第一节  免疫金技术发展史

1939年Kausche and Ruska把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子显微镜下观察金离子呈高电子密度。然而胶体金技术作为标记物应用于免疫组织化学研究是在1971年，Faulk和Taylor首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。此后，他们还把胶体金与胶原血清，植物血凝素，卵白蛋白，人免疫球蛋白轻链、牛血清白蛋白结合应用。

1974年Romano和他的同事们将胶体金标记在马抗人的IgG上，实现了间接免疫金染色法。1974年Bauer等报道凝集素–金复合物的应用。1978年Geoghegan等应用免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原。1981年Danscher建立了银显影液增强光镜下金颗粒可见性的免疫金银染色法（immuno­gold-sliver
staining，IGSS）。到了1986年Fritz等人在免疫金银法基础上成功地进行了彩色免疫金银染色，使得结果更加鲜艳夺目。胶体金技术逐渐地得到完善和成熟，得到了迅速发展和广泛应用。应用胶体金为标记物的免疫金染色（IGS）与免疫金银染色（IGSS）方法在光镜和电镜下可以单标记和双标记或多种标记，观察细胞和组织结构，可以定性，定位以至定量研究。目前它已被应用于医学和生物学研究的众多领域。

 

第二节  溶胶的基本概念

一、胶体金

胶体金即金的水溶液，它也具有一般溶胶的特性。分散体系的分类：体系是一定空间范围内作为我们研究对象的物质，某一种或几种物质分散到另一种物质中所组成的体系叫做分散体系。被分散的物质叫做分散相（或分散质），而另一种物质叫做分散介质。分散体系的某些性质因分散相质点的大小而改变，因此，按分散相质点的大小不同，可将分散体系分为三类。

（一）离子分散体系

离子分散体系指分散相以小分子或离子状态分散着。这种溶液具有高度稳定性，无论放置多久，分散相颗粒都不会因重力而下沉，不会从溶液中分离出来。

（二）胶体分散体系

胶体分散体系是指分散相颗粒在1~10纳米（nm）之间的分散体系叫做胶体分散体系。胶体溶液外观透明不浑浊，在普通显微镜下看不见它的分散相粒子，不易受重力影响与分散介质分离沉降，但其中的溶胶粒子有聚结变大的倾向，即具有聚结不稳定性。

（三）粗分散体系

分散相颗粒是由许多分子组成，因粒子较大，用肉眼或显微镜即可看见，不稳定，极易因重力而自动沉降，外观浑浊不透明。

二、胶体金的一般性状

（一）胶体金的颜色

溶胶的颜色决定于分散相物质的颜色、分散相物质的散度和入射光线的种类，是散射光还是透射光，粒子越小，分散度越高，则散射光的波长越短。对同一种物质的水溶胶来说，粒子大小不同，颜色亦不同，胶体金颗粒在5~20纳米（nm）之间，吸收波长520纳米，呈葡萄酒红色，20~40纳米之间吸收波长530纳米，液体为深红色，60纳米的金溶液主要吸收波长600纳米为橙黄色光，金溶液呈蓝紫色，若离心去掉较大的金颗粒，溶胶呈红色。

（二）胶体金的稳定性

溶胶的稳定性介于小分子离子溶液和粗分散系之间，溶胶的胶颗粒作布朗运动，不易受重力影响而下沉。然而溶胶又是不稳定体系，它的胶粒溶剂化作用很弱，总表面积较大，当胶粒相互碰撞时，有自动合并为较大、较重的颗粒倾向。胶体颗粒变大以致超出胶体范围而从介质中沉淀出来的现象叫聚沉。影响溶胶稳定性的主要原因有三点：①胶粒间的相互吸引力。当胶粒相距很近时，这种吸引力可能导致胶粒合并变大。②胶粒及其溶剂化层（溶剂是水就是水化层）的带电情况。一种溶胶的各个胶粒都带有相同的电荷。同性电荷相斥，双电层厚，胶粒带电量愈大，排斥力愈大，愈能阻止胶粒合并聚结，溶胶愈稳定。③胶体界面的溶剂膜。当二固体间夹有一厚层液体时，这层液体膜有一个反抗二固体接近的排斥力。两个胶粒要进一步接近，只有克服它们之间的溶剂化膜的斥力才有可能，因此溶剂膜的斥力是使溶胶稳定的原因之一。

（三）溶胶的聚沉现象

胶粒之间存在吸引力与排斥力这对矛盾，在溶胶胶粒带电及溶剂化的情况下，排斥力成为矛盾的主要方面，溶胶稳定而不聚沉。因为某种原因使溶胶粒带电量减到很小甚至中和其所带电荷并能去溶剂化膜，胶粒之间可在更近的距离互相接近，引力成为主要矛盾，引力超过斥力时胶粒便聚结发生聚沉。引起溶胶聚沉的原因有：

1.少量电解质对溶胶的聚沉作用

少量电解质即可使溶胶聚沉，但各种电解质的聚沉能力可用聚沉值来表示，聚沉值是在一定时间内使一升某浓度的溶胶产生聚沉所需电解质的最小亳克分子数。显然，聚沉值愈小，聚沉能力愈大，聚沉值从实验中得出如下的价规则：①电解质负离子对带正电的溶胶起主要聚沉作用，正离子对带负电的溶胶起主要聚沉作用。②同价离子聚沉能力几乎相等，不同价离子的聚沉能力随离子价增加而显著增加。电解质为什么能使溶胶聚沉呢？这是由于电解质与胶粒带相反电荷的离子的作用，中和了胶粒所带的一部分电荷，使胶粒电量减少，扩散层缩小，溶剂化层变薄，而当双电层厚度缩至很小和溶剂化层变得很薄时，两个胶粒间便可以更加接近即不产生斥力，两个胶粒间因引力加大而合并的趋势增强，甚至引力占绝对优势以致使胶粒聚结而发生聚沉。胶粒的双电层结构见图1。

图1 胶粒的双电子层结构示意图

2.温度对溶胶稳定性的影响

一般影响不大，当温度升高时，吸附能力减弱，溶剂化程度降低，溶剂化层变薄，胶粒聚结，不稳定性增加。

3.浓度对溶胶的稳定性的影响

浓度增大时，粒子间距离缩小，引力增加，容易聚结而发生聚沉，所以制备比较稳定的溶胶，要有一定的合适浓度。

 

