。然而，暴露于 NL-ASOmiR-21+ASOmiR-373 的 HTB-9 细胞中，miR-21 和 miR-373 的表达水平进一步降低。
不同研究组中 miR-21（A）和 miR-373（B）的表达水平。与其它组相比，暴露于 NL + ASOmiR-21 或 NL + ASOmiR-373 的 HTB-9 细胞中 miR-21 和 miR-373 的表达水平显著降低。然而，同时暴露于 NL + ASOmiR-21 和 ASOmiR-21 的 HTB-9 细胞中 miR-21 和 miR-373 的水平下降更为明显。×表示与对照组（ASOmiR-21、ASOmiR-373、ASOmiR-21+ASOmiR-373、NL 和 Scramble）相比存在显著差异（p < 0.05），n = 3。
Fig. 2 A、B、2C 和 2D 分别展示了不同研究组中 STK38L、PCDH19、YOD1 和 PRDM11 的表达水平。同样， Fig. 3 a、b、3c 和 3d 描绘了不同研究组中 CROT、LATS2、ZNF845 和 ZC3H6 的表达水平。结果表明，与其它组相比，暴露于 NL + ASOmiR-21 或 NL + ASOmiR-373 的 HTB-9 细胞中所有基因的表达水平显著降低。此外，暴露于 NL + ASOmiR-21 和 ASOmiR-21 的 HTB-9 细胞中基因表达水平下降幅度更大，与其他组相比更为明显。
使用 qRT-PCR 方法测量了不同研究组中 STK38L（A）、PCDH19（B）、YOD1（C）和 PRDM11（D）的表达水平。结果清楚地显示，与其它组相比，暴露于 NL + ASOmiR-21 或 NL + ASOmiR-373 的 HTB-9 细胞中所有基因的表达水平显著降低。此外，同时暴露于 NL + ASOmiR-21 和 ASOmiR-21 的 HTB-9 细胞中基因表达下降更为明显。×表示与对照组 ASOmiR-21、ASOmiR-373、ASOmiR-21+ASOmiR-373、NL 和 Scramble 相比存在显著差异（p < 0.05），n = 3。
使用 qRT-PCR 方法测量了不同研究组中 CROT（A）、LATS2（B）、ZNF845（C）和 ZC3H6（D）的表达水平。结果表明，与其它组相比，暴露于 NL + ASOmiR-21 或 NL + ASOmiR-373 的 HTB-9 细胞中所有基因的表达水平显著降低。此外，同时暴露于 NL + ASOmiR-21 和 ASOmiR-21 的 HTB-9 细胞中基因表达下降更为明显。×表示与对照组 ASOmiR-21、ASOmiR-373、ASOmiR-21+ASOmiR-373、NL 和 Scramble 相比存在显著差异（p < 0.05），n = 3。
Fig. 4 和 Supplementary Fig. 1 展示了使用 Western Blotting 方法评估的不同研究组中 STK38L、PCDH19、YOD1、PRDM11、CROT、LATS2、ZNF845 和 ZC3H6 的表达水平。该实验证实了 qRT-PCR 数据。在 G1 组（NL + ASOmiR-21）、G2 组（NL + ASOmiR-373）和 G3 组（NL + ASOmiR-21+ASOmiR-373）中观察到所有基因的表达水平下降。然而，在其他组（G4-G8）中未观察到基因表达的变化，这些组包括 G4（ASOmiR-21）、G5（ASOmiR-373）、G6（ASOmiR-21+ASOmiR-373）、G7（NL）和 G8（PBS）。
使用 Western Blotting 方法评估了不同研究组中 STK38L、PCDH19、YOD1、PRDM11、CROT、LATS2、ZNF845 和 ZC3H6 的表达水平。该实验证实了 qRT-PCR 数据。在 G1 组（NL + ASOmiR-21）、G2 组（NL + ASOmiR-373）和 G3 组（NL + ASOmiR-21+ASOmiR-373）中观察到所有基因表达水平下降。然而，在其他组（G4-G8）中未观察到基因表达变化，这些组包括 G4 组（ASOmiR-21）、G5 组（ASOmiR-373）、G6 组（ASOmiR-21+ASOmiR-373）、G7 组（NL）和 G8 组（Scramble）。STK38L、PCDH19、YOD1、PRDM11、CROT、LATS2、ZNF845、ZC3H6 和 GAPDH 相应条带的分子量（MW）分别为 7388、126253、33384、57863、70263、113519、113133、131670 和 36290 Da。
Table 4 展示了 ASOs 和 NLs 的表征数据。合成的 ASOs 尺寸范围为 10–54 nm，平均尺寸小于 30 nm。所有 ASOs 的 zeta 电位在+7 到+9 mV 之间。合成的 NLs 尺寸范围为 100–265 nm，平均尺寸小于 200 nm，zeta 电位为+30 到+32 mV。 Fig. 5 显示了合成的 NLs 的 TEM 图像，展示了尺寸小于 200 nm 的均匀球形形状。
合成 NL 的 TEM 图像。图像显示尺寸小于 200 nm 的均匀球形形态。
总结
综上所述，作者发现暴露于纳米脂质体 ASOmiR-21 或纳米脂质体 ASOmiR-373 的 HTB-9 细胞中，miR-21 和 miR-373 的表达水平显著降低。重要的是，同时暴露于两种纳米脂质体 ASOs（NL-ASOmiR-21 和 ASOmiR-373）的 HTB-9 细胞中，miR-21 和 miR-373 的表达水平降低更显著。此外，作者在所有实验设计中均观察到 STK38L、PCDH19、YOD1、PRDM11、CROT、LATS2、ZNF845、ZC3H6 的低表达。这些发现突出了 miR-21 和 miR-373 在膀胱癌（BC）中的关键作用，并展示了它们抑制如何改变基因网络的表达谱。因此，可以得出结论，使用 miRNA 及其 ASOs 的合理设计的递送系统，可能是控制基因网络表达的一种有效方法。。
|