第三节  胶体金的制备方法

 胶体金溶液的制备有许多种方法，其中最常用的是化学还原法，基本的原理是向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子。目前常用的还原剂有：白鳞、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等。下面分别介绍制备不同大小颗粒的胶体金溶液。

一、制备胶体金的准备

（一）玻璃器皿的清洁

制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。如果玻璃器皿内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成，形成的颗粒大小不一，颜色微红、无色或混浊不透明。我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流水冲洗干净，加入清洁液（重铬酸钾1000克，加入浓硫酸2500毫升，加蒸馏水至10000毫升）浸泡24小时，自来水洗净清洁液，然后每个玻璃器皿用洗洁剂洗3~4次，自来水冲洗掉洗洁剂，用蒸馏水洗3~4次，再用双蒸水把每个器皿洗3~4次，烤箱干燥后备用。通过此方法的处理玻璃器皿不需要硅化处理，而直接制备胶体金。也可用已经制备的胶体金溶液，用同等大小颗粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后弃去，再用双蒸水洗净，即可使用，这样效果更好，因为减少了金颗粒的吸附作用。

（二）试剂的配制要求

（1）所有配制试剂的容器均按以上要求酸处理洗净，配制试剂用双蒸水或三蒸水。

（2）氯化金（HAuCl4）水溶液配制：将氯化金1克一次溶解于双蒸水中配成1％的水溶液。放在4℃冰箱内保存长达几个月至1年左右，仍保持稳定。

（3）白磷或黄磷乙醚溶液的配制：白磷在空气中易燃烧，要格外小心操作。把白磷在双蒸水中切成小块，放在滤纸上吸干水份后，迅速放入已准备好的乙醚中去，轻轻摇动，等完全溶解后即得到饱和溶液。储藏于棕色密闭瓶内，放在阴凉处保存。

二、制备胶体金的方法和步骤

（一）白磷还原法

1.白磷还原法（Z.Sigmondy，1905）

（l）取1％的HAuCl4水溶液1毫升，加双蒸水99毫升配成0.01％的HAuCl4水溶液。

（2）用0.2mol/LK2CO3调pH至7.2。

（3）加热煮沸腾，迅速加入白磷饱和乙醚溶液0.5毫升，振荡数分钟至溶液呈现橙红色时即成。胶体金的颗粒直径为3纳米（nm）左右，大小较均匀。

2.白磷还原法（Z Sigmondy，1905;Z.Sigmondy Thiessen，1925）

（1）取0.6％的HAuCl4水溶液2.5毫升，加双蒸水120毫升。

（2）用0.2mol/LK2CO3,调pH至中性。

（3）加入⅕饱和度的白磷乙醚溶液1毫升（l份白磷4份乙醚），在室温振荡约15分钟，溶液呈红褐色，再加热至典型的葡萄酒红色，加热可使乙醚蒸发，胶体金液体内过量的白磷通入空气后被氧化，此方法获得胶体金颗粒的直径在5~12纳米之间。

3.白磷还原法的改良法（Henegouwen，1986）

（1）取20％饱和度白磷乙酪溶液0.5毫升，加双蒸水60毫升。

（2）用1％的HAuCl4水溶液0.75毫升，加0.1mol/LK2CO30.6毫升，振荡变成棕色。

（3）加热煮沸，至溶液变成透明红色。

使用上述方法增加还原次数使金颗粒直径不断增大，二者之间的关系见表1。

表1 胶体金颗粒大小与还原次数之间的关系

此方法主要优点是简化了制备不同大小颗粒胶体金的手续和其它试剂的配制，经济、操作简单。另外，在多次还原过程中氯化金不再形成新的金颗粒，只是在原先金粒子基础上使它的直径变大。第一次金颗粒起着“晶核”的作用，由于这一特点，制备的金颗粒相对均匀一致。

（二）抗坏血酸还原法（Stathis和Fabrikanos，1958）

（1）将在4℃预冷的1% HAuCl4（四氯金酸）水溶液1毫升，0.2mol/LK2CO31.5毫升、25毫升双蒸水混匀。

（2）在搅拌下加入1毫升0.7％抗坏血酸水溶液，立即呈现紫红色。

（3）加双蒸水至100毫升，加热至溶液变为透明红色为止。胶体金颗粒直径为8~13纳米（nm）。

（三）柠檬酸三钠还原法（Frens，1973）

此方法是由Frans在1973年创立的。

制备程序很简单，胶体金的颗粒大小较一致，广为采用。该法一般先将0.01％的HAuCl4溶液加热至沸腾，迅速加入一定量1％柠檬酸三钠水溶液，开始有些蓝色，然后浅蓝，蓝色，再加热出现红色，煮沸7~10分钟出现透明的橙红色。各种颗粒胶体金制备详见表2。

表-2 柠檬酸三钠用量与胶体金颗粒直径的关系

按照Frens法还可以制备其它不同大小颗粒的胶体金出来。许多研究证明用该法制备胶体金时金颗粒的大小是柠檬酸三钠用量的函数，基本的规律是柠檬酸三钠用量多，胶体金颗粒直径小，柠檬酸三钠用量越少，胶体金颗粒直径越大。

（四）鞣酸柠檬酸三钠还原法（Slot与Gueeze， 1985年）

该法是以1982年Muhplfordt法为基础，1985年Slot与Geuze对该法进行了改良，特点是通过改变鞣酸的用量制备出多种颗粒直径的胶体金，而且颗粒的直径均匀一致，很适合于双标及多标研究。制备3nm（nm）、5nm、10纳米、15nm的胶体金颗粒见表3。

表3 鞣酸–柠檬酸三钠还原法

操作步骤：

（1）根据所需要的胶体金颗粒分别配制A液和B液。

（2）将配制好的A、B两液在水浴锅内加热到60℃，并通过控温装置使温度保持稳定。

（3）在电磁搅拌A液迅速加人B液，继续加热直至胶体金变成葡萄酒色，时间大约7~10分钟。在A、B两液混合后可见溶液立即变成蓝色，大约1~3分钟就变成红色。

用鞣酸柠檬酸三钠还原法，柠檬酸三钠主要为还原剂，而鞣酸则有双重作用，一是还原作用，二是保护作用，控制“晶核”的形成过程，也就是说鞣酸的用量多少决定胶体金颗粒的大小形成，因此，改变鞣酸的用量就可改变胶体金的颗粒大小，达到制备不同直径颗粒的胶体金之目的。

（五）乙醇超声波还原法（Baigent和Müller，1980）

（1）1%
HAuC4水溶液0.2毫升加入双蒸水100毫升。

（2）用0.2mol/LK2CO3调pH至中性，再加入1毫升乙醇。

（3）用20KC、135W超声波探头浸入溶液内进行超声振荡，由此法制得的胶体金颗粒为6~10纳米。

（六）礁氢化钠还原法（Tschopp等，1982）

（1）将预冷在4℃的40毫升双蒸水中加入0.6毫升 1％的HAuCLi。

（2）再加入0.2mol/LK2CO30.2毫升。

（3）在搅拌下，迅速加入新鲜配制的硼氢化钠水溶液（0.5克/毫升）0.4毫升，一般重复加入3~5次，直至溶液的蓝紫色变为橙红色为止。然后再搅拌5分钟，获得的金颗粒直径在2~5纳米之间。

（七）放射性胶体金的制备方法（Kent和Allen，1981）

（l）取0.01%
HAuCl4水溶液100毫升，加热至沸腾。

（2）加入40微升195Au。

（3）迅速加入1％柠檬酸三钠水溶液4毫升，5~7分钟出现透明的橙红色。

（4）其含量为1×106脉冲数／分钟。

 

第四节  胶体金的质量鉴定

胶体金制备完毕后须经电镜下质量鉴定才能应用。

一、胶体金颗粒直径测定

用预先处理好的覆有Formvar膜的镜网浸入胶体金溶液内，取出放在空气中干燥或37℃内烤干。然后在透射电镜下观察，主要观察金颗粒的大小，符合不符合所需要的颗粒直径，金颗粒是否均匀一致，有无椭圆形及多角形金颗粒存在。理想的金颗粒是大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在，还可以拍片放大后测量金颗粒直径的大小。

二、胶体金颗粒均匀度测定

一般需测量100个以上的胶体金颗粒，然后用统计学处理，计算胶体金颗粒的平均直径及标准差，前者反映颗粒的大小，后者说明颗粒是否均匀一致。

三、影响胶体金颗粒大小的因素

如果有较多大小不等的金颗粒及有椭圆形，三角形金颗粒存在应重新制备。一般造成这种情况的主要原因是在加还原剂的时候不是迅速一次加入，而是多次加入。再者搅拌不均匀，速度太慢没有搅拌起来，造成了颗粒大小不等。制备量的多少，容器的大小，加热的时间等也影响胶体金颗粒大小。制备了合格的胶体金以后，放在室温或4℃保存。避免低温冻存，因为冻存可导致胶体金凝集，破坏了胶体状态。胶体金在室温避光无灰尘的环境中可放置3个月左右。冰箱内半年左右。根据胶体金的性质，有不稳定和聚沉的可能性，因此，制备完毕后最好在20天以内进行标记。

第五节  胶体金标记蛋白质的准备

胶体金标记蛋白质的原理，一般认为是由于pH值等于或稍偏碱的蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，较易吸附于金属颗粒的表面，由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态，如果pH低于蛋白质等电点，蛋白质带负电荷，与金属颗粒的负电荷相互排斥而不能相互结合。为防止蛋白质与胶体金的聚合与沉淀，常用牛血清白蛋白，卵白蛋白，聚乙二醇或明胶作稳定剂。用Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖S-400）层析分离纯化胶体金蛋白标记物只适用于以BSA作稳定剂者。

一、待标记蛋白质的准备

（一）透析除盐

蛋白质溶液内应除去多余的电解质，不然过高的盐类物质会降低胶体金颗粒的Zeta电位，影响蛋白质的吸附，因此，标记之前必须彻底除盐。一般将蛋白质置入透析袋中然后直接放入双蒸水或极低浓度的盐水（0.005mol/LNaCl，pH7.0）透析。

（二）去除蛋白沉淀

长期低温保存的蛋白质或4℃较长时间保存的抗体，特别是在浓度高于2毫克/毫升的情况下，很容易形成聚合物，聚合物对标记过程及免疫金探针的稳定性有一定影响，因此，标记之前须离心以除去这些聚合物。一般以l000rpm 4℃离心15w分钟取上清液，调整蛋白质浓度至1毫克/毫升即可用于标记。

二、胶体金pH值的调整

胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点（PI）略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。需要提高胶体金的pH值时可用0.1mol/LK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般精密的pH试纸测定其pH即可。

儿种常用的蛋白质标记时胶体金所用的pH值见表4。

表4 常用几种蛋白质标记时胶体金所用的pH值

 

蛋白质

pH

蛋白质

pH

抗体

9.0

类卵粘蛋白

4.8

亲和层析的IgG

7.6

血浆锅蓝蛋白

7.0

单克隆抗体

8.2

α–胎球蛋白

6.5

F（ab’）z

7.2

小牛血清白蛋白

6.5

SPA

6.0

牛血清球白蛋白结合肽

4.5

笢麻子植物凝血素I

8.0

牛血清白蛋白结合胰岛素

5.3

葩麻子植物凝血素II

8.0

霍乱毒素

6.9

花生凝集素

6.3

破伤风毒素

6.9

Helix pomatia lectin

7.4

DNAase

6.0

大豆凝集素

6.1

RNAase

9.0

Lens culinaris lectin

6.9

低密度脂蛋白

5.5

Lotus tetragonolobus lectin

6.3

a2–巨球蛋白

6.0

荆豆凝素

6.3

抗生物素蛋白（亲和素）

10.0

Bandeirae simplici folia lectin

6.2

链霉抗生物素蛋白

6.6

 

过氧化物酶

8.0

麦胚凝集素

9.9

 

三、待标记蛋白质最适稳定的测定

（一）光电比色法

制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（1毫升），分别加入5毫升胶体金中，迅速混匀，然后，各加入10% NaCl溶液1毫升，摇匀，静置5分钟后测各管。根据胶体金颗粒的大小，OD在520~580纳米（nm）之间测定，以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。图2中10纳米（nm）的胶体金溶液中蛋白质的最适稳定量为45微克/微升 l毫升。

图2 蛋白最适稳定量示意图

（二）目测法

以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例，将标记的蛋白质逐渐稀释后（由5~45微克另设对照管），各取等体积顺序加入一系列装有1毫升胶体金的试管中，5分钟后，在上述各管内分别加入10％氯化钠0.1毫升，依表25-5顺序进行。

表5 具体的做法是按表内进行

1.当分别加入0.1毫升10％氯化钠后，混匀静置2小时以上观察结果。

2.没有加入蛋白质的管为对照管。

3.小于5纳米颗粒的胶体金溶液，每个管内应加入33％双氧水5微升，否则有不变蓝色及聚沉现象。未加蛋白及加入蛋白量不足以稳定胶体金的试管，即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加人蛋白最达到或超过最低稳定量的试管则胶体金的红颜色不变。其中含蛋白量最低的试管即含稳定1毫升胶体金的必须蛋白最。在此基础上再加上20％即为稳定所需蛋白质的实际用量。

四、蛋白质的胶体金标记

当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳pH值被确定以后便可进行标记。具体步骤如下：

1.根据用以标记的胶体金的总鼠计算出所需要的待标记蛋白质的总量。

2.在电磁搅拌下，将蛋自质溶液加入胶体金溶液中（pH已惆至PI超过0.5），加入蛋白质时应逐渐加入，蛋白质1毫克大约5分钟加完。

3.在磁性搅拌下加入5％牛血清白蛋白（BSA）使其终浓度为1%，或加入3％聚乙二醇（PEG MW20000）使其终浓度为0.05%，我们对比了BSA和PEG稳定胶体金的效果，BSA稳定的标记胶休金，放在4℃达2年半仍然保持良好性能，而用PEG稳定的标记胶体金放在4℃ 1年左右就有分层现象，而且染色效果显著下降。因此，我们认为最好还是用BSA作稳定剂。

4.将标记好的胶体金装入透析袋中，两头扎紧，放入蔗糖或硅胶中浓缩，浓缩到原体积的1/10量，浓缩完毕后纯化。离心纯化时，不要浓缩。 

五、胶体金标记蛋白质的纯化

标记好的免疫金探针必须经过纯化处理后才能用于细胞化学染色。纯化的目的是除去其中未标记的蛋白质，未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。

（一）高速与超速离心法

1.将标记的大于10纳米的胶体金溶液选用1500rpm 4℃离心15分钟，吸出上清，弃去沉淀．以去除大的聚合物。

2.一般在10纳米（nm）以上所标记的胶体金均可在高速离心机上离心，小于10纳米颗粒的胶体金用超速离心机离心，在4℃离心1小时左右，弃上清，将沉淀以原体积的0.02mol/LTBS
pH8.2（内含1% BSA，0.05％叠氮钠）溶解，重复离心2~3次，沉淀溶于原体积的1/10 TBS中。4℃保存备用。为了得到颗粒均匀一致的免疫金试剂，上述粗提制剂可用10～30％蔗糖或甘油溶液作密度梯度离心，分带收集不同大小颗粒的胶体金标记蛋白制剂。

几种免疫金探针离心所用转速（表6），离心纯化时所用转速见表7，胶体金的OD值见表8。

表6 几种免疫金探针离心时所用转速参考表

表7 几种免疫金探针离心纯化时所用的转速

表8 不同大小胶体金的OD值胶体颗粒大上（nm）0.D （520）纳米（nm）

将纯化好的胶体金用0.2mol/LTBS缓冲液作1:20稀释，用520纳米（nm）测OD值。

（二）凝胶过滤法

纯化免疫金探针的最好方法，其特点简便，过滤的胶体金颗粒比较均匀，不容易凝集，而离心方法转速高，时间长，胶体金颗粒沉淀容易凝集，用凝胶过滤克服了这一弱点。选用本方法时胶体金溶液必须用牛血清白蛋白作稳定剂。具体操作过程如下：

1.将浓缩好的胶体金以1500 rpm离心去掉大的聚合物。吸出上清待过柱。

2.柱高34厘米，直径1厘米，加样体积为柱床体积的1/10。

3.丙烯葡聚糖S-400（Sephacryls-400，Pharmacia，Sweden）装柱后用0.02mol/LpH8.2 TBS平衡层析柱（pH7.4者用于标记的SPA），平衡好后，吸取上清胶体金液体加入层析柱内，加样时请注意不要破坏S-400的界面。

4.用0.02mol/LpH8.2 TBS洗脱，先行滤出的液体有少量微黄不透亮的液体，紧接着是浓度高红色而透亮的胶体金，注意颜色的变化，如红色变淡，变黄立刻停止收集。如Sephacryl-S-400没有，也可以用Sepharose-4B或6B代替（Pharmacia，Sweden）也能收到较好的效果。

六、免疫金探针的鉴定

1.用有Formvar膜的锦网沾取金标蛋白溶液，空气中干燥后醋酸铀负染，在TEM下观察，可见金颗粒周围有一明显的空晕，表示颗粒表面吸附着蛋白质分子。

2.纯化后免疫探针是否保持很好的生物学活性是判断其质量好坏的主要指标，因此，在使用之前必须对它的特异性，敏感性进行鉴定。鉴定举例，用阳性抗原片，脱蜡至水，胰蛋白酶消化，加第一抗体（多克隆或单克隆），一般过夜，加标记同一抗特异性结合的胶体金溶液（多克隆或单克隆抗体标记的胶体金），一般做1:2，1:4，1:5，1:16，稀释SPA-金，做1:10，1:20，1:40，1:80稀释，37℃ 45分钟，冲洗，显色，观察结果，染色效价以阳性结果明确，背景浅的稀释度为标准。免疫细胞化学染色试验可以较全面地反应免疫金探针的质量。

 

第六节  免疫胶体金银细胞化学染色的固定剂选择

 免疫胶体金银染色和其它免疫细胞化学方法一样，要想得到好的染色效果，关键取决于标本处理是否合适，只有使抗原性及组织结构保存的好，才能使以后的染色成功成为可能，其次要有高特异性和高效价的一抗，选择合适的稀释度。由于免疫组化方法广泛应用于不同的生物学科，所要检出的抗原种类繁多，性质也各不相同，因此，不可能有一种适用于所有抗原的固定剂，而要根据不同的抗原性质区别对待。根据我们使用的固定剂介绍如下，供参考。

一、固定剂的选择及固定时间

详见表9。

表9 待检抗原、固定剂各类及固定时间

1.Karovsky液pH7.3。

2.PLP液（periodate-lysine-paraformaldehyde
fixative）。

配制见免疫组化常用试剂配制。

二、切片的处理与粘附

免疫组化染色过程较长，洗的次数很多，而且均在振荡洗涤，抗原片附贴不紧，往往在最后的时刻，还没有等显色就会导致前功尽弃，这个环节虽小却会影响大局，因此，为了保证切片成功必须把切片处理好，解除掉片的后顾之忧。

第七节  光镜免疫金银细胞化学

一、免疫金染色

（一）免疫金法（IGS）

1978年，Geoghegan等首次应用免疫金探针检测B淋巴细胞表面抗原，建立了用于光镜水平的免疫金法（immunogold
staining，IGS）。IGS的特点是染色程序简便，不要显色，就能检测细胞表面的抗原，又能检测细胞内抗原。染色时免疫金法一般要求金颗粒的直径大于20纳米（nm），并且用的浓度较高。用IGS定位细胞抗原时一般采用间接法。

下面以人肝组织HBsAg的定位为例说明。

l.IGS的步骤

（1）石蜡切片脱蜡至水。

（2）0.1％胰蛋白酶消化10分钟或3mol/L尿素消化30分钟。

（3）用双蒸水振洗5分钟×2。

（4）用0.02mol/LTBS
pH8.2振洗10    分钟×2。

（5）1％卵蛋白（EA）封闭10分钟。

（6）稀释鼠抗HBsAg单克隆抗体（用0.02mol/LpH8.2 TBS作1:100稀释），4℃过夜。

（7）0.02mol/LTBS
pH8.2振洗10分钟×2。

（8）1% EA封闭10分钟。

（9）0.02mol/LpH8.2的TBS稀释兔抗鼠金标抗体（1:8）37℃ 45分钟。

（10）0.02mol/LpH8.2
TBS振洗10分钟×2。

（11）双蒸水振洗5分钟×2。

（12）1％戊二醛，10分钟。

（13）双蒸水5分钟。

（14）用苏木素衬染核l分钟，甘油封片。

结果：在光镜下可见部分肝细胞浆内有金颗粒聚集呈红色，沿细胞膜分布，表明有HBsAg定位在细胞浆内。

（二）蛋白A金（PAG）放大法

为了得到更明确的染色结果，在用IGS方法定位细胞抗原时可采用搭桥法，使IGS得到放大，这里介绍一种用抗A蛋白抗体作桥的PAG放大法。下面以5-轻色胺定位为例说明这一新方法。

1.PAG的步骤

（1）石蜡切片脱蜡至水。

（2）1%胰蛋白酶消化10分钟，或者3mol/L尿素消化30分钟。

（3）0.05mol/LpH7.4
TBS振洗5分钟×2。

（4）1% EA封闭组织10分钟。

（5）用0.05mol/LpH7.4的TBS稀释兔抗5-羟色胺抗体（1:1 000） 4℃过夜，或者37℃ l小时。

（6）0.05mol/LpH7.4
TBS振洗5分钟×2。

（7）1% EA封闭10分钟。

〖病理学技术〗免疫金银铁技术

（8）用0.05mol/LpH7.4的TBS稀释PAG （1:40），37℃ l小时。

（9）0.05mol/LpH7.4
TBS振洗10分钟×2。

（10）1% EA封闭10分钟。

（11）抗A蛋白抗体（1:100） 37℃ 45分钟。

（12）0.05mol/LpH7.4
TBS振洗10’×2o

（13）加0.05mol/LpH7.4
TBS稀释的PAG（1:40）37℃ 45分钟。

（14）0.
05mol/LpH7.4 TBS振洗10分钟×2。

（15）双蒸水振洗5分钟。

（16）1％戊二醛10分钟。

（17）双蒸水振洗5分钟

（18）0.01％伊文蓝2分钟，甘油封片。

光镜下观察，小肠粘膜内含有嗜银颗粒的细胞胞浆呈红色，阳性颗粒位于细胞核底部，比单纯用PAG染色深度得到加深，阳性结果得到放大。由于抗A蛋白抗体既能通过Fab段又能够通过Fc段与PAG上的A蛋白结合，因此，与其它桥抗体相比它能够在抗原位点处聚集更多的胶体金颗粒。基本原理如图3。

PAG放大法的优点：①使用试剂单一；②可大大提高IGS的敏感性，从而应用IGS方法定位抗原时使用高稀释度的抗体成为可能；③背景干净。可以预见这一新方法将很快受到人们的关注。

二、免疫金银法

1983年，Holgate等人将IGS与银显影方法相结合创立了免疫金银法（immunoglod sliver
stainning，IGSS）。IGSS的基本原理是通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子（Ag+）还原成银原子（Ag0）。被还原的银原子于是围绕金颗粒形成一个“银壳”，“银壳”一旦形成本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使“银壳”越长越大，最终抗原位置得到清楚放大。请参见图4。

（一）石蜡切片的IGSS染色

1.以人HBsAg定位举例说明。

（1）切片常规脱蜡至水。

（2）Lugol（卢戈氏）液，5分钟。

（3）5％硫代硫酸钠水溶液脱碳5分钟。

（4）用双蒸水冲洗干净。

图3 PAG放大法原理

图-4 用银增敏示意图

（5）0.05mol/LpH7.4
TBS洗5分钟×2。

（6）用0.1％胰蛋白酶消化10分钟或用3mol/L尿素消化20分钟。

（7）0.05mol/LpH7.4
TBS洗5分钟×1。

（8）1%卵白蛋白封闭15分钟。

（9）马抗HbsAg抗体1:1 000稀释，37℃ 1~2小时或4℃过夜。

（10）0.05mol/LpH7.4
TBS洗5分钟×2。

（11）1％卵蛋白封闭10分钟。

（12）1:30，PAG（蛋白A-金），37℃45分钟。

（13）0.05mol/LpH7.4
TBS洗5分钟×2。

（14）双蒸水5分钟×2。

（15）物理显影。

（16）双蒸水5分钟×2。

（17）苏木素衬染。

（18）脱水，透明，封固。

结果：光镜下见肝细胞胞浆内有膜状或包涵体形分布的阳性黑色状颗粒，背景干净。

（二）冰冻切片的IGSS染色作冰冻切片的IGSS染色

作冰冻切片的组织，若在动物试验可以先经过固定液灌注或浸泡固定，也可不固定先做冰冻切片。人的组织也可通过浸泡固定或不固定，这主要根据保存抗原性的需要而定。固定过的组织可用20％蔗糖PBS（0.01mol/LpH7.2）浸泡2~4h或切片时用OCT（optimum cutting temperature
compound）包埋，以减少冰冻切片过程中冰晶的形成。如果切片还准备用于电镜包埋，则可经过5%，10%，20％浓度逐级递增的蔗糖溶液。在冰冻切片前，可先入氟里昂22（Freon-22）骤冷，这样可使组织的结构保存更好，适用于电镜观察。

（1）冰冻切片

（2）Lugol液5分钟。

（3）5％硫代硫酸钠水溶液脱碳5分钟。

（4）用双蒸水冲洗干净。

（5）0.05mol/LpH7.4
TBS洗5分钟×2。

（6）用0.1％胰蛋白酶消化10分钟或用3mol/L尿素消化20分钟。

（7）0.05mol/LpH7.4
TBS洗5分钟×1。

（8）1%卵白蛋白封闭15分钟。

（9）马抗HbsAg抗体1:1 000稀释，37℃ 1~2小时或4℃过夜。

（10）0.05mol/LpH7.4
TBS洗5分钟×2。

（11）1％卵蛋白封闭10分钟。

（12）1:30，PAG（蛋白A-金），37℃45分钟。

（13）0.05mol/LpH7.4
TBS洗5分钟×2。

（14）双蒸水5分钟×2。

（15）物理显影。

（16）双蒸水5分钟×2。

（17）苏木素衬染。

（18）脱水，透明，封固。

（三）半薄片的IGSS染色

IGSS染色的半薄切片，可以在光镜下直接观察阳性结果，为电镜取阳性部位及观察打下良好的基础。环氧树脂会妨碍免疫组化染色。经过锇酸处理后固定的组织同样也会影响抗原抗体反应，因此，半薄切片作IGSS染色剂，应用以下处理。

（1）脱环氧树脂，切片以NaOH的无水乙醇饱和溶液浸泡30~60分钟，然后以无水乙醇洗5分钟×2，再以95%，80%，70％酒精各洗5分钟，然后入水。

（2）经锇酸固定过的切片入1％过碳酸10分钟（0.5微米厚，时间可随切片厚薄增减），除去锇酸，然后蒸馏水洗5分钟×4。

（3）切片用0.05mol/LTBS，pH7.4洗10分钟。

（4）Lugol（卢戈氏）液，5分钟。

（5）5％硫代硫酸钠水溶液脱碳5分钟。

（6）用双蒸水冲洗干净。

（7）0.05mol/LpH7.4
TBS洗5分钟×2。

（8）用0.1％胰蛋白酶消化10分钟或用3mol/L尿素消化20分钟。

（9）0.05mol/LpH7.4
TBS洗5分钟×1。

（10）1%卵白蛋白封闭15分钟。

（11）马抗HbsAg抗体1:1 000稀释，37℃ 1~2小时或4℃过夜。

（12）0.05mol/LpH7.4
TBS洗5分钟×2。

（13）1％卵蛋白封闭10分钟。

（14）1:30，PAG（蛋白A-金），37℃45分钟。

（15）0.05mol/LpH7.4
TBS洗5分钟×2。

（16）双蒸水5分钟×2。

（17）物理显影。

（18）双蒸水5分钟×2。

（19）苏木素衬染。

（20）脱水，透明，封固。

三、彩色免疫金银法（CIGSS）

彩色免疫金银法（coloured IGSS，CIGSS）是在IGSS基础上发展起来的一种新方法。其基本原理与彩色显影相似。IGSS方法染色在抗原位点处生成银颗粒经铁氰化钾与淏化钾的作用即被氧化成溴化银，后者与彩色显影剂相接触立即被还原成金属银，而彩色显影剂本身则被氧化，其氧化产物使彩色成色剂由无色变成有色的染料并沉积在银颗粒的部位，金属银变成了银离子。由于染料只能通过彩色显影剂沉积在有银的部位，所以不与组织发生非特异性吸附。

以彩色显影人肝组织内HBsAg的操作过程为例：

（1）脱蜡至水。

（2）0.1％胰蛋白酶37℃ 10分钟。

（3）Lugol碘液5分钟。

（4）5%硫代硫酸钠1分钟。

（5）用0.05mol/LpH7.4
TBS振洗5分钟×2。

（6）1%卵蛋白封闭10分钟。

（7）马抗人的HBsAg
1:1000稀释，37℃ 1~2小时或4℃过夜。

（8）0.05mol/LpH7.4
TBS振洗5分钟×2。

（9）1％卵蛋白封闭10分钟。

（10）PAG
1:40，37℃ 45分钟。

（11）0.05mol/LpH7.4
TBS振洗5分钟×2。

（12）双蒸水洗5分钟×2。

（13）物理显影。

（14）自来水冲洗。

（15）双蒸水振洗5分钟×2。

（16）2％铁氰化钾和1％溴化钾，1分钟。

（17）双蒸水冲洗。

（18）彩色显影（α–萘酚或菲尼酮）2min。

（19）双蒸水冲洗。

（20）2％铁氰化钾和1％溴化钾，1分钟。

（21）2％硫代硫酸钠和1％亚硫酸钠，5分钟。

（22）流水冲洗。

（23）缓冲甘油封固，观察。

结果：CIGSS的优点：①阳性结果比黑色更鲜明；②可以使弱信号得到放大；③消除IGSS背景染色；④信号尺肖景比值高；⑤是开展免疫金银双标技术的新途径。光镜下见HBsAg阳性物质呈鲜艳的蓝色（α–萘酚为成色剂）或呈绿色（菲尼酮为成色剂）。背景干净，阳性结果清楚。

 

四、免疫金及免疫金银技术的优点

免疫金银技术（immunogold-sliver technique）是在免疫金基础上发展的新兴的先进的免疫细胞化学检测技术，它比免疫荧光，免疫酶标技术有许多独特的优点。

（一）制备简单

制备胶体金所需要仪器设备及试剂一般实验室都具备，市场上也容易购置。制备方法简单，易行。

（二）标记简单

抗体、凝集素、酶、SPA、激素等很容易通过物理吸附作用与胶体金颗粒相结合形成稳定的金标复合物。由于在标记过程中不需要经过任何化学方法交联，抗体的生物活性可保持不变，标记过程容易。

（三）适用范围广

胶体金银技术既能用于光镜也能用于透射及扫描电镜，同时还可用于X线能谱分析。在荧光显微镜上添置一块特制的滤板（IGS filterblock）还可直接对胶体金颗粒进行观察，金颗粒在荧光显微镜下呈现明亮的点状物，定位准确，敏感性高，标本可长期保存。

（四）特异性强

免疫金探针的非特异性吸附作用小，较少受生物组织背景因素的影响，在抗原或抗体的检测中显示出高度的特异性。

（五）敏感性高

由于金颗粒的电子密度很大特别适合透射电镜及扫描电镜，因此，免疫金银法用于电镜，其检测抗原或抗体率远远超过酶反应物，从而大大改进了免疫细胞化学技术在电镜水平上的分辨率。光镜下，金颗粒经过银显影后得到放大，用于检测组织抗原时其敏感性比PAP法高200倍。我们检测肝炎表面抗原时比ABC法高6倍，是至今为止最为敏感的免疫细胞化学方法，特别适合于检测石蜡切片标本中的微弱抗原。

应用彩色IGSS和IGSS双标及多标记，可在同一张切片上检测两种以上的抗原成分。胶体金可以制备成不同大小的颗粒，将不同直径的胶体金分别标记不同的抗体或抗原，可以在同一张标本上同时区分出两种或两种以上的抗原或抗体，非常适用于电镜水平的双标和多标记，为研究细胞内抗原及多种抗原的表达及各种抗原分子相互之间的关系等提高了最佳手段。

免疫金银技术是新兴的科学技术，目前许多实验室越来越广泛地采用这一新技术，从而使它的发展有了扎实的基础。用免疫荧光、免疫酶技术、放射免疫技术可做的工作，均可使用免疫金银技术。另外，这一新的方法在其它技术的配合下不断地得到更新与进步，使它能经常增添新的内容，特别是免疫金和胶体金示踪作为一门独特的新技术将在生物医学及其它领域的研究中发挥着越来越大的作用。

 

五、在IGSS染色中常见技术问题和对策

（一）背景染色产生的原因

1.第一抗体或金标抗体稀释度不合适，一般容易犯抗体使用过浓的毛病，认为抗体越浓越好，结果适得其反。应该先作方阵滴定，优选最佳稀释倍数，既可避免非特异染色，又可节省抗体。

2.使用正常血清封闭和在抗体稀释液加入牛血清白蛋白，可以减少非特异吸附，降低背景染色。

3.显色的器皿必须彻底清洗，化学试剂必须用三蒸水配制。

4.乳酸银和硝酸银的显色在避光的环境中反应，醋酸银则可在有光的环境中显色。

5.显色时切片应垂直放置在银显影液中，使过多的银颗粒下沉，如水平放置易沉淀于切片上。

6.控制反应时间，显影液中加入适最的阿拉伯胶或明胶可以延缓反应速度，避免形成过多的还原银，非特异地吸附在切片上。一般加入明胶1～2%，效果比较满意，反应时间根据室温而定，室温25℃左右显色时间10~15分钟，室温在20℃以下，显色时间20~30分钟左右。

7.洗涤：使用TBS时最好加入0.05~0.1％的Triton X-100或Tween 80，可以洗脱掉组织表面发生非特异性吸附的污染蛋白质，防止出现背景的非特异染色。

（二）背景染色已发生应如何消除

l.2％硫代硫酸钠，1％铁氰化钾对半混合，加在切片上至背景无色为止。

2.2％铁氝化钾，1％溴化钾混合作用1分钟水冲洗，然后加上2％硫代硫酸钠和1％亚硫酸钠脱色，至背景干净为止。

3.0.1％重恪酸钾加入0.25％浓硫酸，存显微镜下控制脱色时间，至阳性结果清楚，无背景为止。然后用5％硫代硫酸钠漂白。注意时间不要过长，以免阳性结果被脱掉。

4.用0.3～1％H2O2处理切片也可消除背景的银颗粒。但必须在显微镜下控制脱色时间，防止把阳性结果脱掉。

（三）彩色显影背景过染的处理方法

彩色免疫金银法，在胶体金技术中是一个很大的突破，它的优点是结果鲜明，对比度好，但是在彩色显影过程中时间过长，背景可有一些着色，彩色显影的时间控制很重要。一旦过染可用下列方法处理。

1.纯酒精滴到切片上3~5秒，立即冲掉，水洗，充分地把酒精洗掉，如果洗不彻底，造成阳性结果脱色。 

2.75％的酒精滴到切片上1分钟，立即冲掉，脱色不能时间过长，过长后阳性结果全部脱掉。

 

六、物理显影液及缓冲液的配制

（一）缓冲液的配制

1.0.05mol/LpH7.4的TBS配制

Tris（三羟甲基氨基甲烷） 12.l克

NaCl（氯化钠）17.5克

加双蒸水 1900毫升

然后用浓HCl（盐酸）调至pH为7.4再加双蒸水至2000毫升。

（2）0.02mol/LpH8.2
TBS配制

Tris（三羟甲基氨基甲烷）4.84克

NaCl（氯化钠）17.5克

BSA（小牛血清）  2.0克

NaN3（叠氮化钠，三氮化钠）1.0克

双蒸水1 900毫升

充分搅拌至溶质完全溶解，用浓HCl（盐酸）调pH至8.2，再加双蒸水至2000毫升。

（二）银显影液的配制

1.乳酸银显影液的配制

（1）10％阿拉伯胶水溶液60毫升。

（2）柠檬酸缓冲液（pH3.5）10毫升。

对苯二酚l克，加双蒸水20毫升溶解。

乳酸银水溶液100毫克加水10毫升。注意在暗处显影。

2.硝酸银显影液的配制

（1）10％阿拉伯胶水溶液60毫升。柠檬酸缓冲液（pH3.5）10毫升。

（2）对苯二酚1.7克水溶液30毫升。

（3）硝酸银40毫克水溶液2毫升。

（1）、（2）两液完全溶解，临用前加入硝酸银溶液。在暗处显影。

3.硝酸银显影液的配制

（1）双蒸水60毫升。柠檬酸缓冲液（pH3.5）10毫升。

（2）对苯二酚1.0克水溶液30毫升。

（3）硝酸银35毫克水溶液2毫升。

（1）、（2）两溶液完全溶解，临用前加入硝酸银溶液。在暗处显影。

4.彩色显影液的配制

（1）0.2N氢氧化钠异丙醇溶液5毫升溶入α–萘酚（或菲尼酮）100毫克。

（2）碳酸钠500毫克，溴化钾25毫克，亚硫酸钠50毫克，加双蒸水25毫升。

（1）、（2）两液1:10混合，室温下彩色显影。

5.醋酸银显影液

（1）15％阿拉伯胶60毫升，柠檬酸缓冲液（pH3.5）10毫升。

（2）对苯二酚1.7克溶于蒸馏水20毫升中。

（3）醋酸银100毫克溶于蒸馏水10毫升中。

用前（1）、（2）、（3）依次混合，不需要避光，在室温下显影。

（三）柠檬酸缓冲液的配制

柠檬酸（C6H8O7·H2O） 25.5克

柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）23.5克

加双蒸水100毫升溶解即成，pH3.5。

（四）氢氧化钠（NaOH）无水乙醇饱和溶液的配制

氢氧化钠8克，加入无水乙醇100毫升振摇溶解即成。

 

第八节  免疫胶体铁细胞化学

胶体铁（ferriccolloid）是–种阳离子胶体，可通过普鲁士蓝反应呈色，其颗粒有一定的大小及电子密度，最初被用于光镜及电镜下定位组织中的阴离子部位（Hale，1946，Seno等，1983;Murakami等，1986）。1989年日本学者Seno等在抗体分子上标记了胶体铁，将胶体铁引入免疫细胞化学技术（Seno等，1989）。杨守京等在胶体铁的制备方法及其标记物的纯化等方面做了改进，成功地用于流行性出血热病毒抗原的检测。该方法具有较高的特异性与敏感性，背景染色干净。

一、胶体铁的制备方法

早期制备的胶体铁作为阳离子胶体是用于检查组织中阴离子的定位，其制备主要是通过三氯化铁（FeCl3）的煮沸完成的，如有：①FeCl3直接煮沸法（Hale，1946）;②FeCl3溶于甘氨酸和氨水的混合液中（Rinehart，1951）;③FeC13倒入煮沸的二甲胂酸钠溶液中（Seno等，1983）或FeC13与二甲胂酸溶液一起煮沸（Seno等，1985）。其后，制备方法不断改进，1986年Murakami等用水合联胺－二甲胂酸-FeCl3煮沸法制备出微细颗粒胶体铁（fine-granularcationicironcolloid），胶体颗粒小（0.5~1纳米），从而使其稳定性及穿透能力大大增加（Murakami等，1986）。用二甲胂酸代替二甲胂酸钠也可以获得同样胶体，具体步骤如下：

在0.1mol/L二甲胂酸钠溶液60毫升中依次加入

12.lmol/LHCI 0.5毫升，水合联胺0.6毫升，0.1mol/LFeCl3毫升，将混合物加热煮沸至变成深棕红色为胶体胂酸铁。室温冷却后，再以二倍于原体积的0.1mol/L pH7.4的二甲胂酸钠缓冲液（cacody­ late sodiumbuffer pH7.4，CB）稀释，即可进行抗体标记。

该方法制备的铁胶体呈深棕红色，颗粒大小1纳米（nm）左右，在pH4~8范围内稳定，4℃可存放一个月以上，室温存放半个月，阴离子定位分布同Murakami等的胶体铁，与IR-COO有较强的亲和力，但不与HR-NH+结合。

二、抗体的标记和纯化

胶体铁的等电点为7.8至7.9，在pH7.4时通过离子键能与抗体IgG（PI 6.8-7.3）结合而不影响抗体活性，在此条件下，Seno对Hale胶体铁进行了抗体标记，并成功用于免疫细胞化学染色（Seno等，1989）。抗体标记时，用0.1mol/L碳酸钾将胶体的pH调至7.4，按每毫升胶体0.2~1毫克的蛋白星，将IgG电磁搅拌下逐滴加入到胶体中，搅拌5分钟后，通过CB平衡的Amber light CG-50层析柱，CB洗脱纯化。作者在胶体铁的制备方法进行了改进，吸收了Mruakami等胶体的优点，所制备的胶体铁，颗粒小，稳定性高，其pH值近中性，标记效果好，厘米-Sephadex C-50 （Pharmacia）可取代Amberlight CG-50用于纯化标记抗体。


三、胶体铁标记抗体的鉴定

用免疫斑点法或免疫细胞化学染色等方法可鉴定抗体的标记效果。

（一）免疫斑点法

在处理好的硝酸纤维素膜上分别滴加100~10-7矿系列稀释的抗原，斑点直径0.25厘米，空气中干燥，80℃多聚甲醛蒸气固定1小时，然后分别以胶体铁标记的抗体一步法或用桥抗联接胶体标记物的间接法染色，普鲁士蓝呈色观察。一步法所能检测到的抗原质量为10-2~10-3微克，间接法敏感性至少增加10倍（10-3-10-4微克）。

（二）免疫细胞化学染色法

步骤同下，方法敏感性同免疫金银法（IGSS），优点是背景干净。

 

四、免疫胶体铁细胞化学染色

（l）组织切片脱蜡入水，0.01mol/L pH7.4 PBS洗；

（2）用4％正常羊血清封闭组织37℃，30分钟;

（3）分别以第一抗体孵育组织，4℃ 24小时，PBS振洗10分钟×3;

（4）用胶体铁标记的第二抗体37℃孵育30分钟或用桥抗联接胶体铁标记物；

（5）蒸馏水洗；

（6）以1％的亚铁氰化钾与1％盐酸混合液显色20分钟;

（7）自来水洗；

（8）核固红染核，脱水、透明、封片。

以该方法染色，阳性为蓝色，胞核为红色。

 

五、方法的应用

胶体铁的呈色产物亚铁氧化铁是一络合物（解离常数1×10-35），一旦形成，难以再与其它化学物质发生反应。蓝色的亚铁氮化铁与棕色的DAB产物及黑色的银颗粒颜色对比明显，因此可结合免疫酶及IGSS法可进行光镜下抗原的双标及多标记。胶体铁（颗粒1纳米）标记抗体直径比常用胶体金（5~40纳米）及铁蛋白标记抗体（12纳米）小，因而对固定组织具有更好的穿透力，可用于抗原的超微结构定位，尤其是免疫电镜的包埋前染色。结合免疫酶及不同大小胶体金标记抗体，还可用于抗原的双标记及多标记。

非特异性背景色是免疫组织过程中经常遇到的问题。组织中的内源性过氧化酶活性及色素常会干扰免疫过氧化酶染色；而胶体金非特异性吸附组织是构成IGSS背景染色的主要原因。胶体铁与抗体结合呈电中性后，很少再与组织发生吸附，并且其染色不受内源酶活性的干扰。普鲁士蓝反应只显示标记的三价铁，不能显示组织中内源性二价铁（除外含铁血黄素，但可通过连续切片H·E染色对照排除），因而背景干净。另外免疫斑点试验和组织染色结果表明，免疫胶体铁间接法敏感性与IGSS基本相同但高于ABC染色，从上述两方面看，该方法要优于免疫酶及免疫金银染色。